Beoordeling van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters na In Utero transductie van de ontwikkelingslanden muis hersenen en ruggenmerg

Onze gecombineerde aanpak helpt te beantwoorden hoe ultrastructurele neuroplasticiteit parameters veranderen na vroege ontwikkelingsinterventies aan het ontluikende zenuwstelsel in de baarmoeder. Het belangrijkste voordeel van onze methode is het verwerven van beelden met hoge resolutie van macro-meso-micro-en nanostructuren in het vooraf gedefinieerde coördinatensysteem binnen een weefselatlas. De implicatie van onze methode is het translationele therapeutische potentieel voor aangeboren neurodegeneratieve ziekten.

Bijvoorbeeld, behandeling en redding in embryonale stadia met behulp van deze in utero transductie techniek. Onze methode kan worden toegepast op elk ander model. De muizensoort kan bijvoorbeeld worden veranderd, evenals het interessegebied.

Onderzoekers proberen onze methode voor de eerste keer behoefte aan diepgaande chirurgische training, evenals de kennis van hoe het weefsel voor te bereiden op elektronenmicroscopische beeldvorming. Begin met het laden van een aangepaste capillaire tip met vier keer 10 tot de 11 virale deeltjes van adeno-geassocieerde virus type 1 coating voor het gewenste doel, en gelabeld met Fast Green kleurstof op een aspirator buis. Voeg 15 microliter van de gelabelde adeno-geassocieerde virusdeeltjes toe aan de capillaire.

Bevestig vervolgens een gebrek aan respons op teensnuifje op een verdoofde embryonale dag 14,5 zwangere muis en desinfecteer de huid. Gebruik gebogen gekartelde iris tangen en rechte wolfraam carbide schaar om een huid incisie langs de linea mediana te maken. Met behulp van rechte Dumont pincet om de buikwand grip, blijven langs de linea alba met rechte Vannas schaar en plaats een stuk van fenestrated paraffine film over de buikopening en gebruik een lepel-achtige apparaat om de baarmoeder hoorns bloot te stellen zonder beschadiging van de embryo's in de hoorns.

Na het aanbrengen van een paar druppels van 37-graden-Celsius PBS op de baarmoederhoorns, inspecteer de embryo's op schade of misvormingen in de baarmoederzak. Draai de embryo's voorzichtig in hun zakjes totdat de gewenste positie voor elke injectie is bereikt. Wanneer de embryo's op hun plaats zijn, injecteer een tot twee microliter van de Fast Green gelabelde virusdeeltjesoplossing in elk embryo.

Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, plaats de baarmoederhoorns terug in de buikholte en voeg een paar druppels van 37-graden-Celsius PBS in de buik. Gebruik vervolgens polyamide 6-0 grote hechtingen om de buikvlieswand en polyamide 3-0 grote hechtingen en Halsted's Mosquito hemostatische tangen te sluiten om de huid te sluiten. Om geïsoleerde weefsels van belang voor tele-macrofotografie in te bedden, plaatst u het weefselmonster in een speciaal frame met de reproduceerbare uitsnedehoek en documenteert u de coördinaten.

Vul het frame met 30-graden-Celsius 3%agarose totdat het weefsel is bedekt, en bedek het frame met een plastic deksel totdat de agarose is uitgehard. Terwijl de agarose verhardt, gebruik het tele-macro grafisch apparaat om het ingebedde weefsel en de coördinaten in het frame in beeld te brengen. Wanneer de agarose is gestold, breng het agarose-ingebedde weefsel in het frame met snijgaten die overeenkomen met de coördinaten van het eerste frame.

Gebruik een apparaat met een dun en trillend scheermesje om het ingebedde weefsel in secties van een geschikte experimentele dikte te snijden. Vervolgens beeld elke weefselsectie in PBS, en het verzamelen van de beelden in een map. Om de weefselmonsters voor te bereiden op transmissieelektronenmicroscopie, wast u in een bioveiligheidskast de weefselsecties met twee wasbeurten van 30 minuten in PBS, gevolgd door een twee uur durende incubatie in 2%waterige osmiumteroxideoplossing bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, was de osmicated secties nog twee keer in PBS gedurende 30 minuten per wasbeurt en dehydrateren van de secties in sequentiële 10-tot 15-minuten ethanol onderdompelingen zoals aangegeven. Na de 70% ethanol onderdompeling, plaats elk monster in een zwarte schotel op een doffe zwarte achtergrond en beeld de monsters in 70% ethanol onder LED RGB licht toegepast op de monsters van de linker-en rechterkant onder 45-graden hoeken. Maak een atlas van de sectieafbeeldingen met coördinaten door afbeeldingen van de voorbeelden in reeksen in een map te verzamelen.

Behandel de specimens met twee 30-minuten 100%ethanol incubaties, gevolgd door twee 30-minuten 100% propyleenoxide incubaties, beide bij kamertemperatuur. Terwijl de monsters uitbroeden, meng vers bereide hars met propyleenoxide op een-op-een en een-op-twee verhoudingen, en voeg 3% versneller aan beide oplossingen. Breng na de tweede propyleenoxide incubatie de monsters over in de één-op-twee harspropyleenoxide inbedding van middelgrote oplossing gedurende twee uur bij kamertemperatuur, gevolgd door een twee uur durende incubatie in de een-op-een hars propyleenoxide inbedding medium oplossing bij kamertemperatuur.

Breng aan het einde van de tweede incubatie de weefsels over in platte polypropyleenschotels en genees de ingebedde weefsels met verse hars met 3% versneller gedurende 12 tot 24 uur bij 65 tot 85 graden Celsius. Koel vervolgens het weefsel af op kamertemperatuur en verwijder de in hars ingebedde exemplaren uit de polypropyleenschotels. Als u een interessegebied in kaart wilt brengen, selecteert u een afbeelding met het interessegebied uit de eerder voorbereide afbeeldingsatlas.

Schets de randen van het gebied van belang op het gedesmleden beeld, optisch superimpose deze grenzen op de ingebedde specimen onder de microscoop, en gebruik een 1-inch 26 meter naald om deze regio grenzen krassen op de hars specimen. Verwarm vervolgens de exemplaren tot 95 graden Celsius om de hars te verzachten. Haal vervolgens de warme harsmonsters uit de oven en gebruik een scheermesje om de interessegebieden te verdunnen.

Lijm de monsters op acrylglas met staven van het juiste kaliber en trim de gemonteerde exemplaren voor semi-en ultradunne doorsnede. Gebruik een ultramicrotome om semi-dunne 0,7-micrometer- en ultradunne 70-nanometersecties te verwerven, de semi-dunne secties op glasdragers te verzamelen en de ultradunne secties op nikkelroosters. Vlek de semi-dunne secties met 1%Toluidine blauw in PBS gedurende vier minuten, gevolgd door verschillende wasbeurten in gedeïïstiseerd water, alvorens de secties te onderzoeken door lichte microscopie.

De ultradunne secties kunnen dan direct worden beoordeeld door transmissie elektronenmicroscopie op 180 kilovolts zonder verdere wijziging. Na de sectie, het weefsel plakjes worden afgebeeld door tele-macro fotografie zoals net aangetoond. Na osmicatie en ethanol onderdompeling, worden de secties opnieuw afgebeeld door interferentie licht tele-macrografie, onthullend een specifiek gekleurd patroon voor elk weefseloppervlak.

Na extra uitdroging en hars inbedding worden de aandachtsgebieden geselecteerd en verder verwerkt voor transmissieelektronenmicroscopie. In de hippocampus en cerebellum, mossy vezel synapsen zijn bekend om unieke ultrastructurele kenmerken vertonen in vergelijking met andere synapsen, met inbegrip van grote presynaptische boutons. In hun dwarsdoorsnede profielen, de boutons bevatten een groot aantal vesicles en mitochondriën, en heel vaak omsluiten verschillende dendritische stekels.

In het ruggenmerg bevat de dorsale funiculus veel axonale vezels die door oligodendroglia worden gesyed. Op transversale secties, de dorsale funiculus kan worden gevonden tussen beide achterste hoorns van het ruggenmerg. Op transmissie elektronenmicroscopie beelden, dwarsdoorsnede myelinated axonen verschijnen rond, en de myeline omhulsels rond de axonen zijn georganiseerd in de lamellen.

De voorbereide atlas en de micrografische transmissie elektronenmicroscopie beelden van de ultrastructurele parameters zijn niet alleen nuttig voor de vergelijking van de morfologische neuroplasticiteit van verschillende secties onder verschillende behandelingsomstandigheden, maar ook voor vergelijkingen tussen parameters binnen hetzelfde gebied. Vergeet niet om grondig te plannen en voor te bereiden voordat u begint met de in utero transductie, en om er zeker van te zijn dat back-up van materialen en instrumenten in geval van complicaties. Volgens onze methode kunnen andere technieken worden toegevoegd, zoals immunogold-etikettering voorafgaand aan elektronenmicroscopie voor ultrastructurele tracering van een gedefinieerd molecuul van belang.

Beginnend met een holistische kijk op het hele organisme en inzoomend op de moleculaire topografie, zijn we in staat om de relatie tussen weefselfunctie en morfologie te bestuderen en te manipuleren. Osmium tetroxide is gevaarlijk. Zorg ervoor dat u altijd onder de motorkap werkt en een beschermende bril en handhandschoenen draagt bij het werken met dit reagens.