Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

Dit protocol stelt ons in staat om te isoleren en cultuur hoge bi-BBT, alleen bekend om de muis cardiomyocyten. Om de mitochondriale functie te evalueren, kan het zuurstofverbruik van cardiomyocyten worden geanalyseerd door een echte zilverfluxanalyzer. Een van de voordelen van deze techniek is dat het zuurstofverbruik van cardiomyocyten gemakkelijk kan worden gemeten in hun aanhangende toestand in 96-well formaat, waardoor het testen van meerdere omstandigheden met een groot aantal replicaties mogelijk is.

Dit vat geeft belangrijke inzichten in het onderzoeksgebied van cardiologie. Naast het zuurstofverbruik kunnen we ook andere metabole parameters bestuderen, zoals grijsgrices en uitgezuurde epoxidatie. Het bereiken van een hoge variabiliteit van cardiomyocyten is van cruciaal belang voor dit experiment.

Dit vereist een efficiënte vertering van harten. Aangezien neonatale cardiomyocyten zeer kwetsbaar zijn, is een zachte behandeling van cardiomyocyten ook belangrijk. In de cel cultuur kap, aliquot 5ml hbss aan elke put van een 6-goed cel cultuur plaat en plaats het op ijs.

Bovendien, aliquot 10ml HBSS aan een 10cm cel kweekschotel, dan, bereid 20 ml Trypsin Predigesttion oplossing in een 50ml steriele conische buis. Houd alle oplossingen op ijs. Haal vervolgens het hart eruit en breng het onmiddellijk over naar het steriele celkweekgerecht met HBSS.

Verwijder eventueel resterende longweefsel en grotere bloedvaten. Was het hart in HBSS met behulp van zachte agitatie. Snijd vervolgens het hart met een fijne schaar in 8 stukken en breng het hartweefsel met tangen over in één put van een 6-put celkweekplaat met HBSS.

Met behulp van een moria lepel, was het hartweefsel door het overbrengen van goed naar goed in de 6-well plaat gevuld met HBSS. Breng vervolgens het hartweefsel over in een conische buis met 20 ml Trypsin en incbaat met zachte agitatie bij 4 graden Celsius gedurende 4 uur. In deze procedure, prewarm de collagenase spijsvertering oplossing in een waterbad op 37 graden celsius.

Breng de conische buis met hartweefsel en predigestie oplossing van 4 graden Celsius naar een cel cultuur kap. Laat het hartweefsel zinken naar de bodem van de buis en verwijder de predigestie oplossing met behulp van een 10ml serologische pipet. Voeg vervolgens 10 ml HBSS toe aan de buis.

Resuspend het hartweefsel met HBSS 2 tot 3 keer uit te wassen Trypsin met behulp van een 10ml serologische pipet. Aspirate HBSS en voeg 10ml van voorverwarmde collagenase spijsvertering oplossing in de buis met hartweefsel. Voor de eerste spijsvertering, incubeer de buis met hartweefsel in een waterbad op 37 graden celsius gedurende 10 minuten zonder agitatie.

Breng de buis daarna over naar de celkweekkap. Triturate het weefsel door het voorzichtig 10 keer te herhalen met behulp van een 10ml serologische pipet. Dit zal het mogelijk maken het hart te verspreiden en de cellen worden vrijgegeven uit het hartweefsel.

Laat het onverteerd weefsel zinken. Breng de verteerde oplossing verrijkt met cardiomyocyten over naar een nieuwe conische buis en voeg onmiddellijk een gelijke hoeveelheid celkweekmedium toe om de collagenasevertering te stoppen. Voeg vervolgens 10 ml collagenase spijsverteringsoplossing toe aan de buis met het resterende onverteerd hartweefsel.

Voor de tweede spijsvertering, incubeer de buis met hartweefsel in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten. Herhaal de procedures van de eerste spijsvertering en breng de verteerde oplossing verrijkt met cardiomyocyten over naar een nieuwe conische buis voordat u de collagenase-spijsvertering stopt. Plaats vervolgens een steriele celzeef in een nieuwe steriele 50ml conische buis.

Maak de celzeef voor aan met 2 tot 3 ml celkweekmedium en geef de cellen door de celzeef. Spoel vervolgens de celzeef af met celkweekmedium. Vervolgens, centrifugeren de conische buis met cardiomyocyten gedurende 5 minuten op 180 keer de zwaartekracht.

Na 5 minuten, aspirate de supernatant en resuspend de cel pellet in 10ml van de cel cultuur medium. Plaats de cellen op een 10cm celkweekschaal en broed ze een uur lang uit. Daarna, zachtjes roeren de plaat.

Was de niet-aanhangende cellen af en verhoog de cellen door herhaaldelijk het celkweekmedium over de schotel te pipetten met behulp van een 10ml serologische pipet. Breng vervolgens de niet-aanhangende cellen over in een nieuwe 10cm celkweekschaal en ontcubeer ze nog een uur. Na een uur, voorzichtig roeren de plaat en afwassen van de niet-aanhangende cellen.

Breng de cardiomyocyten over in een nieuwe 50ml conische buis. Bereid vervolgens een 96-well cultuurplaat door 50 microliter coatingoplossing in elke put van de 96-put celkweekplaat te aliquoting. Als er bellen aanwezig zijn, verwijder ze dan met een pipet van 20 microliter.

Incubeer de plaat op 37 graden celsius gedurende ten minste een uur om het drogen van de matrix coating mogelijk te maken. Tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer. Plaat de cellen in de extra cellulaire matrix gecoate 96-well cel kweekplaat bij een dichtheid tussen 10 tot 30 duizend cellen per put.

En plaats de cellen in de opbroeder. Om de zuurstofverbruikstest vooraf te vormen, hydrateer u een flux analyzer sensor cartridge voor ten minste 3 uur, voeg 200 microliter van calibrant oplossing in elke put van de utility plate. Plaats de sensorcartridge terug op de nutsplaat en broed gedurende ten minste 3 uur in 37 graden celsius zonder CO2- of O2-suppletie.

Een uur voor de test, verwijder voorzichtig de cel cultuur medium en was de cellen met 200 microliter van prewarmed mitochondriale stress test medium tweemaal. Voeg na de tweede wasbeurt 175 microliter voorverwarmd mitochondriaal stresstestmedium toe. Dan cultuur de cellen op 37 graden Celsius zonder kooldioxide of zuurstof suppletie.

Bereid 3 ml van elk van de testverbindingen in mitochondriale stress test medium. Laad 25 microliter van elke verbinding in de injectorpoorten van de sensorcartridge met behulp van een multikanaalpipet. Toestand van de cellen en eventuele voorbehandelingen kunnen van invloed zijn op de maximale restauratie die wordt opgewekt door injectie van ontkoppelde FCCP.

Celgevoeligheid voor de ontkoppelaar kan ook veranderen, daarom is het van cruciaal belang om de werkconcentratie van FCCP voor elke specifieke behandeling te optimaliseren. Vervolgens, het opzetten van extra cellulaire flux test protocol en start het programma. Plaats eerst de sensor cartiridge in de machine voor kalibratie.

Vervang de remklauw voor de testplaat zodra de kalibratiestap is uitgevoerd. Gooi indien gewenst, na de test, zorgvuldig alle testmedium weg met behulp van een multi-channel pipet. En bewaar de celkweek mircoplate op negatieve 20 graden Celsius voor toekomstige celnormalisatie met behulp van eiwittest.

Door het beschreven protocol te gebruiken, werden harten geïsoleerd vanaf dag 0 neonatale pups en werden cardiomyocyten gezaaid bij dichtheden van 10, 20 of 30 duizend cellen per put in 96-well platen. Na de nachtelijke cultuur, cardiomyocyten werden gevonden goed gehecht aan de gecoate plastic oppervlak en er waren zeer weinig niet-verbonden cellen. Op dit punt, spontaan aanbestedende cardiomyocyten waren gemakkelijk zichtbaar.

Een zaaidichtheid van 30.000 cellen per put toonde samenvloeiing een dag na het zaaien als de cellen zich verspreiden. Cardiomyocyten werden immunostained met een antilichaam tegen sarcomeric alpha actinine, een cardiomyocyte specifieke marker. Zoals hier getoond, vertoonden de meeste cellen een positieve kleuring van alfa-actinine die de hoge zuiverheid van de cardiomyocyte-isolatie aangeeft.

Een schema van een typische mitochondriale stresstest wordt hier getoond. De mitochondriale stresstest begint met een basislijnmeting van het zuurstofverbruik, dit wordt gevolgd door de injectie van Oligo myosine die ATPA's remt. Vervolgens werd het ontkoppelingsmiddel FCCP geïnjecteerd om het maximale zuurstofverbruik te meten.

Ten slotte stopt mitochondriale ademhaling met de injectie van twee elektronentransporten volledig en daalt OCR tot het laagste niveau. Om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Het is van cruciaal belang om een hoge overlevingskansen te bereiken.

Daarom is het belangrijk om pasgeboren neonaten te gebruiken en zorgvuldig behandeld hartweefsels in cardiomyocyten. Door het gebruik van nieuwe of bestaande genetisch gemanipuleerde muislijnen, kan deze methode gemakkelijk worden vertaald naar gegevens die kunnen leiden tot het begrijpen van nieuwe mechanismen voor bio-energetische regelgeving in het hart. Mitochondriaal spelen belangrijke rollen in hartfunctie.

We verwachten dat deze methode zal helpen bij het identificeren van nieuwe regelgevers en trajecten die het oxiderende metabolisme reguleren en het vinden van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hartfalen.