Name: Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Leer de analyse van zuurstofverbruik in neonatale muiscardiomycyten met behulp van een extracellulaire flux-analyzer. Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het beoordelen van mitochondriale functie en metabole gezondheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken alle Ross lab en Murphy lab leden. Dit werk wordt ondersteund door de American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) en VA verdienste (BX003260) aan R.S.R.

Voor werk met neonatale muizen, verwijzen naar lokale universiteit/Instituut richtsnoeren set weer door de dierenverzorgers programma's en zich houden aan iemands institutionele en andere verordeningen. Alle methoden die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de UC San Diego institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en voldoen aan de federale en nationale regelgeving.
1. bereiding van reagentia
<ol><li>Bereiden van 25 mL pre vergisting oplossing: HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +) aangevuld met trypsine (0,5 mg/mL). De oplossing om met een 0,22 µm filter steriliseren en houd op ijs tot gebruik. Pre vergisting oplossing maken op de dag van het experiment. Opmerking: Het is essentieel voor het gebruiken van HBSS zonder Ca2 + en Mg2 +, als Ca2 + en Mg2 + myocyte contractie en latere celdood tijdens isolatie zal veroorzaken.</li>
	<li>Bereiden van 30 mL collagenase spijsvertering buffer: collagenase (0,8 mg/mL, ongeveer 350 U/mL) opgelost in HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +) buffer. De oplossing om met een 0,22 µm filter steriliseren en houd op ijs tot gebruik. Maak collagenase spijsvertering oplossing op de dag van het experiment.</li>
	<li>500 mL cardiomyocyte voedingsbodems (groei media)bereiden: Meng 375 mL DMEM, 125 mL M-199, 25 mL serum van paard en 12,5 mL FBS. Te vullen met 1% penicilline en streptomycine 1%-oplossing.</li>
	<li>Mitochondriale stress testmediumbereiden: Maak 200 mL van DMEM gebaseerd stress testmedium (DMEM zonder NaHCO3, Zie Tabel van materialen) aangevuld met natrium pyruvaat van 1 mM, 2 mM L-glutamine, en 10 mM glucose en 2 mM Hepes. Opmerking: 1 L medium met DMEM zonder natrium pyruvaat, L-glutamine, glucose en Hepes, filer steriele, maken en opslaan in 4 ° C. Bereid het testmedium van stress op de dag van de bepaling door de toevoeging van andere reagentia. Met behulp van DMEM is medium zonder NaHCO3 van cruciaal belang.</li>
	<li>Breng de pH van mitochondriale stresstest media aan 7.4 op de dag van gebruik. Warme media tot 37 ° C vóór gebruik.</li>
	<li>Oligomycinbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.</li>
	<li>FCCPbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.</li>
	<li>Antimycin Abereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.</li>
	<li>Rotenonbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C. Opmerking: Alle reagentia en oplossingen gebruikt in dit protocol zijn vermeld in tabel 1.</li>
</ol>2. oogsten en pre vergisting van harten van neonatale muizen (dag 1)
<ol><li>Autoclaaf schaar, pincet en een Moria lepel te steriliseren.</li>
	<li>Voer alle stappen in de cel cultuur kap voor steriliteit.</li>
	<li>Aliquot 5 mL HBSS (zonder Ca2 +, Mg2 +) aan elk putje van de plaat van een 6-well cel cultuur; plaats op het ijs. Aliquot 10 mL HBSS in een 10 cm schotel voor de cultuur van de cel.</li>
	<li>Bereiden 20 mL trypsine pre vergisting oplossing in een 50 mL steriele conische buis. Houd alle oplossingen op het ijs.</li>
	<li>Snel duik pasgeborene (dag 0) muizen in 70% ethanol oplossing voor sterilisatie.</li>
	<li>Decapitate pups met behulp van steriele schaar (recht) zonder verdoving, en open vervolgens de borst langs het borstbeen toegang te verlenen tot de borstholte en het hart. (Figuur 1A) Opmerking: 1) is het essentieel te gebruiken P0 neonatale muizen om de levensvatbaarheid van de hoge cellen. 2) deze methode euthanasie is toegestaan voor pasgeborenen overeenkomstig NIH en Amerikaanse veterinaire medische vereniging richtsnoeren 17.</li>
	<li>Harten uittreksel uit het lichaam met een goede schaar en overdracht onmiddellijk in de steriele cel cultuur schotel met HBSS (zonder Ca2 +, Mg2 +) (figuur 1B).</li>
	<li>Verwijder eventuele resterende longweefsel, grotere schepen, etc. (en atria, indien gewenst). Wassen harten in de HBSS oplossing met behulp van zachte agitatie.</li>
	<li>Elk hart met een fijne schaar in 8 stukken gesneden en breng het alle hartweefsel met een tang in een putje van een 6-well cel cultuur plaat met HBSS (Figuur 1 c en 1 D).</li>
	<li>Het wassen van het hart door de overdracht van de harten van goed tot goed in de 6-well plaat gevuld met HBSS, met behulp van een lepel Moria (Figuur 1 d). Opmerking: Overdracht van de harten van goed tot goed is genoeg om het bloed wassen. Aangezien bloed met enzymatische spijsvertering interfereert is het belangrijk te wassen de harten met HBSS en verwijderen van bloed.</li>
	<li>Pipetteer van het hart met een lepel Moria in een conische buis met 20 mL trypsine (0,5 mg/mL) en incubeer met zachte agitatie bij 4° C voor 4 h (figuur 1E).</li>
</ol>3. het opstellen van een cultuur van de 96-wells-plaat (dag 1)
<ol><li>Bereiden van 5 mL van de oplossing van de coating: PBS met 0,5% gelatine (autoclaaf vóór gebruik) en 1% fibronectine oplossing. (bijv. 5 mL gelatine oplossing plus 50 µL van fibronectine oplossing)</li>
	<li>Aliquot 50 µL van coating oplossing in elk putje van de 96-Wells cel cultuur plaat (Zie Tabel van materialen). Als bubbels aanwezig zijn, kunt u ze verwijderen met behulp van een pipet 20 µL te bellen uit te zuigen. Opmerking: Het is belangrijk ter dekking van de oppervlakte van elk putje met coating oplossing.</li>
	<li>Incubeer de plaat in een 37 ° C cel cultuur incubator voor 1 uur of meer te laten drogen van de coating van de matrix.</li>
	<li>Elke resterende coating oplossing vóór het zaaien van cardiomyocytes gecombineerd.</li>
</ol>4. enzymatische spijsvertering en beplating van cellen (dag 1)
<ol><li>Vooraf warm collagenase spijsvertering oplossing in een waterbad 37 ° C. Opmerking: Dit is stap is belangrijk voor het bereiken van efficiënte enzymatische spijsvertering.</li>
	<li>Verplaats de conische buis met harten en pre vergisting oplossing van 4 ° C voor een cel cultuur kap. (Figuur 1F)</li>
	<li>Laat de harten zinken naar de bodem van de buis en de pre vergisting oplossing verwijderen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL (1 tot 2 mL van het medium van de isolatie kan blijven in de buis).</li>
	<li>Voeg 10 mL van HBSS in de buis. Resuspendeer de harten met HBSS 2 - 3 keer te wassen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL trypsine. HBSS gecombineerd (1 tot 2 mL kan blijven in de buis).</li>
	<li>Voeg 10 mL van voorverwarmde collagenase spijsvertering oplossing in de buis met hart. (Figuur 1G)</li>
	<li>Incubeer de buis met hart in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten zonder agitatie (1ste spijsvertering).</li>
	<li>Na 1e spijsvertering, door de buis naar de cel cultuur kap te verplaatsen. Zachtjes triturate harten door opnieuw de schorsing van het hart in de buis zachtjes 10 keer met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Hierdoor zal harten te verspreiden en cellen die moeten worden vrijgesteld van hartweefsel. (Figuur 1 H) Opmerking: Aangezien cardiomyocytes kwetsbaar zijn, is zachte verpulvering belangrijk om te bereiken hoog levensvatbaarheid.</li>
	<li>Laat het onverteerd weefsel zinken, breng verteerd oplossing verrijkt in cardiomyocytes (ongeveer 9-10 mL) aan een nieuwe conische buis en onmiddellijk toevoegen een gelijke hoeveelheid van cel cultuur media om te stoppen met de vertering van collagenase.</li>
	<li>Voeg 10 mL van collagenase spijsvertering oplossing in de buis met de resterende onverteerd hartweefsel.</li>
	<li>Incubeer de buis met hartweefsel van het in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten (2de spijsvertering).</li>
	<li>Herhaal de procedure 4.7 en 4.8. Opmerking: Als er nog steeds veel onverteerd weefsel, spijsvertering nog een keer herhalen In de meeste gevallen zijn twee spijsvertering echter genoeg om te dispergeren allermeest naar de cellen van het hartweefsel.</li>
	<li>Plaats een steriele cel-zeef (100 µm nylon gaas) in een nieuwe steriele 50 mL conische buis. Vooraf nat de cel zeef met 2-3 mL cel cultuurmedia en doorgeven van cellen door de cel-zeef. Spoel de cel-zeef met 2-3 mL cel voedingsbodems. (Figuur 1I)</li>
	<li>Centrifugeer conische buis met cardiomyocytes gedurende 5 min. op 180 x g (figuur 1J). Gecombineerd het supernatant (Figuur 1 K), die zal bevatten cel weefsel puin en resuspendeer de pellet cel in cel voedingsbodems (Figuur 1 L) 10 mL.</li>
	<li>Zachtjes resuspendeer de cellen en de plaat cellen op een 10 cm cel cultuur schotel (kunststof zonder enige vorm van coating) en incubeer gedurende 1 uur in een cel cultuur incubator (1e pre beplating) (Figuur 1 M). Deze pre plating stap staat niet-cardiomyocytes, zoals fibroblasten en endotheliale cellen, zich te houden aan de schotel niet gestreken cel-cultuur. Opmerking: Op dit punt cardiomyocytes zijn doorgaans een ronde vorm en verschijnen glanzende onder de Microscoop. (Figuur 1N).</li>
	<li>Na de incubatie 1 h zachtjes doorroeren van de plaat, niet-aanhanger cellen (verrijkt in cardiomyocytes) uit de 10 cm cultuur schotel wassen en resuspendeer de cellen door herhaaldelijk pipetteren het kweekmedium cel over de schotel met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Vervolgens breng niet-aanhanger cellen (verrijkt in cardiomyocytes) in een nieuwe 10 cm cel cultuur schotel (kunststof zonder enige coating) en incubeer gedurende een extra 1 uur in een cel cultuur incubator (2e pre beplating). Opmerking: Cellen die aan de niet-gecoate plaat hechten zijn dominant niet-cardiomyocytes: fibroblasten en endotheliale cellen, die onder een microscoop (figuur 1O) kunnen worden gevisualiseerd.</li>
	<li>Na 2e pre beplating, zachtjes doorroeren van de plaat, wassen niet-aanhanger cellen (cardiomyocytes) uit de 10 cm cultuur schotel en breng de cardiomyocytes in een nieuwe conische tube van 50 mL.</li>
</ol>5. tellen cellen en Plating cellen in een cel van de 96-Wells cultuur plaat (dag 1)
<ol><li>Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.</li>
	<li>Plaat van de cellen in een extracellulaire matrix gecoat 96-Wells cel cultuur plaat duikt met een dichtheid tussen 10-30 x 103 cellen per putje met behulp van een pipet meerkanaals in een eindvolume van 200 µL (Figuur 1 P). Wells A1, A12, H1 en H12 gebruiken voor achtergrond: 200 µL cultuurmedium toevoegen als andere putten in deze putten (geen cellen). Incubeer de plaat in een 37 ° C incubator voor de cultuur van de cel. Opmerking: In deze studie, werd zuurstofverbruik getest met behulp van verschillende cel dichtheden zoals 10 x 10320 x 10-3en 30 x 103 cellen per putje. (Figuur 2A). Ook, zoals hierboven, cardiomyocytes onmiddellijk na isolatie zijn doorgaans een ronde vorm en verschijnen glanzende onder de Microscoop. Levensvatbare cellen zal afvlakken uit binnen 16-24 uur van cultuur.</li>
</ol>6. zuurstof verbruik Assay met behulp van een 96-goed-formaat extracellulaire Flux Analyzer (dag 2)
Opmerking: Zuurstof verbruik bepaling kan worden uitgevoerd in één dag na de cellen plating of hoger. Neonatale cardiomyocytes gekweekt met behulp van dit protocol tot 7 dagen kan overleven post isolatie.
<ol><li>Hydrateer een flux analyzer sensor cartridge (Zie Tabel van materialen) gedurende ten minste 3 uur, maar ideaal voor een volledige dag, voor de bepaling. Voeg 200 µL van kalibrant oplossing (Zie Tabel van materialen) in de elk putje van de plaat utility, zet de sensor cartridge terug op het bord van nut, en broeden in een incubator 37 ° C zonder CO2 of O2 suppletie.</li>
	<li>Wijzigen in cel voedingsbodems mitochondriën stresstest gemiddeld één uur voorafgaand aan de test. Cardiomyocytes zijn kwetsbaar. Daarom voorzichtig de voedingsbodems cel verwijderen door met behulp van een precisiepipet multi-kanaals en wassen van de cellen met 200 µL voorverwarmde mitochondriale stresstest media tweemaal. Na tweede wash, voeg 175 µL voorverwarmde mitochondriën stress test media en cultuur van de cellen in een incubator 37 ° C zonder CO2 of O2 suppletie.</li>
	<li>Geconcentreerde test verbindingen voor te bereiden. Voorbereiden voor stresstest mitochondriën, 3,0 mL elke 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP en een mengsel van 20 µM rotenon en 20 µM antimycin A, alle in mitochondriale stress testmedium. Opmerking: Elke verbinding in de concentratie beschreven is getest. Titrating van de concentratie van elke stof in iemands eigen laboratorium is echter noodzakelijk.</li>
	<li>25 µL van elke stof in de havens van de injector van de patroon van de sensor met een meerkanaalspipet (figuur 1T) laden. Het volume en de eindconcentratie worden beschreven in tabel 2.</li>
	<li>Extracellulaire flux assay protocol instellen. Het programma wordt beschreven tabel 3.
</li>
	<li>Start het programma. Eerst, zet de sensor-cartridge in de machine voor kalibratie (figuur 1R). Vervang de kalibrant voor de plaat assay zodra de kalibratie stap is gedaan. Opmerking: Met behulp van de software die wordt geleverd door fabrikant, geven groepen van putten en elke compound en poort.</li>
	<li>Indien gewenst, na de assay, zorgvuldig negeren alle assay medium door met behulp van een precisiepipet meerkanaals en opslaan van de cel cultuur microplate bij-20 ° C voor toekomstige cel normalisatie met behulp van eiwit bepaling.</li>
	<li>Gehalte aan andere melkeiwitten meten. Voeg 50 µL van RIPA cellysis van de standaardoplossing (Zie Tabel van materialen). Incubeer de plaat op het ijs gedurende 30 minuten volledig lyse cellen. Alle materiaal overbrengen in een nieuwe duidelijk platte 96 goed assay bodemplaat.</li>
	<li>Meten eiwitconcentratie door BCA assay volgens protocol van de fabrikant. Opmerking: De put met de extracellulaire matrix coating resulteert in een eiwitrijk-concentratie in elk putje. Daarom afgetrokken het bedrag van de well(s) (geen cellen) van de achtergrond te krijgen van de werkelijke cel eiwitconcentratie. De eiwitconcentratie afgeleid van cellen is laag in een cultuur van de 96-wells-plaat. Bovendien kan de eiwitconcentratie variëren van goed-te-goed als gevolg van de extracellulaire matrix coating. Daarom is met behulp van mobiele nummer te normaliseren van de OCR aanbevolen.</li>
</ol>

<ol><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li>
<li>Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction%2C+growth%2C+and+survival+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li>
<li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116(2015).</li>
<li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+College+Cardiololgy%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li>
<li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).</li>
<li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document%3A+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li>
<li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recounting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li>
<li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vissualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li>
<li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+basal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li>
<li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).</li>
<li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li>
<li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013).</li>
<li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li>
<li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells%3A+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li>
<li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+protein+1+%28Drp1%29-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li>
<li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li>
<li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart%2Fmuscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li>
<li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li>
<li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+extracellular+flux+%28XF%29+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li>
<li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li>
<li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+in+cardiomyopathy%3A+every+substrate+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li>
<li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In deze studie hebben we een eenvoudig protocol om te isoleren en kweken van muis neonatale cardiomyocytes opgericht. Met behulp van deze cardiomyocytes, we ook de voorwaarden voor het meten van zuurstof verbruik tarief met behulp van een systeem van extracellulaire flux analyzer geoptimaliseerd. Het protocol maakt het mogelijk om het gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe verschillende factoren zuurstofverbruik in de belangrijkste werkende cellen van het hart, verwant aan wa...

Om een continue contractiele hartfunctie, moeten cardiomyocytes behouden een constante aanvoer van cellulaire energie voornamelijk in de vorm van ATP1. In het hart, wordt ongeveer 95% van ATP gegenereerd door mitochondriën, voornamelijk door middel van oxidatieve fosforylatie, waaruit blijkt dat de mitochondria een sleutelrol in de bio-energetische in hartfunctie2,3 spelen. Het ondersteunen van dit begrip is dat disregulatie van mitochondriale functie kan leiden tot cardiomyopathie en hartfalen4,5. Omgekeerd, herstel van mitochondriale functie is aangetoond dat verbetering van de hartfunctie van het falende hart6,7. Daarom, bestuderen van het mechanisme van de mitochondriale Bioenergetica en het identificeren van nieuwe toezichthouders van mitochondriale functie in cardiomyocytes mechanistische inzichten van cardiale energieproductie alleen niet zal onthullen maar ook kunnen inzicht geven die zal leiden aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten6,8.
Vergeleken met het hele hart, waarin een mengsel van myocytes en niet-myocytes9, cardiomyocyte culturen zijn uiterst zuiver, met minimale besmetting van niet-myocytes vanuit het hart, zoals fibroblasten en endotheliale cellen10. Bovendien, isoleren van cardiomyocytes van neonatale pups kan kweken een groot aantal cellen in een kleine hoeveelheid tijd, in vergelijking met isolerende cellen van volwassen harten10,11. Bovenal primaire gekweekte volwassen muis cardiomyocytes hebben korte overleving tijden (bijv. 24 uur) en bij langere tijd punten-onderscheid maken. Neonatale muis cardiomyocytes kunnen overleven en voor meer dan 7 dagen in de cultuur, waardoor ze ideaal zijn voor het testen van de effecten van de drug compounds en genetische manipulatie op de functie van mitochondriën in cardiomyocytes10worden gemanipuleerd. Natuurlijk, er zijn aanzienlijke biologische verschillen tussen de volwassen en neonatale cellen, maar de langere duur die beschikbaar zijn voor cultuur van neonatale cellen maakt ze geschikt voor vele verschillende types van studies, met inbegrip van die van mitochondriale functie.
Tot op heden, zijn primaire gekweekte neonatale muis en rat cardiomyocytes gebruikt als modellen om te studeren cardiale Bioenergetica12,13. In de afgelopen jaren gebruikt studies een extracellulaire flux analyzer meten van zuurstof verbruik tarief (OCR) en evalueren van oxidatieve capaciteit in muis en rat neonatale cardiomyocytes14,15. Terwijl in vergelijking met ratten, de levensvatbaarheid van de cellen van de neonatale cardiomyocytes muis is lager en heeft grotere variabiliteit16. De mogelijkheid te bestuderen van cellen uit genetisch gemodificeerde Muismodellen maakt de mobiele muismodel ook, heel belangrijk. Gezien het feit dat OCR studies zo gevoelig zijn voor cel nummer en dichtheid te zaaien, is de ontwikkeling van een protocol reproduceerbaar, betrouwbare en eenvoudig te bereiken consistente cel opbrengst en levensvatbaarheid nodig.
Wij rapporteren hier een geoptimaliseerde protocol dat is ontwikkeld die gebruik maakt van de neonatale cardiomyocytes gekweekte muis samen met een 96-goed-formaat extracellulaire flux analyzer voor OCR analyse. Dit protocol verhoogt de reproduceerbaarheid van de test. Bovendien, het protocol biedt niet alleen een roman en reproduceerbare methode voor de analyse van de OCR, maar ook tot een grotere grootte cultuur zou kunnen worden aangepast voor andere experimentele doeleinden, zoals die die wellicht nodig zijn om te studeren van myofibrillar functies en intracellulaire Signaalroutes.
Met name beschrijft dit protocol een eendaagse procedure voor isolatie en cultuur van neonatale muis cardiomyocytes in een 96-Wells cel cultuur plaat. Bovendien, het wordt de procedure beschreven voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van een extracellulaire flux-analyzer. Alle oplossingen gebruikt worden steriel of steriele gefilterd. Alle tools zijn gesteriliseerd door 75% ethanol. Wij bieden een Tabel van materialen voor diverse onderdelen van de procedure. Voor het kweken van cardiomyocytes, worden alle procedures en stappen uitgevoerd in een standaard cel cultuur kap. Dit protocol is ontwikkeld voor de isolatie van neonatale muis harten uit één nest (ongeveer 8-10 pups). Het protocol kan echter ook worden aangepast voor het isoleren van cardiomyocytes uit meerdere nesten.

<table><tbody><tr><td>Antimycine A</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td><td>Remt complex III van de mitochondriën</td></tr><tr><td>Cel zeef 100 &mu;m poriën</td><td>FALCON</td><td>352360</td><td>Om onverteerd weefsel op te vangen</td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Om collagenase-verteringsoplossing te maken</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SIGMA</td><td>75351</td><td>Om mitochondriale stresstestmedium te maken</td></tr><tr><td>DMEM met hoge glucose</td><td>Life technologies</td><td>11965-092</td><td>Om celkweekmedium te maken</td></tr><tr><td>DMEM zonder NaHCO3, Glucose, pyruvaat, glumanine en Hepes</td><td>SIGMA</td><td>D5030-10X1L</td><td>Om mitochondriale stresstestmedium te maken</td></tr><tr><td>FCCP (Carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazon)</td><td>SIGMA</td><td>C2920</td><td>Ontkoppelt mitochondriale ademhaling</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>26140-079</td><td>Om celkweekmedium te maken</td></tr><tr><td>Fibronectine uit runderplasma</td><td>SIGMA</td><td>F1141-5MG</td><td>Om coatingoplossing voor weefselkweekplaten te maken</td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>14060-10</td><td>Voor dissectie van harten</td></tr><tr><td>Gelatine uit varkenshuid</td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>Om coatingoplossing voor weefselkweekplaten te maken</td></tr><tr><td>HBSS (Hanks' balanced salt solution, zonder Ca2+, Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>Om harten te wassen en oplossing voor pre-vertering en collagenase-vertering te maken</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Fisher scientific</td><td>15630080</td><td>Om mitochondriale stresstestmedium te maken</td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Life technologies</td><td>26050-088</td><td>Om celkweekmedium te maken</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>SIGMA</td><td>G-3126</td><td>Om mitochondriale stresstestmedium te maken</td></tr><tr><td>M-199</td><td>Cellgro</td><td>10-060-CV</td><td>Om celkweekmedium te maken</td></tr><tr><td>Moria lepel</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9190356</td><td>Om harten te wassen</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>SIGMA</td><td>75351-5MG</td><td>Remt mitochondriale ATP-synthase</td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Fisher scientific</td><td>89900</td><td>Om de cellen te lyseren voor eiwitanalyse</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Remt complex I van de mitochondriën</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Extracellulaire Flux Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Apparaat gebruikt om de zuurstofconsumptiesnelheid te analyseren</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>Pakket met fluxanalysator kweekplaten, sensorcartridges en calibratiemiddel</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>Om mitochondriale stresstestmedium te maken</td></tr><tr><td>Rechte schaar</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>91401-12</td><td>Voor dissectie van harten</td></tr><tr><td>Spuitfilter 0,2 &mu;m grootte</td><td></td><td></td><td>Voor steriele filtratie van verdunningsmedium</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>USB Corporation</td><td>22715 25GM</td><td>Om oplossing voor pre-vertering te maken</td></tr></tbody></table>

analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Mitochondriën en oxidatieve metabolisme zijn kritisch voor de handhaving van de functie van de hartspier. Onderzoek heeft aangetoond dat mitochondriale dysfunctie is een belangrijke factor die bijdraagt aan verminderde hartfunctie bij hartfalen gevonden. Daarentegen, kan herstel van defecte mitochondriale functie hebben gunstige effecten ter verbetering van de hartfunctie in het falende hart. Dus, de regulerende mechanismen te bestuderen en het identificeren van nieuwe regelgevende instanties voor mitochondriale functie kunnen inzicht geven die kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten. Hier, wordt cardiale myocyte mitochondriale ademhaling geanalyseerd met behulp van een unieke celcultuur. Ten eerste, een protocol is geoptimaliseerd om snel isoleren en hoge levensvatbaarheid neonatale muis cardiomyocytes cultuur. Vervolgens wordt een 96-Wells-indeling extracellulaire flux analyzer gebruikt ter beoordeling van de zuurstof verbruik tarief van deze cardiomyocytes. Voor dit protocol, we geoptimaliseerd zaaien voorwaarden en aangetoond dat pasgeborenen muis cardiomyocytes zuurstof verbruik tarief kan gemakkelijk worden beoordeeld in een extracellulaire flux-analysator. Tot slot, wij stellen vast dat ons protocol kan worden toegepast op een groter formaat van de cultuur en andere studies, zoals de intracellulaire signalering en contractiele functie analyse.

Met behulp van het protocol beschreven, werden harten geïsoleerd van de neonatale pups dag 0. 5 x 105 cellen/pup zijn verkregen, en cardiomyocytes waren agarvoedingsbodem op dichtheid van 10 x 10,3, 20 x 103of 30 x 103 cellen/well, in 96 goed platen (figuur 2A). Na overnachting cultuur, cardiomyocytes bleken goed verbonden met het plastic gecoate oppervlak en er waren weinig niet-vastgemaakte cellen (de niet-vastgem...

Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Dit protocol stelt ons in staat om te isoleren en cultuur hoge bi-BBT, alleen bekend om de muis cardiomyocyten. Om de mitochondriale functie te evalueren, kan het zuurstofverbruik van cardiomyocyten worden geanalyseerd door een echte zilverfluxanalyzer. Een van de voordelen van deze techniek is dat het zuurstofverbruik van cardiomyocyten gemakkelijk kan worden gemeten in hun aanhangende toestand in 96-well formaat, waardoor het testen van meerdere omstandigheden met een groot aantal replicaties mogelijk is.Dit vat geeft belangrijke inzichten in het onderzoeksgebied van cardiologie. Naast het zuurstofverbruik kunnen we ook andere metabole parameters bestuderen, zoals grijsgrices en uitgezuurde epoxidatie. Het bereiken van een hoge variabiliteit van cardiomyocyten is van cruciaal belang voor dit experiment.Dit vereist een efficiënte vertering van harten. Aangezien neonatale cardiomyocyten zeer kwetsbaar zijn, is een zachte behandeling van cardiomyocyten ook belangrijk. In de cel cultuur kap, aliquot 5ml hbss aan elke put van een 6-goed cel cultuur plaat en plaats het op ijs.Bovendien, aliquot 10ml HBSS aan een 10cm cel kweekschotel, dan, bereid 20 ml Trypsin Predigesttion oplossing in een 50ml steriele conische buis. Houd alle oplossingen op ijs. Haal vervolgens het hart eruit en breng het onmiddellijk over naar het steriele celkweekgerecht met HBSS.Verwijder eventueel resterende longweefsel en grotere bloedvaten. Was het hart in HBSS met behulp van zachte agitatie. Snijd vervolgens het hart met een fijne schaar in 8 stukken en breng het hartweefsel met tangen over in één put van een 6-put celkweekplaat met HBSS.Met behulp van een moria lepel, was het hartweefsel door het overbrengen van goed naar goed in de 6-well plaat gevuld met HBSS. Breng vervolgens het hartweefsel over in een conische buis met 20 ml Trypsin en incbaat met zachte agitatie bij 4 graden Celsius gedurende 4 uur. In deze procedure, prewarm de collagenase spijsvertering oplossing in een waterbad op 37 graden celsius.Breng de conische buis met hartweefsel en predigestie oplossing van 4 graden Celsius naar een cel cultuur kap. Laat het hartweefsel zinken naar de bodem van de buis en verwijder de predigestie oplossing met behulp van een 10ml serologische pipet. Voeg vervolgens 10 ml HBSS toe aan de buis.Resuspend het hartweefsel met HBSS 2 tot 3 keer uit te wassen Trypsin met behulp van een 10ml serologische pipet. Aspirate HBSS en voeg 10ml van voorverwarmde collagenase spijsvertering oplossing in de buis met hartweefsel. Voor de eerste spijsvertering, incubeer de buis met hartweefsel in een waterbad op 37 graden celsius gedurende 10 minuten zonder agitatie.Breng de buis daarna over naar de celkweekkap. Triturate het weefsel door het voorzichtig 10 keer te herhalen met behulp van een 10ml serologische pipet. Dit zal het mogelijk maken het hart te verspreiden en de cellen worden vrijgegeven uit het hartweefsel.Laat het onverteerd weefsel zinken. Breng de verteerde oplossing verrijkt met cardiomyocyten over naar een nieuwe conische buis en voeg onmiddellijk een gelijke hoeveelheid celkweekmedium toe om de collagenasevertering te stoppen. Voeg vervolgens 10 ml collagenase spijsverteringsoplossing toe aan de buis met het resterende onverteerd hartweefsel.Voor de tweede spijsvertering, incubeer de buis met hartweefsel in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten. Herhaal de procedures van de eerste spijsvertering en breng de verteerde oplossing verrijkt met cardiomyocyten over naar een nieuwe conische buis voordat u de collagenase-spijsvertering stopt. Plaats vervolgens een steriele celzeef in een nieuwe steriele 50ml conische buis.Maak de celzeef voor aan met 2 tot 3 ml celkweekmedium en geef de cellen door de celzeef. Spoel vervolgens de celzeef af met celkweekmedium. Vervolgens, centrifugeren de conische buis met cardiomyocyten gedurende 5 minuten op 180 keer de zwaartekracht.Na 5 minuten, aspirate de supernatant en resuspend de cel pellet in 10ml van de cel cultuur medium. Plaats de cellen op een 10cm celkweekschaal en broed ze een uur lang uit. Daarna, zachtjes roeren de plaat.Was de niet-aanhangende cellen af en verhoog de cellen door herhaaldelijk het celkweekmedium over de schotel te pipetten met behulp van een 10ml serologische pipet. Breng vervolgens de niet-aanhangende cellen over in een nieuwe 10cm celkweekschaal en ontcubeer ze nog een uur. Na een uur, voorzichtig roeren de plaat en afwassen van de niet-aanhangende cellen.Breng de cardiomyocyten over in een nieuwe 50ml conische buis. Bereid vervolgens een 96-well cultuurplaat door 50 microliter coatingoplossing in elke put van de 96-put celkweekplaat te aliquoting. Als er bellen aanwezig zijn, verwijder ze dan met een pipet van 20 microliter.Incubeer de plaat op 37 graden celsius gedurende ten minste een uur om het drogen van de matrix coating mogelijk te maken. Tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer. Plaat de cellen in de extra cellulaire matrix gecoate 96-well cel kweekplaat bij een dichtheid tussen 10 tot 30 duizend cellen per put.En plaats de cellen in de opbroeder. Om de zuurstofverbruikstest vooraf te vormen, hydrateer u een flux analyzer sensor cartridge voor ten minste 3 uur, voeg 200 microliter van calibrant oplossing in elke put van de utility plate. Plaats de sensorcartridge terug op de nutsplaat en broed gedurende ten minste 3 uur in 37 graden celsius zonder CO2- of O2-suppletie.Een uur voor de test, verwijder voorzichtig de cel cultuur medium en was de cellen met 200 microliter van prewarmed mitochondriale stress test medium tweemaal. Voeg na de tweede wasbeurt 175 microliter voorverwarmd mitochondriaal stresstestmedium toe. Dan cultuur de cellen op 37 graden Celsius zonder kooldioxide of zuurstof suppletie.Bereid 3 ml van elk van de testverbindingen in mitochondriale stress test medium. Laad 25 microliter van elke verbinding in de injectorpoorten van de sensorcartridge met behulp van een multikanaalpipet. Toestand van de cellen en eventuele voorbehandelingen kunnen van invloed zijn op de maximale restauratie die wordt opgewekt door injectie van ontkoppelde FCCP.Celgevoeligheid voor de ontkoppelaar kan ook veranderen, daarom is het van cruciaal belang om de werkconcentratie van FCCP voor elke specifieke behandeling te optimaliseren. Vervolgens, het opzetten van extra cellulaire flux test protocol en start het programma. Plaats eerst de sensor cartiridge in de machine voor kalibratie.Vervang de remklauw voor de testplaat zodra de kalibratiestap is uitgevoerd. Gooi indien gewenst, na de test, zorgvuldig alle testmedium weg met behulp van een multi-channel pipet. En bewaar de celkweek mircoplate op negatieve 20 graden Celsius voor toekomstige celnormalisatie met behulp van eiwittest.Door het beschreven protocol te gebruiken, werden harten geïsoleerd vanaf dag 0 neonatale pups en werden cardiomyocyten gezaaid bij dichtheden van 10, 20 of 30 duizend cellen per put in 96-well platen. Na de nachtelijke cultuur, cardiomyocyten werden gevonden goed gehecht aan de gecoate plastic oppervlak en er waren zeer weinig niet-verbonden cellen. Op dit punt, spontaan aanbestedende cardiomyocyten waren gemakkelijk zichtbaar.Een zaaidichtheid van 30.000 cellen per put toonde samenvloeiing een dag na het zaaien als de cellen zich verspreiden. Cardiomyocyten werden immunostained met een antilichaam tegen sarcomeric alpha actinine, een cardiomyocyte specifieke marker. Zoals hier getoond, vertoonden de meeste cellen een positieve kleuring van alfa-actinine die de hoge zuiverheid van de cardiomyocyte-isolatie aangeeft.Een schema van een typische mitochondriale stresstest wordt hier getoond. De mitochondriale stresstest begint met een basislijnmeting van het zuurstofverbruik, dit wordt gevolgd door de injectie van Oligo myosine die ATPA's remt. Vervolgens werd het ontkoppelingsmiddel FCCP geïnjecteerd om het maximale zuurstofverbruik te meten.Ten slotte stopt mitochondriale ademhaling met de injectie van twee elektronentransporten volledig en daalt OCR tot het laagste niveau. Om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Het is van cruciaal belang om een hoge overlevingskansen te bereiken.Daarom is het belangrijk om pasgeboren neonaten te gebruiken en zorgvuldig behandeld hartweefsels in cardiomyocyten. Door het gebruik van nieuwe of bestaande genetisch gemanipuleerde muislijnen, kan deze methode gemakkelijk worden vertaald naar gegevens die kunnen leiden tot het begrijpen van nieuwe mechanismen voor bio-energetische regelgeving in het hart. Mitochondriaal spelen belangrijke rollen in hartfunctie.We verwachten dat deze methode zal helpen bij het identificeren van nieuwe regelgevers en trajecten die het oxiderende metabolisme reguleren en het vinden van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hartfalen.

analyzing-oxygen-consumption-rate-primary-cultured-mouse-neonatal

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros InstrumentsThis video explains how oxygen flux is used to assess mitochondrial respiration in living and permeabilized mammalian cells. It demonstrates the sequential use of digitonin, metabolic substrates, ADP, an uncoupler, and an inhibitor to characterize different respiratory states. The resulting oxygen flux profile reveals mitochondrial function and energy-coupling efficiency under defined conditions.

Oxygen Flux Measurements to Evaluate Mitochondrial Respiration in Living and Permeabilized Cells

Glycolyse is een bepalende metabolische marker in meerdere biologische systemen. Het monitoren van glycolyse door het meten van de extracellulaire flux van H+ is gebruikelijk, maar vereist correctie om kwantitatief en eenduidig te zijn. Hier laten we zien hoe je extracellulaire fluxgegevens kunt verzamelen en corrigeren om onderscheid te maken tussen respiratoire en glycolytische bronnen van extracellulaire acidificatie.

Meting en analyse van de extracellulaire zuurproductie te bepalen glycolytisch Rate

Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Zuurstofverbruik (OCR) is een veel voorkomende proxy voor mitochondriale functie en kan worden gebruikt om verschillende ziektemodellen te bestuderen. We hebben een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen die fysiologisch relevanter is dan andere methoden.

Meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

We presenteren een protocol om plasmamembraan selectief te permeabiliseren, waardoor gerichte toediening van substraten en remmers mogelijk is om mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in gekweekte cellen te beoordelen, waarmee plasmamembraantransportbarrières worden overwonnen die dergelijke analyse doorgaans belemmeren. Met deze techniek hebben we aangetoond hoe de werking van OXPHOS wordt gemoduleerd door muscarinische agonisten en antagonisten.

Cholinerge ligandafhankelijke modulatie van oxidatieve fosforyleringskoppeling in digonine-permeabiliseerde BE(2)-C neuroblastoomcellen

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van de zuurstofconsumptiesnelheid en extracellulaire verzuringingssnelheid van ex vivo volwassen zebravisventrikels om hun oxidatieve en glycolytische metabole capaciteit te karakteriseren.

Beoordeling van de metabole activiteit van hele regenererende zebravisventrikels ex vivo met behulp van een extracellulaire fluxassay

Leer de analyse van zuurstofverbruik in neonatale muiscardiomycyten met behulp van een extracellulaire flux-analyzer. Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het beoordelen van mitochondriale functie en metabole gezondheid.

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer (Video) | JoVE Journal

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

Meer video's verkennen