Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

Dit protocol beschrijft de synthese en toepassing van PODS, een nieuw reagens voor de locatiespecifieke bioconjugatie van eiwitten en peptiden. Deze technologie is een duidelijke verbetering ten opzichte van traditionele maleimide-thiol-gebaseerde bioconjugations. Het grootste voordeel van deze procedure is de eenvoud waarmee het reagens wordt gemaakt.

De methode maakt het mogelijk het reagens te synthetiseerd in vrijwel elk laboratorium. Los in een kolf van 10 milliliter ronde bodem 100 milligram van de aminophenyloxadiazool thiol op in drie milliliter methanol. Voeg aan de oplossing 360 microliters diisopropylethylamine en een magnetische roerstang toe.

Sluit de kolf af met een rubberen stop en roer de oplossing gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Met behulp van een glazen spuit van één milliliter, steek een gat door de rubberen stop en voeg snel 32 microliter iodomethaan toe aan het mengsel. Laat het mengsel 45 minuten reageren bij kamertemperatuur.

Los in een kolf van 25 milliliter ronde bodem 387 milligram van het door boc beschermde carboxylzuur op in 10 milliliter dichloormethaan. Voeg aan de oplossing 480 microliter diisopropylethylamine, 264 milligram EDCI, 200 milligram aniline en een magnetische roerstaaf toe. Verzegel de kolf met een glazen stop en laat de reactie vijf dagen roeren bij kamertemperatuur.

Zodra de reactie is voltooid, breng het reactiemengsel over op een separatoire trechter en was drie keer met vijf milliliter zoutzuur van één mol. Verzamel de organische fase en breng deze over naar de separatory funnel. Was vervolgens de organische fase met een-molaire natriumcarbonaat, gevolgd door water.

Verzamel vervolgens de organische fase en voeg magnesiumsulfaat toe om eventuele sporen van water te verwijderen. Vervolgens filter het mengsel met behulp van een medium glas frit. Verwijder met behulp van een roterende verdamper de vluchtige oplosmiddelen onder verminderde druk om een off-white vaste stof te betalen.

Daarna redissolve de geïsoleerde vaste stof in 10 milliliter ethylacetaat. Dan neerslaan het product via de geleidelijke toevoeging van 30 milliliter cyclohexaan. Filter de oplossing met behulp van een medium glazen frit om het carbamaatproduct als wit poeder te verkrijgen.

Los in een kolf van 10 milliliter ronde bodem 30 milligram carbamaat op in vier milliliter dichloormethaan. Voeg langzaam 49 milligram van 70%m-chloroperbenzoëzuur en een magnetische roerstaaf toe aan het mengsel en sluit de kolf af met een glazen stop. Roer de oplossing 's nachts bij kamertemperatuur, uiteindelijk levert een geel mengsel.

Breng het mengsel de volgende dag over naar een separatory trechter. Was vervolgens het mengsel met 0,1-molaire natriumhydroxide, gevolgd door water. Verzamel de organische fase en voeg magnesiumsulfaat toe om eventuele sporen van water te verwijderen.

Vervolgens filter het mengsel met behulp van een medium glas frit. Los in een kolf van 25 milliliter ronde bodem 30 milligram carbamaat op in twee milliliter dichloormethaan. Voeg een magnetische roerstaaf toe aan het mengsel.

En 400 microliters trifluoroacetisch zuur en verzegelen de kolf met een glazen stop. Roer vervolgens het reactiemengsel drie uur op kamertemperatuur. Zodra de reactie is voltooid, verwijder de vluchtige stoffen onder verminderde druk bij kamertemperatuur met behulp van een roterende verdamper om een olieachtige residu te verkrijgen.

Los het olieachtige residu op in zeven milliliter water. En over te dragen aan een separatory trechter. Was de waterige oplossing drie keer met vier milliliter ethylacetaat.

Los in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter 10 milligram PODS en 300 microliter dimethylsulfoxide op. Voeg vervolgens 26 microliter N, N-diisopropylethylamine toe aan de oplossing. Los 15,2 milligram DOTA NCS op in 100 microliter dimethylsulfoxide en combineer de oplossing met de PODS-oplossing.

Verzegel de microcentrifugebuis en laat de reactie 's nachts uitbroeden bij kamertemperatuur. Vervolgens verdun 61 microliter van een trastuzumab-voorraadoplossing met 859 microliter PBS in een eiwitarme microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg aan dit mengsel 6,7 microliter van een vers gemaakte 10-millimolaroplossing van TCEP in water toe.

Voeg 73 microliter van een 1-milligram-per-milliliter PODS-DOTA-oplossing toe aan het reactiemengsel. Sluit ten slotte de microcentrifugebuis af en broed de oplossing twee uur bij kamertemperatuur. De PODS synthese is robuust en betrouwbaar.

Deproteination en substitutie van de aminofenyl oxadiazole thiol bood thioether een in kwantitatieve opbrengst. Ligatie van thioether een en de boc-beschermde carboxylzuur leverde samengestelde twee in 55%opbrengst. Oxidatie bood samengestelde drie op 90%-opbrengst.

En verwijdering van de bocs-beschermende groep leverde PODS op in een rendement van 98%. De identiteit van elk product werd bevestigd via proton NMR, carbon NMR en hoge resolutie MS. Een isothiocyanaat-dragende variant van de chelator DOTA werd gekoppeld aan de hanger amine van PODS om de tweefunctionele chelator in 75% opbrengst te verkrijgen. De identiteit van het product werd bevestigd via proton NMR, carbon NMR en hoge resolutie MS. Site-selectieve bioconjugatie van PODS-DOTA aan de HER2-targeting antilichaam trastuzumab wordt hier getoond.

De disulfide koppelingen van het scharniergebied van het antilichaam werden selectief verminderd, en het antilichaam werd vervolgens geïncubeerd met PODS-DOTA om de DOTA-dragende immunoconjucatie een opbrengst van 80% te veroorloven. MALDI-TOF analyse toonde een zekere mate van etikettering van 1,8 DOTA per antilichaam. Die consistent blijft in een reeks van menselijke, gehumaniseerde en chimeric IgG1 antilichamen.

Dezelfde voorwaarden produceren echter immunoconjugaaten met een mate van etikettering van 1,5 voor murine IgG1-antilichamen. Vanwege de lichtgevoeligheid van deze verbinding is het belangrijk om alle reacties in met folie bedekte vaten te houden. Dit verhoogt de totale opbrengst van het product.

Hoewel dit protocol de synthese van PODS-DOTA beschrijft, kan een soortgelijke procedure worden toegepast op een breed scala aan potentiële ladingen, waaronder fluoroforen, toxines en andere chelators. Deze methode zal de bouw vergemakkelijken van goed gedefinieerde, homogene en zeer stabiele immunoconjugates die in een breed scala aan gebieden kunnen worden gebruikt. Het is belangrijk om te onthouden dat de iodomethaan toegevoegd in stap een van dit experiment kan schadelijke effecten hebben, en moet daarom worden gebruikt in een rookkap.