Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems

Siderophores zijn laag moleculair gewicht, metaal-chelating biomoleculen die betrokken zijn bij ijzer fietsen in het milieu. Dit protocol maakt een snelle hoge doorvoerbeoordeling van siderophoreactiviteit in bodem- en plantenmonsters mogelijk. Eerdere methoden voor siderophore detectie hebben geëlimineerd de cruciale omgeving van de microbiële gemeenschap.

Onze techniek maakt detectie binnen de relatief intacte microbiële gemeenschap en de habitat waarin het betrokken. Omdat ijzerbeschikbaarheid cruciaal is voor de productiviteit van de landbouw, kan dit protocol worden gebruikt om de rol van microben te onderzoeken bij het moduleren van de beschikbaarheid van ijzer voor planten. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de impact van landbouwbeheerpraktijken op de bodemgezondheid en zij-op-zijproducerende gemeenschappen en de ontwikkeling van dergelijke gemeenschappen in de loop van de tijd te beoordelen.

Om te beginnen wast zuur al het glaswerk in 100 millimolar zoutzuur van 100 millimolar gedurende ten minste twee uur voorafgaand aan het gebruik in de CAS-test. Bereid een aluminium bakplaat gevuld met laboratorium-grade zand en bedek het met aluminiumfolie. Autoclave op 121 graden Celsius gedurende 30 minuten en gereserveerd.

Bereid HDTMA door het toevoegen van 0365 gram tot 20 milliliter dubbel gedeïmiseerd water, en plaats de oplossing in een waterbad op 37 graden Celsius om oplosmiddel te bevorderen. Voeg 0302 gram CAS toe aan 25 milliliter dubbel gedeïsized water terwijl u zachtjes roert met een steriele magnetische roerstaaf. Voeg vervolgens vijf milliliter van een molair ijzerchloride hexahydraat toe aan de 25 milliliter CAS-oplossing terwijl u voorzichtig blijft roeren.

Voeg nu langzaam de 20 milliliter HDTMA-oplossing toe aan de ijzer-CAS-complexe oplossing terwijl u zachtjes roert. Bereid de bufferoplossing voor door 15,12 gram PIPES op te lossen in 375 milliliter dubbel gedeïsized water met voorzichtig roeren. Pas de pH aan op 6,8 met vijf molaire natriumhydroxide.

Voeg vervolgens water toe om het volume op 450 milliliter te brengen. Voeg nu vijf gram agarose toe aan de oplossing. Autoclave de PIPES buffer oplossing en de ijzer CAS complexe oplossing op 121 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Voeg zorgvuldig het geheel van de ijzer-CAS complexe oplossing toe aan het geheel van de PIPES buffer in de biosafety cabinet nadat elk van hen is geautoclaved. Plaats de gemengde oplossing in een waterbad op 50 graden Celsius. Plaats nu een steriele reagensboot in het steriele zand in de bioveiligheidskast en verwarm tot 50 graden Celsius.

Breng het ijzer CAS complex agar naar de boot, dan snel aliquot 100 microliters aan elke put van een duidelijke platte bodem steriele 96-well microplaat. Bereid 800 micromolar pyoverdine standaard in eerder voorbereid gemodificeerd M9 medium. Verdun de oplossing in 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 micromolaroplossingen.

Voeg EDTA toe aan 500 milliliter eerder bereid gemodificeerd M9-medium om de 3,2 millimolar EDTA-norm voor te bereiden. Verdun deze oplossing tot 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 micromolar oplossingen. Om een standaardcurve te genereren, voeg 100 microliter van elke concentratie pyoverdine en EDTA toe om putten van een 96-bron microplaat met 100 microliter ijzer-CAS-complex agar-medium te scheiden.

Maak dubbele technische replicaties van elke concentratie. Voeg ook lege putten toe met alleen M9. Met behulp van een microplate-lezer meet u absorptie na één, zes en 24 uur incubatie bij 22 graden Celsius en gebruikt u absorptiemetingen om standaardcurven te genereren. Was de bemonsteringsapparatuur met 22 micron filter dubbel gedeïniseerd water gevolgd door 70% ethanol en veeg met papieren handdoeken.

Voer de was uit vóór bemonstering en tussen de monsters om steriele techniek te behouden en kruisbesmetting te verminderen. Na het uitsnijden van plantenweefsels en het opgraven van een kleine kluit van planten in het veld, plaats de kluit in een aparte gelabelde plastic zak voor monsterscheiding in de laboratoriumomgeving. Plaats alle monsters direct op ijs en houd op vier graden Celsius totdat monsters worden verwerkt voor de siderophore productie test.

Aparte wortel geassocieerde bodemmonsters in bulk, los gebonden rhizosfeer bodem en strak gebonden rhizosfeer bodem. Om dit te doen, neem de wortel ballen uit de zakken en zachtjes af te schudden grond van de kluit. Afgeschud grond, samen met de grond links in de zak, bestaan uit de bulk bodem.

Dit is de losgebonden rhizosfeergrond. Genereer hier streng gebonden wortelstokbodem door wortels te nemen met het strak gebonden monster en ze in een centrifugebuis te stoppen. Voeg 30 milliliter dubbel gedeïniseerd water en vortex toe gedurende twee tot drie minuten.

Verwijder de wortels om de strak gebonden rhizosfeer bodem drijfmest verdunning te krijgen. Homogeniseer elk bodemmonster in de monsterzak door de grond zoveel mogelijk te mengen en te draaien zonder de zak te openen. Nadat elk monster grondig is gemengd, aliquot en schort twee gram van elk bodemmonster in 20 milliliter gemodificeerde M9 medium binnen een steriele 50 milliliter centrifuge buis.

Verdun het monster en sluit de buis af met een steriele schuimplug om beademing mogelijk te maken. Voor strak gebonden rhizosfeermonsters voegt u twee milliliter van de rhizosfeergronddrijfmest toe aan 20 milliliter gemodificeerd M9-medium in een steriele centrifugebuis van 50 milliliter. Verdun het monster en sluit de buis af met een steriele schuimplug om beademing mogelijk te maken.

Om het weefselmonster voor te bereiden, steriliseert het oppervlak de wortel, schiet en graan met 70% ethanol. Macerate twee gram vers weefsel in 20 milliliter gemodificeerd m9 medium met behulp van een blender op hoog gedurende 30 seconden. Breng het monster vervolgens over op een steriele centrifugebuis van 50 milliliter, verdun en sluit de buis af met een steriele schuimplug.

Om de productie van zijrope rij te verrijken door middel van ijzerbeperking de 50 milliliter centrifugebuizen bij kamertemperatuur en schudden bij 160 RPM. Op 24, 48 en 72 uur na het initiëren van de verrijkingscultuur, verwijder een milliliter submonsters uit de verrijking buizen met behulp van steriele techniek. Centrifugeer de submonsters op 10.000 keer G gedurende een minuut in twee milliliter centrifugebuizen om de cellen te pelletiseren.

Voeg met behulp van steriele techniek 100 microliter van de supernatant toe aan een 100 microliteroplossing van ijzer-CAS-complex agar in duplicaat of drievoud in de microplaat. Voeg ook 100 microliter van steriel M9 medium als blanks. Dan incubeer de plaat op 28 graden Celsius.

Elke plaat moet worden verzegeld en bedekt met folie voorafgaand aan plaatsing in de couveuse. Hang de resterende supernatant en pellet voor elk monster in zijn eigen steriele twee milliliter centrifugebuis. Voeg 400 microliter steriele glycerol toe aan elke monstersupernatant buis en schort de pellet opnieuw op om glycerolvoorraden te creëren.

Vries het aandeel op min 80 graden Celsius voor latere analyse. Meet de absorptie op zes, 24, 48 en 72 uur op een golflengte van 420 nanometer. Een pyoverdine mengsel biosynthetiseerd door Pseudomonas fluorescens werd gebruikt als een standaard te interpreteren en te kwantificeren absorptie van monsters in monsters van pyoverdine equivalentie in micromolar.

De relatie tussen absorptie op 420 nanometer en de startconcentratie van pyoverdine wordt hier getoond. Siderophore activiteit van de 72 uur verrijking werd beoordeeld bij 48 uur incubatie om de invloed van genotype en monstertype op siderophore isolatie te bepalen. De nevenactiviteit in bulkgrondmonsters was relatief laag en vertoonde geen verschillen tussen het tarwegenotype waaruit de bulkgrond werd bemonsterd.

Verrijkingen van losgebonden grond geïsoleerd van het 725-genotype vertoonden echter een grotere siderophoreproductie in vergelijking met de losgebonden grond van Madsen en 727, maar niet van Lewjain. Omgekeerd werd de productie van siderophore in verrijkingen van strak gebonden grond niet sterk beïnvloed door genotype. Verrijkingsculturen van graanweefsel leverden een relatief lage zijropeproductie op, ongeacht genotype.

Verrijkingen van Lewjain shoot weefsel had aanzienlijk lagere siderophore productie dan de andere genotypen, en 725 shoot weefsel culturen resulteerde in meer variabele siderophore productie. Het grootste verschil in siderophore activiteit werd waargenomen in wortelweefsel verrijking culturen waar 725 had meer dan 200% grotere siderophore activiteit dan alle andere genotypes. Een van de meest belastende aspecten van het uitvoeren van het protocol is het handhaven van aseptische omstandigheden, terwijl de voltooiing van de vele stappen om de CAS ijzer agar microplate en het testen van monsters voor siderophore activiteit te genereren.

Een breed scala van chromatografische cultuur-gebaseerde of DNA-gebaseerde technieken kunnen worden toegepast, hetzij op de werkelijke microtiter goed of de glycerol bewaarde cultuur voor verdere biochemische tests of genetische karakterisering en metabole modellering. Door het gebruik van dit protocol kan siderophore-activiteit later worden gekoppeld aan specifieke organismen die verantwoordelijk zijn voor die activiteit of vervolgens worden gericht als een mechanisme voor grotere ecologische effecten. Dit protocol kan eenvoudig worden gewijzigd om de productie van zijropehoren te beoordelen in verrijkingsculturen die worden gegenereerd uit monsters die zijn verzameld uit andere milieucompartimenten, waaronder lucht, water en sedimenten.