Name: Xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een Cryo-Scanning elektronenmicroscoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Ontdek hoe cryo-SEM waterverdeling in xyleemcellen van houtachtige planten visualiseert zonder artefacten. Deze methode onthult seizoensvariaties en cavitatie door biotische stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI (nr. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Opmerking: een schematisch overzicht van dit protocol wordt weergegeven in Figuur 1.
1. bemonstering: spanning ontspanning binnen de kolom van het water van Xylem leidingen
Opmerking: de volgende spanning ontspanning behandeling wordt aanbevolen voor de LN2 aanvraag om zowel bevriezing en spanning te voorkomen-geïnduceerde artefacten in de Xylem waterdistributie.
<ol><li>Plaats een tak en laat voor bemonstering met een zwarte plastic zak om het water potentiaal tussen Xylem equilibrate en laat meer dan twee uur voor de bemonstering.</li>
	<li>Bepaal het water potentieel van ten minste twee bladeren uit het monster met behulp van een drukkamer of een psychrometer. Wanneer het water potentieel hoger is dan ca. − 0,5 MPa (dat wil zeggen, geen of zeer lage spanning bestaat), een monster kan worden geoogst na het invriezen (zie paragraaf 2: bevriezen fixatie). Wanneer het water potentieel lager is dan − 0,5 MPa, is een behandeling voor ontspanning nodig zoals hieronder beschreven.</li>
	<li>Bevestig een waterdichte kraag rond de stengel om gevuld te worden met water. Een plastic beker zonder bodem kan dienen als een waterdichte kraag. Zorg moet worden genomen om stevig afdichting van de ruimten tussen de stengel en de kraag met behulp van een plakband voor het voorkomen van lekkage van vloeibare media die later worden gebruikt. Voor het oogsten van flexibele stengels, zoals dunne takken of twijgen, zinken een snijgedeelte in een met water gevulde emmer door het buigen van de stengel. Snijd onder het wateroppervlak met behulp van snoeischaren of een zaag. Breng het monster naar een andere container van het water zo snel mogelijk te minimaliseren blootstelling van de cut-end aan de lucht.</li>
	<li>Houd het snij einde van het monster onder water. Voor loof soorten moet ervoor worden gezorgd dat de lengte vanaf de plaats waar een Cryo-monster voor SEM wordt verkregen aan de snijkant van de geoogste stam langer is dan de maximale lengte van de monsters om spanning te voorkomen – geïnduceerde artefacten in het Cryo-monster.</li>
	<li>Bedek het monster met bladeren met een zwarte plastic zak om transpiratie te verminderen. Houd de snede einde van het monster in het water en handhaven van deze voorwaarde voor ongeveer 30 min in om de Xylem spanning te ontspannen. Vermijd een langere ontspanningstijd (> 1 uur) als gevolg van mogelijke kunstmatige navulling van cavitated leidingen12.</li>
	<li>Meet het water potentieel opnieuw om de ontspanning van de Xylem spanning (bijna 0 MPa) te bevestigen. Opmerking: voorafgaand aan de bemonstering, moet de maximale vaartuig lengte van de doelsoort worden onderzocht of bepaald met soortgelijke monsters door de lucht injectie methode. Bij de bemonstering van een grote boom, of een grote tak, is het moeilijk om de spanning-ontspanningsprocedures beschreven hierboven te voeren. Daarom moeten monsters van grote bomen worden verzameld tijdens de predawn periode wanneer het Xylem water potentieel hoger is.</li>
</ol>2. Freeze fixatie met LN2
<ol><li>Knip en open een kant van een waterdichte kraag met een schaar of een utility mes. Bevestig de kraag rond de stengel met een plakband terwijl het diafragma horizontaal.</li>
	<li>Draag isolerende handschoenen/want, maar zorg ervoor dat de fles van LN2 veilig te houden, en voer LN2 in de kraag om het te vullen met ln2. Houd het gevuld door gestaag toe te voegen LN2 volledig te bevriezen het water in de Xylem. De tijd die nodig is voor het bevriezen is afhankelijk van de steekproefgrootte; 1 min na het koken van gegoten LN2 is voldoende voor een kleine takje of een zaailing, terwijl meer dan 20 min is nodig voor een stam van een grotere boom20. Voeg LN2 continu toe tijdens het bevriezen omdat het snel verdampt door grote temperatuurverschillen tussen LN2 en omgevingstemperaturen.</li>
	<li>Maak de kraag los van het bevroren gedeelte van de monster stam om LN2 na voldoende bevriezings tijd te verwijderen. Zorg ervoor dat u isolerende handschoenen te dragen om contact te vermijden met potentiële LN2 morsen veroorzaakt door het losmaken van de kraag.</li>
	<li>Oogst het monster met een fijne zaag onmiddellijk.</li>
	<li>Bedek de bevroren monster met een stuk aluminiumfolie of zet het in een monsterbuis, waarop monster ID nummers worden geschreven. Plaats het geoogste monster snel in een container gevuld met LN2 of pak in een geïsoleerde doos gevuld met droog ijs.</li>
	<li>Bewaar de monsters in een diepvriezer tot observatie. De aangewezen opslagtemperatuur is − 80 °C om ijs sublimatie en zijn herkristallisatie tijdens het opslaan te verhinderen.</li>
</ol>3. specimen voorbereiding
Opmerking: voor observatie moet een monster worden bijgesneden en moet het oppervlak voor observatie worden geschaafd bij een temperatuur van nul om de waterverdeling in zijn Xylem in situ te houden. Een biologisch microtome met een cryostat systeem (cryostat) is ideaal voor het trimmen en het blootstellen van het oppervlak van een specimen in dit type van observatie door Cryo-SEM.
<ol><li>Stel de temperatuur van het specimen kamer van de cryostat tot − 30 ° c, die meestal koud genoeg is om de Xylem sap van de meeste planten te houden in een bevroren toestand.</li>
	<li>Trim een monster in een klein stuk (< ca. 2 cm in hoogte en < ca. 1 cm in breedte of diameter) die kunnen worden aangepast voor de specimen houder van een Cryo-SEM. gebruik een scherp mes of een fijn getande zaag voor het trimmen om te voorkomen dat het breken van het ijs in het specimen. In het geval van een groter monster dat niet kan worden gesneden met een mes, snel pre-cut met een gekoelde zaag in een diepvries doos.</li>
	<li>Bevestig de bijgesneden stuk aan een boorkop, een houder voor een cryostat door montage op een weefselbevriezing inbedding medium (bijv. OCT compound) voor Cryo-sectioning. Bevestig vervolgens de boorkop aan een specimen houder van een microtome van de cryostat.</li>
	<li>Trim het oppervlak door herhaaldelijk scheren met 5 – 7 µm secties in dikte. Trimmen door het wegknippen van meer dan 1.000 tot 2.000 µm, in totale diepte van de initiële oppervlak bij monster collectie, is nuttig voor het elimineren van het beschadigde gedeelte van het monster veroorzaakt door pre-Cutting met een mes of zaag zoals beschreven in de stap 3,2.</li>
	<li>Na ruwweg het trimmen van een oppervlakte van het monster, pas een ongebruikt gedeelte van de microtome blad boven het oppervlak van het specimen. Laat het mes niet aan de steekproef die zou groter zijn dan de dikte instelling te raken.</li>
	<li>Voordat de eerste snede door de ongebruikte Blade gedeelte, iets breder de afstand tussen het oppervlak van het monster en het mes.</li>
	<li>Snijd het oppervlak van het monster slechts een of twee keer. Verder, schuif het mes opnieuw het aanpassen van een ongebruikt mes gedeelte op het oppervlak van het specimen.</li>
	<li>Herhaal de stappen 3,6 en 3,7 drie of vier keer. Dit is belangrijk om een duidelijk oppervlak te verkrijgen zonder "mes merken" (Figuur 4).</li>
	<li>Na de laatste snede, zet het mes de positie ver van het monster om te voorkomen dat stof te plakken op het monster.</li>
	<li>Maak de boorkop los van het specimen houder en maak het monster los van de boorkop door het bevroren inbedmiddel te verwijderen met een scherp mes. Zorg ervoor dat het specimen in de cryostat kamer wordt geplaatst om het geplante oppervlak van vorst stof te voorkomen.</li>
	<li>Bevestig het specimen aan een Cryo-SEM specimen houder met een weefsel bevriezend inbeddend middel in de cryostat kamer.</li>
</ol>4. Transfer naar de Cryo-SEM specimen kamer
Opmerking: het oppervlak-voor bereide specimen moet worden beschermd tegen een verhoging van de temperatuur of de accumulatie van vorst tijdens de overdracht van de cryostat kamer naar de observatiefase in de Cryo-SEM specimen kamer.
<ol><li>Handhaaf de koude stadium temperatuur in de Cryo-SEM specimen kamer bij lager dan-120 ˚ C met LN2 volgens de gebruikershandboek van de uitrusting.</li>
	<li>Plaats de specimen houder met het voor bereide specimen in een isolerende recipiënt gevuld met LN2 in de cryostat kamer.</li>
	<li>Houd het specimen houder met een specimen het uitwisselen van staaf onder LN2. Vermijd blootstelling van het specimen houder aan de lucht waar mogelijk.</li>
	<li>Snel zet het specimen houder van de Pre-evacuatie kamer van de Cryo-SEM specimen kamer zodra het starten van de evacuatie van de Pre-evacuatie kamer. Dan, plaats het specimen houder op de koude fase nadat de lucht volledig is geëvacueerd. Hoewel een beetje van de vorst accumulatie onvermijdelijk is, de "Freeze-ETS" procedure (stap 6) kan verwijderen.</li>
</ol>5. instelling in SEM
Opmerking: de typische instelling voor de waarneming wordt hieronder beschreven. Sommige wijzigingen zijn vereist, afhankelijk van de vacuüm conditie of elektronenbundel.
<ol><li>Stel de SEM parameters voor observatie als volgt: Versnelling voltage: 3 – 5 kV Temperatuur van het specimen stadium: < − 120 °C Detector: secundaire emissie</li>
</ol>6. Freeze-ETS
Opmerking: Freeze-ETS is de procedure voor accentueren de rand van de celwanden van de steekproef door lichte Ice Crystal sublimatie. Freeze-etsen impliceert ook het verwijderen van oppervlakte vorst stof.
<ol><li>Zet de versnelling spanning van de elektrische pistool tijdens Freeze-etsen. Het is beter om te voeren Freeze-etsen, terwijl het observeren van het specimen.</li>
	<li>Verhoog de temperatuur van het monster stadium tot − 100 °C.</li>
	<li>Wacht enkele minuten tot vorst stof wordt verwijderd en het oppervlak van het ijs in Xylem cellen is enigszins gedaald in vergelijking met de celwanden.</li>
	<li>Verlaag de temperatuur van het monster stadium tot − 120 °C. Opmerking: als er geen geïnstalleerde temperatuurregelaar voor het monster stadium, houd het specimen met behulp van de wissel stang en los het uit specimen fase voor een paar minuten. Observeer het specimen meerdere malen tijdens dit Freeze-ETS proces om de sublimatie status van het specimen te verifiëren.</li>
</ol>7. Metal coating (optioneel)
Nota: de recente verbeteringen aan het SEM instrument en de beeldverwerking kunnen de beelden van uitstekende kwaliteit van elektrische isolerende specimens zonder metaaldeklaag verstrekken. Niet-geleidende specimens, zoals biologische materialen, zijn echter soms onderworpen aan last; hogere helderheid op specifieke posities van het specimen als gevolg van accumulatie van elektronen ("opladen"). Het blootstellen van het specimen aan elektronenstralen voor een langere periode van tijd of voor een hoge vergroting, verhoogt de het laden gevolgen. Coating het oppervlak van het monster met elektrisch geleidende metalen materialen voorkomt het voorkomen van het opladen. Gebruik het vacuüm deklaag systeem dat binnen de Cryo-SEM eenheid wordt geïnstalleerd om de temperatuur van het specimen te verhinderen van het stijgen tijdens deklaag.
<ol><li>Zorg ervoor dat coating materiaal is geïnstalleerd op een aangewezen verdamper hoofd van het coating systeem.</li>
	<li>Behoud de temperatuur van het koude stadium in het deklaag systeem onder − 170 °C.</li>
	<li>Plaats de specimen houder op het koude stadium van het deklaag systeem na voldoende bevriezen-etsen.</li>
	<li>Open een partitie tussen het koude stadium en de verdamper hoofd.</li>
	<li>Stel de huidige waarde en de spanningswaarde van de verdamper in op respectievelijk ca. 30 mA en ca. 5 V.</li>
	<li>Verdampen van coating materiaal voor ca. 30 s om het oppervlak van het specimen te bedekken.</li>
	<li>Stel zowel de huidige als de spanningswaarden van de verdamper in op nul en sluit de partitie.</li>
	<li>Plaats het specimen houder op de koude fase van het specimen kamer voor observatie.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De Cryo-SEM observatiemethodes die in dit document worden geïntroduceerd zijn praktisch voor duidelijk het visualiseren van waterdistributie op een cellulaire schaal. Door middel van deze methode, het verkennen van de veranderingen in de verdeling van het water binnen Xylem kan potentieel helpen verduidelijken het mechanisme van boomsoorten tolerantie voor abiotische stress (watertekort of bevriezing) of biotische stress (boom ziekte).
De meest cruciale stap in deze methode is het behoud van d...

Beschikbaarheid van watervoorraden (dat wil zeggen, neerslag, bodem waterinhoud) bepaalt strikt de sterfte en de geografische spreiding van plantensoorten, omdat ze nodig hebben om water te absorberen uit de bodem en het vervoer naar de bladeren voor fotosynthetische productie. De installaties moeten hun systeem van het watervervoer onder fluctuerende watervoorraden handhaven. In het bijzonder, bosrijke planten genereren hoge spanningen in hun leidingen langs de transpiratie stromen als, in sommige gevallen, ze nodig hebben om hun kroon te houden meer dan ~ 100 m boven de grond. Om water kolommen onder zulk hoge negatieve druk te handhaven, bestaan de Xylem leidingen uit een continuüm van tubulaire cellen met stijve en hydrofobe-lignified celwanden1. De kwetsbaarheid voor Xylem dysfunctie van Xylem leidingen in elke soort is een goede determinant van de soorten overleving onder fluctuerende watervoorziening2. Bovendien is het bestuderen van de water status van Xylem leidingen belangrijk voor de evaluatie van de gezondheidstoestand van individuele bomen die aan abiotische of biotische spanningen worden onderworpen. Het meten van SAP flow of water potentiaal kan schattingen geven van de water status van een bosrijke plant door de geïntegreerde hydraulische functie van Xylem leidingen. Bovendien kan het visualiseren van de distributie van water in Xylem cellen de conditie van individuele componenten van het Xylem hydraulisch systeem verduidelijken.
Verscheidene technieken om de water status van Xylem leidingen te visualiseren bestaan3. De klassieke en nuttige methoden voor het observeren van waterwegen in woody weefsel te betrekken kleuring de waterkolom door het onderdompelen van de uiteinden van de gesneden takken in een kleurstof of door het injecteren van een kleurstof in staande boom stengels4. Zachte x-ray fotografie maakt het ook mogelijk de visualisatie van het waterdistributie van gesneden hout schijven als gevolg van de differentiële x-ray absorptie intensiteit van het vocht in Xylem5,6. Deze methodes, echter, verstrekken slechts sporen van water beweging of tonen macroscopische distributies van water aan. Onlangs, niet-destructieve observatietechnieken, zoals MicroFocus X-Ray computertomografie (µ CT)7, 8,9,10en Magnetic Resonance Imaging (MRI)11, 12, zijn significant verbeterd om observatie van water in Xylem leidingen binnen intacte jonge boompjes toe te staan. Deze niet-destructieve methoden hebben grote voordelen in dat we de water status van de Xylem kunnen observeren zonder kunstmatige snij effecten, en we kunnen water Stromingsdynamica volgen door sequentiële beeldvorming of een contrast agent10. Echter, we moeten gebruik maken van een aangepaste MRI voor plant Imaging of een gespecialiseerde faciliteit voor synchotron-based µ CT om de beelden die kunnen identificeren cellulaire niveau waterinhoud te verkrijgen. Bovendien, hoewel het synchotron-based µ CT-systeem in staat om fijne beelden te verkrijgen met een hoge ruimtelijke resolutie, die vergelijkbaar is met de Lichtmicroscopie7,8,9, levende cellen kunnen worden verwond door de straling van hoge energie röntgenstraal13,14. Gebruik maken van een Scanning elektronenmicroscoop waarin Cryo-units zijn geïnstalleerd (Cryo-SEM) is een zeer nuttige methode voor het nauwkeurig lokaliseren van het water in Xylem op een cellulair niveau, hoewel dit vereist destructief oogsten van de steekproef voor observatie. Om het water in Xylem leidingen vast te stellen, wordt een deel van de stengels (d.w.z. twijgen, takken of stengels) in situ bevroren door vloeibare stikstof (LN2). Observaties van het oppervlak van getrimd, bevroren specimens door Cryo-SEM bieden sterk vergrote beelden van de Xylem structuur van waaruit we kunnen het water in Xylem leidingen als ijs te identificeren. Een significante beperking van deze methode is dat de opeenvolgende observatie van water beweeglijkheid binnen de zelfde steekproef onmogelijk is. Nochtans, is de toepassing van µ CT of MRI voor opeenvolgende observatie van bomen die in een gebied leven uiterst uitdagend omdat deze instrumenten niet draagbaar zijn. In tegenstelling, Cryo-SEM heeft een potentieel voor het gebruik van deze techniek op grote bomen in veldexperimenten om duidelijk te visualiseren waterinhoud op niet alleen het cellulaire niveau, maar ook op een fijnere structuur niveau, bijvoorbeeld, water in intervasculaire pits15, water in intercellulaire ruimten16, of bellen in waterkolom17.
Veel studies observeren Xylem water door Cryo-SEM zijn gemeld 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) vestigde aanvankelijk het protocol voor observatie van Xylem in situ door bevriezen-bevestiging van een het leven boomstam via het vullen van LN2 in een container die op de steel wordt geplaatst21. De temperatuur van de steekproef werd gehandhaafd onder-20 °C tijdens steekproef inzameling en tijdens Cryo-SEM voorbereiding om het smelten van het ijs binnen Xylem leidingen te vermijden. Deze methode is gebruikt om het water in Xylem te observeren om de waterverdeling te verduidelijken onder een ander waterregime11,12,24,25,26, 27,28, de seizoensgebonden variatie van waterverdeling21,29,30, het effect van Freeze-ontdooicycli17,31, 32, de verdeling van water in nat hout5, veranderingen in de waterverdeling tijdens de overgang van spint naar heartwood20, seizoengebonden tijdsverloop van cambial activiteit en differentiatie van schepen33, en cavitatie geïnduceerd door bepaalde biotische beklemtoont23,34. Hydraulische geleidbaarheid en leidingen kwetsbaarheid voor cavitatie zijn ook geverifieerd met behulp van Cryo-SEM35,36. Cryo-SEM uitgerust met energie dispersieve röntgenstraal spectrometrie (EDX of EDS) is gebruikt om elementdistributie over de oppervlakte van een specimen te bestuderen dat water37bevat.
Freeze-fixatie van een levende stam die leidingen bevat onder hoge hydraulische spanning veroorzaakt soms kunstmatige cavitatie die worden waargenomen door Cryo-SEM als gebroken ijs kristallen in het lumen van de leidingen38,39. In het bijzonder, loof soorten met langere en bredere leidingen zijn kwetsbaar voor spanning-geïnduceerde artefacten, zoals cavitatie veroorzaakt doorsteek proef snijden, zelfs indien uitgevoerd onder water3,40. De artefacten van de cavitatie worden opvallend na bemonstering van een het transpireren boom (d.w.z., bemonstering tijdens de dag tijd) of onder strenge droogte voorwaarden en zij kunnen aan een overschatting van cavitatie voorkomen misleiden3,38, 39. Daarom moet de spanning die in de leidingen werkt worden vrijgegeven om de artefactuele cavitatie3,12,39te vermijden.
De Freeze-fractuur techniek met behulp van een mes geïnstalleerd in een specimen kamer wordt vaak gebruikt om het monster oppervlak bloot voor Cryo-SEM observatie. Nochtans, zijn de bevriezen-gebroken vliegtuigen van bosrijke installatie weefsels, vooral transversale secties van secundaire Xylem, te ruw om de anatomische eigenschappen en het water in het weefsel6duidelijk waar te nemen. De toepassing van een cryostat voor het trimmen van een specimen maakt een snelle en kwalitatief hoogwaardige voorbereiding van monster oppervlakken20,23mogelijk. Het algemene doel van deze methode is het verstrekken van bewijsmateriaal met elektronenmicroscopie resolutie van de waterverdeling in verschillende soorten Xylem cellen in situ zonder het voorkomen van bemonsterings artefacten. We introduceren onze geactualiseerde procedure, die gestaag is verbeterd sinds we voor het eerst aangenomen, met betrekking tot de bemonstering, trimmen en reinigen van het specimen oppervlak voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige elektronen micrografen van Cryo-vaste monsters van Xylem.

<table><tbody><tr><td>coating material</td><td>JOEL Ltd., Japan</td><td>Gouddraad, 0.50 &times; 1000 mm, 99.99 %, Onderdelen Nr. 125000499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cryo scanning elektronenmicroscoop</td><td>JOEL Ltd., Japan</td><td>JSM-6510 geïnstalleerd met MP-Z09085T / MP-51020ALS</td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX70</td><td></td></tr><tr><td>microtoomblad</td><td>Thermo Scientific</td><td>HP35 ULTRA wegwerp microtoombladen, 3153735</td><td></td></tr><tr><td>weefselvries inbeddingsmedium</td><td>Thermo Scientific</td><td>Shandon Cryomatrix inbeddingshars, 6769006</td><td></td></tr></tbody></table>

xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een cryo-scanning elektronenmicroscoop

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Een Scanning elektronenmicroscoop geïnstalleerd Cryo-Unit (Cryo-SEM) maakt specimen observatie op subzero temperaturen en is gebruikt voor het verkennen van waterdistributie in plantaardige weefsels in combinatie met Freeze fixatie technieken met behulp van vloeibare stikstof (LN 2). voor houtachtige soorten, echter, de voorbereidingen voor het observeren van de Xylem transversale-cut oppervlak te betrekken sommige problemen als gevolg van de oriëntatie van houtvezels. Bovendien, hogere spanning in de waterkolom in Xylem leidingen kan soms leiden tot artefactuele veranderingen in de waterdistributie, vooral tijdens de steekproef fixatie en collectie. In deze studie demonstreren we een efficiënte procedure om de waterverdeling binnen de Xylem van bosrijke planten in situ te observeren met behulp van een cryostat en Cryo-SEM. Op het eerste, tijdens de monsterverzameling, het meten van de Xylem water potentiaal moet bepalen of hoge spanning aanwezig is in de Xylem leidingen. Wanneer het Xylem water potentieel laag is (< ca. − 0,5 MPa), is een spannings ontspannings procedure nodig om een betere bewaring van de watertoestand in Xylem leidingen te vergemakkelijken tijdens steekproef bevriezen fixatie. Vervolgens is een waterdichte kraag bevestigd rond de boomstam en gevuld met LN2 voor het bevriezen van de fixatie van de watertoestand van Xylem. Na het oogsten moet ervoor worden gezorgd dat het monster bevroren blijft, terwijl de procedures voor de monstervoorbereiding voor observatie worden voltooid. Een cryostat wordt gebruikt om het Xylem transversale-besnoeiings oppervlak duidelijk bloot te stellen. In Cryo-SEM observaties, is de tijd aanpassing voor vorst-etsen vereist om vorst stof te verwijderen en de rand van de celwanden op de het bekijken oppervlakte te accentueren. Onze resultaten tonen de toepasbaarheid van Cryo-SEM technieken voor de observatie van de waterdistributie binnen Xylem op cellulaire en subcellulaire niveaus. De combinatie van Cryo-SEM met niet-destructieve in situ observatietechnieken zal de exploratie van de hout Stromingsdynamica van de plantaardige water diep verbeteren.

Representatieve beelden van dwars-gesneden oppervlakken van naald-en loofboom Xylem, waargenomen door Cryo-SEM, zijn weergegeven in Figuur 2. Bij lage vergroting, het zwarte gebied in de beelden geeft de holten van waaruit het water geheel of gedeeltelijk verdwijnt, en het grijze gebied geeft Xylem celwanden, cytoplasma, en water (Figuur 2a). Bij hoge vergroting is het duidelijk dat het water niet volledig verlor...

Het observeren van de waterdistributie binnen de Xylem geeft belangrijke informatie over de Water stromings dynamiek in bosrijke planten. In deze studie demonstreren we de praktische aanpak om Xylem waterdistributie in situ te observeren met behulp van een cryostat en Cryo-SEM, die artefactuele veranderingen in de water status elimineert tijdens de monstervoorbereiding.

Xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een Cryo-Scanning elektronenmicroscoop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Het algemene doel van dit protocol is ons te voorzien van elektromicroscopie resolutie van de waterverdeling in verschillende soorten xylem cellen in situ. Deze methode is gebruikt om het water in xylem te observeren om de waterverdeling en de veranderende waterregimes, de seizoensgebonden variatie van de waterverdeling, het effect van vries-/dooicycli, de verdeling van water in nat hout en cavitatie veroorzaakt door bepaalde biotische spanningen te verduidelijken. Freeze-fixatie van een levende stam onder hoge hydraulische spanningen veroorzaakt soms kunstmatige cavitaties, die door cryo-SEM worden waargenomen als gescheurde ijskristallen in het lumen van leiding.Deze bijgewerkte procedure richt zich op het verkrijgen van hoogwaardige aerotome micrografen van xylem zonder het artefact in de bemonsteringsprocedure. Levensvatbare demonstratie is van cruciaal belang omdat er een aantal belangrijke details zijn die niet gemakkelijk kunnen worden uitgelegd. Tegelijkertijd is het verkrijgen van training niet eenvoudig omdat slechts een paar laboratoria over de hele wereld deze methode beoefenen.Om deze procedure te beginnen, omsluit een tak en vertrekt voor bemonstering met een zwarte plastic zak om het waterpotentieel tussen xylem en bladeren meer dan twee uur vóór bemonstering te equilibrate. Met behulp van een drukkamer, bepalen het waterpotentieel van ten minste twee bladeren uit het monster. Wanneer het waterpotentieel hoger is dan ongeveer min 0,5 megapascals, kan een monster worden geoogst na het bevriezen.Wanneer het waterpotentieel lager is dan min 0,5 megapascals, gaat u verder met de behandeling voor ontspanning. Bevestig een waterdichte kraag rond de steel, die zal worden gevuld met water. Snijd met snoeischaar of een zaag de steel onder het wateroppervlak en houd het snijeinde van het monster onder water.Breng het monster zo snel mogelijk over naar een andere container met water om het einde van de snede aan de lucht zo min mogelijk bloot te stellen. Voor breedbladige soorten moet u ervoor zorgen dat de lengte van de plek waar cryomonster voor SEM zal worden verkregen tot de snijkant van de geoogste stengel langer is dan de maximale vatlengte van het monster om door spanning veroorzaakte artefacten in het crysoample te voorkomen. Bedek vervolgens het monster met een zwarte plastic zak om transpiratie te verminderen.Houd het gesneden uiteinde van het monster in het water en houd deze toestand ongeveer 30 minuten om de xylemspanning te ontspannen. Meet hierna het waterpotentieel opnieuw om de ontspanning van de xylemspanning te bevestigen. Gebruik eerst een schaar of een mes om een kant van een waterdichte kraag te snijden en te openen.Bevestig de kraag stevig rond de steel met plakband terwijl het diafragma horizontaal wordt gehouden. Trek isolerende handschoenen aan en houd het vat vloeibare stikstof veilig vast. Run vloeibare stikstof in de kraag totdat het vol is en houd het gevuld door gestaag extra vloeibare stikstof toe te voegen om het water in de xylem volledig te bevriezen.Na voldoende vriestijd moet u de kraag losmaken van het bevroren gedeelte van de monsterstam om de vloeibare stikstof te verwijderen. Gebruik onmiddellijk een fijne handzaag om het monster te oogsten. Bedek vervolgens het bevroren monster met een stuk aluminiumfolie of stop het terug in een monsterbuis.Plaats het geoogste monster snel in een container gevuld met vloeibare stikstof. Bewaar de monsters op min 80 graden Celsius tot klaar om de observatie uit te voeren. Om te beginnen stelt u de temperatuur van de monsterkamer van de cryostat in op min 30 graden Celsius, wat meestal koud genoeg is om het xylem sap van de meeste planten in bevroren toestand te houden.Gebruik een scherp mes of een fijngetande zaag om het monster te trimmen in een klein stukje dat kan worden aangepast voor de monsterhouder van een cryo-SEM. Monteer het bijgesneden stuk op een chuck, een houder voor een cryostat, met weefselbevriezingsmedium voor cryo-sectioning. Bevestig de klem aan een monsterhouder van een microtome van de cryostat.Trim het oppervlak door herhaaldelijk scheren uit vijf tot zeven micrometer dikke secties. Het wegsnijden van meer dan 1.000 tot 2.000 micrometer in totale diepte tot het oorspronkelijke oppervlak is nuttig voor het wegsnijden van het beschadigde gedeelte van het monster veroorzaakt door voorsnijden. Na het ruwlopen van een oppervlak van het monster, past u een ongebruikt gedeelte van het microtomeblad boven het oppervlak van het monster.Verbreed de afstand tussen het oppervlak van het monster en het blad iets. En snijd het oppervlak slechts een of twee keer. Schuif het blad vervolgens opnieuw en plaats een ongebruikt gedeelte van het blad op het oppervlak van het monster.Herhaal deze snijverwerking drie tot vier keer om een duidelijk oppervlak zonder messporen te verkrijgen. Stel na de laatste snede de positie van het blad ver van het monster in om te voorkomen dat er stof op het monster blijft plakken. En maak de chuck los van de microtome.Bevestig het monster vervolgens aan een cryo-SEM monsterhouder met weefselbevriezingsmedium in de cryostatkamer. Gebruik eerst vloeibare stikstof om een temperatuur onder min 120 Celsius te houden in de cryo-SEM-monsterkamer volgens de handleiding van de gebruiker van de apparatuur. Plaats vervolgens de monsterhouder met het geprepareerde exemplaar in een isolerende container gevuld met vloeibare stikstof in de cryostatkamer.Gebruik een monster wisselen staaf om het monster houder te houden onder de vloeibare stikstof. Breng de monsterhouder snel over naar de pre-evacuatiekamer van de cryo-SEM monsterkamer zodra de evacuatie van de pre-evacuatiekamer begint. Om te beginnen, zet de versnellingsspanning van het elektrische pistool.Verhoog vervolgens de temperatuur van het monster stadium tot min 100 graden Celsius. Wacht enkele minuten tot het vorststof is verwijderd en dat het oppervlak van het ijs in de xylemcellen iets is afgenomen ten opzichte van de celwanden. Dan, lager de temperatuur van de speiumen stadium tot min 120 graden Celsius.In deze studie worden cryo-SEM observatiemethoden gebruikt om de waterverdeling op cellulaire schaal duidelijk te visualiseren. Bij een lage vergroting geeft het zwarte gebied in de beelden de holtes aan waaruit water geheel of gedeeltelijk verdwijnt, terwijl het grijze gebied xylem celwanden, cytoplasma en water aangeeft. Bij hoge vergroting wordt het duidelijk dat het water niet volledig verloren gaat van de lumina van drie tracheids, wat wijst op het optreden van macrobellen in het xylem sap in situ.Met betrekking tot breedbladige soorten, cavitatie voorkomen is gemakkelijk gedetecteerd in vaten, terwijl het water bestaan is moeilijk te onderscheiden binnen vezels, vooral bij een lage vergroting. Cytoplasma en parenchyma cellen kunnen worden onderscheiden van water in tracheids of vaten door middel van ijsvlak texturen. Analyse van het effect van temperatuur op het vriesetsproces laat zien dat vorststof geleidelijk wordt gesublimeerd en en endotracehid pitmembranen duidelijker worden door de progressie van sublimatie met stijgende temperatuur.De resterende grote vorststofdeeltjes kunnen door verdere vries-etsen worden geëlimineerd. Maar dit kan problematisch zijn omdat het onnodig vermindert het oppervlak van ijs in xylem leidingen. De hoge kwaliteit van de waarneming wordt grotendeels bereikt door nauwkeurige specimenvoorbereiding.Vooral het gladstrijken van het oppervlak met het scherpe blad van de microtome is belangrijk. Onvoldoende gladstrijken door een gebruikt mes kan soms leiden tot een ruw oppervlak dat lijkt op mes merken, of kan leiden tot tal van gevallen van stof van de bezuinigingen. Monster bevriezing zonder de ontspanning van negatieve waterkolom druk zal leiden tot artefactuele inductie van cavitatie in xylem leidingen.Geclusterde ijskristallen worden waargenomen in vaten van specimens waar het monster niet was ontspannen. In tegenstelling tot contrasterend worden geen geclusterde ijskristallen waargenomen in de ontspannen monstermonsters met een vergelijkbaar waterpotentieel. De toepassing van vriesfixatie op transpirerende levende planten die lijden aan droogte kan leiden tot resultaat-gebaseerde artefacten zoals geclusterde ijskristallen.Die artefacten leiden tot verkeerde interpretaties van de watertoestand in xylem leiding. Het is dus belangrijk om eerst het waterpotentieel van monsters te bevestigen voordat de vriesfixatie wordt bevestigd. Hoewel deze procedure voorziet in een beeld van welke status in xylem leiding, een levende boom moet worden vernietigd voor de observatie.Het combineren van andere niet-invasieve observatiemethoden zoals MRI of micro-CT met dochteronderneming niveau beeldobservatie zal ons begrip van de aard tussen watertransport en gebruik verdiepen. De observatie van de watertoestand die door dit document wordt geïntroduceerd, zal ook een methode bieden voor de verduidelijking van de relatie van water dat wordt gemengd in cellen en andere anatomische reacties op abiotische of biotische stress. Cryo-SEM uitgerust met energiedispersieve x-ray spectroscopie of top sim zijn gebruikt om elementverdeling over het oppervlak van een monster met water te bestuderen.Het combineren van elementaire analyse en deze procedure in dat soortgelijke frame kan ons diepgaande kennis van de xylem cel gedrag in verband met water status. Bij het gebruik van vloeibare stikstof voor vriesfixatie van monsters in een kamer, vergeet dan niet om de kamer te ventileren om zuurstoftekort te voorkomen.

xylem-water-distribution-woody-plants-visualized-with-cryo-scanning

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Hoge resolutie x-ray tomografie (HRCT) is een niet-destructieve diagnostische beeldvormingstechniek die kan worden gebruikt om de structuur en functie van planten vasculatuur in 3D onderzoeken. We laten zien hoe HRCT vergemakkelijkt verkenning van xyleem netwerken over een breed scala van planten weefsels en soorten.

Met behulp van hoge resolutie Computed Tomography om de driedimensionale structuur en functie van Plant vaatstelsel Visualiseer

De samenstelling van de plantencelwand varieert tussen weefselsoorten en kan lignine, cellulose, hemicellulosen en pectine omvatten. Er zijn verschillende kleuringstechnieken ontwikkeld om verschillen op celtypeniveau te visualiseren. Dit artikel is een samenstelling van veelgebruikte celwandkleuringstechnieken.

Histochemische kleuring van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Secundaire celwand Elements

Hier presenteren we een protocol dat beschrijft hoe houten exemplaren moeten worden bemonsterd voor de algehele beoordeling van hun groeistructuren. Macro- en microscopische bereidings- en visualisatietechnieken die nodig zijn om een goed gerepliceerd en zeer gedetailleerd houtanatomisch en dendro-ecologisch dataset te genereren, worden beschreven.

Een technisch perspectief in Modern Boom-ring Onderzoek - Hoe Dendroecological en houtanatomische uitdagingen te overwinnen

Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Wij bieden een nieuwe methode om het contrast X-ray absorptie van maïs weefsel geschikt voor het scannen van gewone microcomputed-tomografie. Op basis van CT-beelden, introduceren we een set van beeldverwerking workflows voor verschillende maïs materialen effectief uitpakken microscopische fenotypes van vaatbundels van maïs.

Micron-schaal fenotypering technieken van maïs vaatbundels gebaseerd op de X-ray Microcomputed tomografie

Dit protocol presenteert hoe te leven van beeld en analyseren van de shoot apicale meristems van verschillende plantensoorten met behulp van laser scanning confocal microscopie.

Confocale Live beeldvorming van Shoot apicale Meristems van verschillende plantensoorten

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Micro-CT is een niet-destructief hulpmiddel dat plantstructuren in drie dimensies kan analyseren. Het huidige protocol beschrijft de monstervoorbereiding om micro-CT te gebruiken om de parasitaire plantstructuur en -functie te analyseren. Verschillende soorten worden gebruikt om de voordelen van deze methode te benadrukken in combinatie met specifieke preparaten.

Gebruik maken van micro-CT-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de histologische observatie van gallen geïnduceerd door Plasmodiophora brassicae. Vibratome-secties van hypocotylen worden gewist vóór fluorescentiebeeldvorming om de betrokkenheid van transcriptiefactoren en fytohormonen tijdens ziekteprogressie te bestuderen. Dit protocol overwint de beperkingen van de inbedding van hars, waardoor planta-visualisatie van fluorescerende eiwitten mogelijk wordt.

Clearing en fluorescentiemicroscopie combineren voor het visualiseren van veranderingen in genexpressie en fysiologische reacties op Plasmodiophora brassicae

Hier laten we zien hoe boomkernen kunnen worden verwerkt met een röntgencomputertomografie-toolchain. Behalve voor chemische extractie voor sommige doeleinden, is er geen verdere fysieke laboratoriumbehandeling nodig. De toolchain kan worden gebruikt voor schattingen van biomassa, voor het verkrijgen van MXD/boomringbreedtegegevens en voor het verkrijgen van kwantitatieve houtanatomiegegevens.

Boomkernanalyse met röntgencomputertomografie

Ontdek hoe cryo-SEM waterverdeling in xyleemcellen van houtachtige planten visualiseert zonder artefacten. Deze methode onthult seizoensvariaties en cavitatie door biotische stress.

Xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een Cryo-Scanning elektronenmicroscoop

Meer video's verkennen