Name: MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer microCT-beeldvorming van mariene ongewervelden zoals Actinia equina, Harmothoe sp. en Xenoturbella japonica. Deze methode maakt flexibele montage met alledaagse materialen mogelijk voor gedetailleerde 3D-morfologiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Toshihiko Shiroishi graag bedanken voor zijn hulp en voor het verstrekken van de onderzoeksomgeving tijdens deze studie. We zijn Kensuke Yanagi en Takato Izumi dankbaar voor advies over A. equinaen Masaatsu Tanaka voor advies over het Harmothoe SP. specimen. We willen de medewerkers van het Shimoda Marine Research Center, de Universiteit van Tsukuba en het Misaki Marine Biological station, de Universiteit van Tokio, bedanken voor hun hulp in sample collecties. We willen graag Editage (www.editage.jp) bedanken voor de Engelse taal bewerking. Dit werk werd gesteund door de JSPS-subsidie-in-Aid voor jonge wetenschappers (A) (JP26711022) aan HN en JAMBIO, Japanse Vereniging voor mariene biologie.

1. fixatie
<ol><li>Voor Actinia equina, ontspan de dieren in 10% MgCl2 zeewater voor ongeveer 15 min bij kamertemperatuur. Transfer naar 70% ethanol en bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voor Harmothoe SP., anesthetiseer de dieren door ze te plaatsen in ijskoud zeewater voor ongeveer 15 min. Transfer naar 10% (v/v) formaline oplossing met zeewater en bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voor Xenoturbella japonica, ontspan het dier met behulp van 7% MgCl2 in zoet water. Fix in 4% Paraformaldehyde (PFA) in gefilterd zeewater 's nachts. Plaats in 70% ethanol en bewaar bij 4 °C. Let op: PFA is gevaarlijk en moet voorzichtig behandeld worden.</li>
</ol>2. vlekken
<ol><li>Breng de monsters over naar 50% ethanol en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 15 uur. Vervang de 50% ethanol met 25% ethanol en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Opmerking: dit is niet nodig voor de Harmothoe SP. monster in 10% (v/v) formaline oplossing met zeewater.</li>
	<li>Vervang de oplossing door gedistilleerd water (DW) en bewaar de monsters in DW bij kamertemperatuur 2 uur. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Bereid 25% Lugol oplossing voor door de stockoplossing (onder) tot 25% te verdunen met DW. Stock oplossing (100% Lugol oplossing) bevat 10 g KI en 5 g I2, aangepast tot 100 ml met DW. Opmerking: Lugol-oplossing is lichtgevoelig, dus Bewaar en behandel de oplossing beschermd tegen licht. Volg de voorschriften van elk land en elke instelling voor de verwerking van jodium en afvalverwijdering.</li>
	<li>Decaner de DW uit de monsters en giet de 25% Lugol oplossing. Vlek gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.</li>
</ol>3. stage montage
<ol><li>Bereid 0,5% agarose door het oplossen van 500 mg agarose in 100 mL DW in een erlenmeyer van 250 mL in een magnetron (800 W, ongeveer 1-3 min). Koel tot ongeveer 30-40 °C door op kamertemperatuur te houden. Let op: niet oververhit raken of de erlenmeyer niet volledig afdichten bij het verwarmen om te voorkomen dat de agarose overkookt.</li>
	<li>Monteer grote monsters zoals a. equina met behulp van een 50 ml buis. Opmerking: gebruik 50 mL buizen voor het monteren van grote monsters die niet in een 1.000 μL micro pipet ' blauwe ' Tip passen.<ol>
<li>Plaats het gebeitst monster in een schaal van 60 mm met DW om overmatige kleurings oplossing van het oppervlak af te spoelen.</li>
		<li>Giet zachtjes 5 mL 0,5% agarose in een buis van 50 mL en verharden de agarose op ijs. Let op dat u geen bubbels in de agarose maakt.</li>
		<li>Voeg zachtjes 20 mL 0,5% agarose toe aan de buis van 50 mL en plaats op ijs totdat de agarose begint te harden. Plaats het preparaat binnen de 0,5% agarose met behulp van een tang. Let op dat u geen bubbels in de agarose maakt.</li>
		<li>Pas de positie en oriëntatie van het monster met de Tang en verharden de agarose op ijs.</li>
		<li>Plaats klei op de microCT montage fase en stel de 50 mL buis op de klei (Figuur 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monteer kleine monsters zoals Harmothoe SP. en X. japonica met behulp van een 1.000 μL micro pipet ' Blue ' tip. Opmerking: voor kleinere monsters kan 200 μL micro pipet ' gele ' tip worden gebruikt. Gebruik in dit geval 30 μL agarose voor de stekker en voeg 200 μL agarose of gedistilleerd water toe.<ol>
<li>Trek 100 μL van 0,5% agarose op in een micro pipet ' Blue ' van 1.000 μL en verharden de agarose door de punt over ijs te houden, waardoor er een stekker in de punt zit (Figuur 2B-a).</li>
		<li>Decante het gebeitst monster in een 60-mm schaal zonder gebruik van een tang.</li>
		<li>Breng het monster voorzichtig over met ring pincet in een andere 60-mm schaal met DW om overmatige kleurings oplossing van het oppervlak af te spoelen.</li>
		<li>Voeg met behulp van een micro pipet 1.000 μL van 0,5% agarose of DW toe aan de aangesloten punt (stap 3.3.1). Opmerking: gebruik van 0,5% agarose wordt aanbevolen, maar gebruik DW voor fragiele of kostbare monsters waarin agarose moet worden vermeden.</li>
		<li>Breng het monster voorzichtig over van de 60-mm schaal in de agarose of DW in de ingeplugde tip met ring pincet.</li>
		<li>Stel de positie en de oriëntatie van het monster voorzichtig in met een petiolaat naald of precisie pincet. Let op dat u geen bubbels in het afdekmedium maakt. Zorg ervoor dat het monster stabiel is tussen de wanden van de tip wanneer DW als montage medium wordt gebruikt (figuur 2D-b). Plaats de punt op ijs om de agarose te verharden als het wordt gebruikt als afdekmedium.</li>
		<li>Snijd de tip van een nieuwe 1.000 μL micro pipet ' blauwe ' Tip (Figuur 2B-b, c) en steek de punt van de aangesloten punt in de nieuwe tip.</li>
		<li>Plaats klei op de microCT montage fase en stel de uiteinden in met het monster binnenin op de klei (Figuur 2C, D). Opmerking: de kleurings oplossing begint het monster af te spoelen zodra het in DW is geplaatst, dus ga snel naar de volgende scan stap.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MicroCT Scanning
<ol><li>Schakel de X-Ray Beam in op 80 kV, 100 μA.</li>
	<li>Terwijl u de X-Ray transmissie afbeelding in het midden van het scherm (Figuur 3a) observeert, verplaatst u het werkgebied zodanig dat het hele monster zichtbaar is door op de X -en Z-as -knoppen (Figuur 3a) te klikken en handmatig aanpassen van de Y-as-knop op de montage fase (Figuur 3b). Stel het contrast van de afbeelding zo in dat de inwendige structuren kunnen worden geobserveerd door de contrast omstandigheden aan te passen (Figuur 3A: beeldcontrast).</li>
	<li>Pas de oriëntatie van het monster aan door de hoek van de buis/punt in de klei te veranderen (Figuur 2a). Draai het werkgebied 90 ° door de rotatie-as (Figuur 3a) in te stellen op 90 en te klikken op de relatieve bewegingsknop (Figuur 3a). Voer dezelfde manoeuvre vier keer uit om een volledige rotatie te voltooien. Opmerking: Schakel de X-Ray Beam handmatig uit telkens wanneer de voorbeeld deur wordt geopend, tenzij het systeem automatisch wordt uitgeschakeld.</li>
	<li>Verplaats het werkgebied zodat het monster zich in het midden van de weergave bevindt door op de knop Z-as (Figuur 3A) te klikken en door de Y-as-knop op de montage fase handmatig aan te passen (Figuur 3B). Draai het werkgebied met 90 ° en doe hetzelfde. Draai de stage 360 ° en controleer of het monster vanuit alle richtingen in het midden van de weergave staat.</li>
	<li>Verplaats het werkgebied langs de x-as naar de X-Ray Beam-bron door op de x-as -knop (afbeelding 3A) te klikken om het monster te vergroten en zo nodig aan te passen, zodat het gewoon in de weergave past (Figuur 3C).</li>
	<li>Draai de stage 360 ° en pas deze zo nodig aan zodat het monster vanuit alle richtingen in het zicht past.</li>
	<li>Pas de scan condities aan zoals weergegeven in tabel 1.</li>
	<li>Beginnen met scannen; het duurt ongeveer 10 minuten.</li>
</ol>5. beeld reconstructie
<ol><li>Start de accessoiresoftware van het microCT-systeem (Zie de tabel met materialen) en open de gescande gegevens.</li>
	<li>Pas tijdens het scannen de verschillen in de rotatie-as van het monster aan door te klikken op de knop automatische verschuiving waarde berekenen (afbeelding 4A: groen kader).</li>
	<li>Pas de oriëntatie van de afbeelding aan door de oranje pijlen te roteren (Figuur 4B). Als de afdrukstand is gewijzigd, herhaalt u stap 5,2.</li>
	<li>Klik op het tabbladgebied (Figuur 4c: magenta doos) en snijd gebieden waar geen monsters aanwezig zijn (Figuur 4c: gele doos).</li>
	<li>Klik op het tabblad opnieuw configureren (afbeelding 4D: magenta vak) en stel de filters als volgt in om ruis te verwijderen. Ring artefact Verminder filter: mediaan filter-3; Noise eliminatie filter: gemiddelde filter-1.</li>
	<li>Voer een herconfiguratie uit door op de knop opnieuw configureren te klikken (afbeelding 4D: groene doos).</li>
	<li>Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan door de zwart-witwaarden in te stellen als zwarte waarde 0, witte waarde 250 (afbeelding 4D: blauw kader).</li>
	<li>Sla de gereconstrueerde TIFF-afbeeldingsgegevensset op als een 8-bits TIFF door op de knop Opslaan te klikken. Wijzig de naam van TIFF-bestanden als volgt: Date_sample_resolution (μm) _number. TIFF. Opmerking: de oorspronkelijke microCT-gegevenssets uit deze studie zijn beschikbaar in de Figshare repository, DOI: 10.6084/M9. figshare. 767083736.</li>
</ol>6. gegevensanalyses
<ol><li>Start de data-analyse software (Zie de tabel met materialen) en schakel het importeren van TIFF-bestanden in door op het database pictogram te klikken (afbeelding 5A: magenta) en het vakje uit te schakelen dat wordt weergegeven in afbeelding 5B.</li>
	<li>Klik op het pictogram importeren (afbeelding 5C: magenta-vak), selecteer de gegevensset die is opgeslagen in sectie 5 en klik op openen.</li>
	<li>Klik op de knop koppelingen kopiëren (afbeelding 5D) om de gegevens te importeren.</li>
	<li>Geef de 2D-dwarsdoorsnede weer door op het pictogram van de 2D-Viewer te klikken (afbeelding 5C: blauw kader).</li>
	<li>Kalibreer de gegevensset door te klikken op het tabblad 3D-viewer (afbeelding 5E: magenta) en de resolutie waarde op te geven bij het scannen (0,018 in deze studie [Figuur 5F]).</li>
	<li>Klik op het pictogram helderheid/contrast (afbeelding 5E groene doos). Pas de helderheid en het contrast aan door de cursor in de weergegeven 2D-afbeelding te verplaatsen en het venster niveau en de vensterbreedte te wijzigen (Figuur 5G).</li>
	<li>Controleer andere doorsnede afbeeldingen door de schuifbalk te verplaatsen (afbeelding 5G: doos).</li>
	<li>Verander de oriëntatie van de dwarsdoorsnede door op het oriëntatie pictogram te klikken (afbeelding 5E: blauw kader) en controleer de beelden op alle oriëntaties (Figuur 5H).</li>
	<li>Klik op de weergegeven afbeelding en kies het tabblad exporteren om doorsnede afbeeldingen op te slaan.</li>
</ol>

<ol><li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Greenbaum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+CLARITY%3A+clearing%2C+imaging%2C+and+computational+analysis+of+osteoprogenitors+within+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow.</a> Science Translational Medicine. 9, (2017).</li>
<li>Konno, A., Okazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous-based+tissue+clearing+in+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Aqueous-based tissue clearing in crustaceans.</a> Zoological Letters. 4, 13(2018).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiology%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9, 11(2009).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
<li>Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+3D+phenotyping+of+cardiovascular+development+in+mouse+embryos+by+micro-CT+with+iodine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining.</a> Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomographic+imaging+of+intact+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).</li>
<li>Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+three-dimensional+microscopic+imaging+in+marine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology%22%5BJournal%5D)">The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology.</a> Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).</li>
<li>Mizutani, R., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomography in biology.</a> Micron. 43, 104-115 (2012).</li>
<li>Merkle, A. P., Gelb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+3D+X-ray+microscopy+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory.</a> Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).</li>
<li>Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZiegler%2C+A+%22Computation+for+humanity.+Information+technology+to+advance+society%22">Computation for humanity. Information technology to advance society</a>. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).</li>
<li>Gignac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+iodine-based+contrast-enhanced+computed+tomography+%28diceCT%29%3A+an+emerging+tool+for+rapid%2C+high-resolution%2C+3-D+imaging+of+metazoan+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues.</a> Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).</li>
<li>du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+x-ray+micro-computed+tomography%3A+a+user+guideline+for+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples.</a> GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).</li>
<li>Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography%3A+Introducing+new+dimensions+in+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22ZooKeys%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy.</a> ZooKeys. 263, 1-45 (2013).</li>
<li>Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tissues+in+3D+via+X-ray+tomography%3A+simple+contrasting+methods+allow+high+resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging.</a> PLoS One. 8 (9), 75295(2013).</li>
<li>Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sine+Systemate+Chaos%3F+A+Versatile+Tool+for+Earthworm+Taxonomy%3A+Non-Destructive+Imaging+of+Freshly+Fixed+and+Museum+Specimens+Using+Micro-Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography.</a> PLoS One. 9 (5), 96617(2014).</li>
<li>Paterson, G. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+using+micro-computed+tomography+in+gross+and+microanatomical+assessments+of+polychaetous+annelids%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+Museum+Victoria%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids.</a> Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).</li>
<li>Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+micro-CT+become+an+essential+tool+for+the+21st+century+taxonomist%3F+An+evaluation+using+marine+polychaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes.</a> Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).</li>
<li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+limitations+of+X-ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy%3A+a+methodological+and+comparative+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).</li>
<li>Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+describing+brooding+in+three+species+of+South+African+brittle+stars%2C+comprising+seven+high-resolution%2C+micro+X-ray+computed+tomography+scans%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans.</a> GigaScience. 4 (1), 52(2015).</li>
<li>Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+king+crab+Hapalogaster+mertensii+Brandt%2C+1850+%28Anomura%3A+Paguroidea%3A+Hapalogastridae%29+-+new+insights+into+the+evolutionary+transformation+of+hermit+crabs+into+king+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Contributions+to+Zoology%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs.</a> Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).</li>
<li>Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+X-ray+micro-computed+tomography+for+soft-bodied+and+gelatinous+cnidarians+with+emphasis+on+scyphozoan+and+cubozoan+statoliths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths.</a> Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).</li>
<li>Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+End+of+the+Cold+Loneliness%3A+3D+Comparison+between+Doto+antarctica+and+a+New+Sympatric+Species+of+Doto+%28Heterobranchia%3A+Nudibranchia%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia).</a> PLoS One. 11 (7), 0157941(2016).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+species+of+Xenoturbella+from+the+western+Pacific+Ocean+and+the+evolution+of+Xenoturbella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella.</a> BMC Evolutionary Biology. 17, 245(2017).</li>
<li>Tsuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KNOTTED1+Cofactors%2C+BLH12+and+BLH14%2C+Regulate+Internode+Patterning+and+Vein+Anastomosis+in+Maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize.</a> Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).</li>
<li>Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+annelid+anatomy+using+micro-computed+tomography%3A+A+taxonomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Zoologischer+Anzeiger%22%5BJournal%5D)">Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach.</a> Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).</li>
<li>Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+avatars+for+Myriapods%3A+Complete+3D+morphology+of+type+specimens+transcends+conventional+species+description+%28Myriapoda%2C+Chilopoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda).</a> PLoS One. 13 (7), 0200158(2018).</li>
<li>Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemones+through+X-rays%3A+visualization+of+two+species+of+Diadumene+%28Cnidaria%2C+Actiniaria%29+using+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Museum+Novitates%22%5BJournal%5D)">Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT.</a> American Museum Novitates. 3907, (2018).</li>
<li>Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+imaging+applied+to+description+of+a+new+species+of+Pagurus+Fabricius%2C+1775+%28Crustacea%3A+Decapoda%3A+Anomura%3A+Paguridae%29%2C+with+selection+of+three-dimensional+type+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data.</a> PLoS One. 13 (9), 0203107(2018).</li>
<li>Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+micro-computed+tomography+as+a+minimally+invasive+tool+for+anatomical+study+of+bivalves+%28Mollusca%3A+Bivalvia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia).</a> Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).</li>
<li>Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSasaki%2C+T+%22Biomineralization%22">Biomineralization</a>. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).</li>
<li>Maeno, A., Tsuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+Tomography+to+Visualize+Vascular+Networks+in+Maize+Stems%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems.</a> Bio-protocol. 8 (1), 2682(2018).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+to%3A+A+new+species+of+Xenoturbella+from+the+western+Pacific+Ocean+and+the+evolution+of+Xenoturbella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella.</a> BMC Evolutionary Biology. 18, 83(2018).</li>
<li>Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+files+from+%27Microfocus+X-ray+computed+tomography+%28microCT%29+imaging+of+Actinia+equina+%28Cnidaria%29%2C+Harmothoe+sp.+%28Annelida%29%2C+and+Xenoturbella+japonica+%28Xenacoelomorpha%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22figshare%22%5BJournal%5D)">MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'.</a> figshare. , (2019).</li>
<li>Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+specimen+shrinkage+in+iodine-enhanced+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT.</a> Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).</li>
<li>Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+shrinkage+of+bone%2C+brain+and+muscle+tissue+in+sample+preparation+for+micro-CT+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM).</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).</li>
<li>Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+of+mechanical+inaccuracies+in+micro-CT+and+nano-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT.</a> Proceedings of SPIE. 7078, 70781(2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Fixatieven die formaline gebruiken, zoals de 10% (v/v) formaline oplossing in zeewater die in deze studie wordt gebruikt, zijn gekend om de morfologie van diverse mariene ongewervelde dieren te behouden en worden vaak gebruikt voor microct-beeldvorming18,24,25 ,26,28,30,33. Beperkingen op h...

Biologische onderzoekers hebben over het algemeen dunne secties moeten maken en waarnemingen moeten verrichten door licht of elektronenmicroscopie om de inwendige structuren van ondoorzichtige organismen te onderzoeken. Deze methoden zijn echter destructief en problematisch wanneer ze worden toegepast op zeldzame of waardevolle specimens. Bovendien zijn verschillende stappen in de methode, zoals insluiten en snijden, tijdrovend en kan het enkele dagen duren voordat een voorbeeld wordt nageleefd, afhankelijk van het protocol. Bovendien, bij het hanteren van tal van secties, is er altijd een mogelijkheid van beschadiging of verlies van sommige secties. Weefsel clearing technieken zijn beschikbaar voor sommige specimens1,2,3,4,5 maar zijn nog niet van toepassing op veel diersoorten.
Om deze problemen te overwinnen, zijn sommige biologen begonnen met het gebruik van micro focus röntgenfoto computertomografie (microct) beeldvorming6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. In X-Ray CT wordt het preparaat bestraald met röntgenstralen vanuit verschillende hoeken die worden gegenereerd uit een röntgenbron die rond het monster beweegt, en worden de verzonden röntgenstralen bewaakt door een detector die ook rond het monster beweegt. De verkregen X-Ray transmissiegegevens worden geanalyseerd om transversale beelden van het preparaat te reconstrueren. Deze methode maakt de observatie van interne structuren mogelijk zonder vernietiging van het monster. Vanwege de veiligheid en het gemak, het wordt vaak gebruikt in medische en tandheelkundige toepassingen, en CT-systemen kunnen worden gevonden in ziekenhuizen en tandheelkundige centra wereldwijd. Bovendien wordt industriële X-Ray CT vaak gebruikt voor het observeren van niet-medische monsters voor inspectie en metrologie in het industriële gebied. In tegenstelling tot de medische CT, waarin de röntgenbron en de detectoren mobiel zijn, zijn de twee onderdelen bevestigd in industriële CT, waarbij het monster wordt gedraaid tijdens het scannen. Industriële CT produceert over het algemeen hogere resolutie beelden dan medische CT en wordt aangeduid als microCT (micrometer-niveau resolutie) of nanoCT (nanometer-niveau resolutie). Onlangs is onderzoek met behulp van microct snel toegenomen in verschillende gebieden van de biologie14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
Biologische studies met behulp van CT aanvankelijk gerichte interne structuren die voornamelijk bestaan uit harde weefsel, zoals bot. Vooruitgang in kleurings technieken met behulp van verschillende chemische agentia stelde de visualisatie van zachte weefsels in verschillende organismen6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. van deze reagentia zijn op jodium gebaseerde contrastmiddelen relatief veilig, goedkoop en kunnen worden gebruikt voor de visualisatie van zachte weefsels in verschillende organismen7,14. Wat mariene ongewervelde dieren betreft, is microct op grote schaal gebruikt voor dergelijke diersoorten, zoals weekdieren6,25,32,33, tot18,19, 20 , 28, en arthoropods21,23,29,31. Er zijn echter weinig rapporten over andere dier fyla, zoals bryozoërs6, xenacoelomorphs26en cnidariërs24,30. Over het algemeen zijn er minder studies met behulp van microCT op mariene ongewervelde dieren dan die op gewervelde dieren. Een belangrijke reden voor dit beperkte gebruik op mariene ongewervelde dieren is de enorme diversiteit die in deze diersoorten wordt waargenomen. Door hun uiteenlopende afmetingen, morfologieën en fysiologieën reageert elke soort verschillend op verschillende experimentele procedures. Daarom is het van cruciaal belang tijdens de monstervoorbereiding om de meest geschikte fixatie-en kleurings reagens te kiezen en voorwaarden vast te stellen bij elke stap, aangepast voor elke soort. Evenzo is het ook noodzakelijk om de scan configuraties in te stellen, zoals de montagemethode, spanning, stroom, mechanische vergrotings snelheid en het ruimte resolutievermogen, op passende wijze voor elk monster. Om dit probleem te overwinnen, een eenvoudige en begrijpelijke handleiding die alle van de nodige stappen dekt, legt uit hoe elke stap kan worden aangepast afhankelijk van het specimen, en toont gedetailleerde voorbeelden uit meerdere monsters is essentieel.
In de huidige studie beschrijven we het microCT Imaging protocol stap voor stap, van monster fixatie tot gegevensanalyse, met behulp van drie ongewervelde mariene soorten. Specimens van de zeeanemonen Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) werden verzameld in de buurt van het Misaki Marine Biological station, de Universiteit van Tokio. Ze hadden een sferische, zachte Body die ongeveer 2 cm in diameter was (Figuur 1a-C). Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) monsters werden ook verzameld in de buurt van Misaki Marine Biological station. Het waren slanke wormen die ongeveer 1,5 cm lang waren, met stoere chaetae aanwezig langs het hele lichaam (figuur 1d). Een Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) specimen werd verzameld in de buurt van Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, tijdens het 13e JAMBIO Coastal organisme joint Survey. Het was een zacht-bodied worm die ongeveer 0,8 cm lang was (Figuur 1e). Aanpassingen voor de voorwaarden en configuraties van elk monster worden gedetailleerd toegelicht. Onze studie biedt verschillende suggesties voor het uitvoeren van microCT-beeldvorming op mariene ongewervelde dieren, en we hopen dat het biologen zal inspireren om dit protocol voor hun onderzoek te gebruiken.

<table><tbody><tr><td>250-ml Erlenmeyer kolf</td><td>Corning</td><td>CLS430183</td><td></td></tr><tr><td>5-ml Bemonsteringsbuis ST-500</td><td>BIO-BIK</td><td>103010</td><td></td></tr><tr><td>50-ml Polypropyleenbuis</td><td>Greiner Bio One International</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>60-mm Onbehandelde Schaal</td><td>IWAKI</td><td>1010-060</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>Ecologische tip (blauw) 1000 &micro;l</td><td>BMBio</td><td>BIO1000RF</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>057-00451</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>061-00416</td><td></td></tr><tr><td>Jodium</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>094-05421</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>OsiriX DICOM Viewer</td><td>Pixmeo SARL</td><td>OsiriX MD v10.0</td><td>https://www.osirix-viewer.com</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Petiolate naald</td><td>AS ONE</td><td>2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200 Micropipet</td><td>GILSON</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000 Micropipet</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumjodide</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>166-03971</td><td></td></tr><tr><td>Precisiepincet 5</td><td>DUMONT</td><td>0302-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>QuickRack MultI fit tip (geel) 200 ul</td><td>Sorenson</td><td>10660</td><td></td></tr><tr><td>Scheermessen</td><td>Feather</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Ringpincet</td><td>NAPOX</td><td>A-26</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopisch microscoop</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>X-ray Micro-CT beeldvormingssysteem</td><td>Comscantechno</td><td>ScanXmate-E090S105</td><td></td></tr></tbody></table>

microfocus x-ray ct (microct) beeldvorming van actinia equina (cnidaria), harmothoe sp. (annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Traditioneel hebben biologen moeten vertrouwen op destructieve methodes zoals snijden om de interne structuren van ondoorzichtige organismen te onderzoeken. Niet-destructieve micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging is uitgegroeid tot een krachtig en opkomende protocol in de biologie, als gevolg van technologische vooruitgang in monster kleurings methoden en innovaties in microCT hardware, processing computers, en data analyse software. Dit protocol wordt echter niet vaak gebruikt, zoals het is in de medische en industriële gebieden. Een van de redenen voor dit beperkte gebruik is het ontbreken van een eenvoudige en begrijpelijke handleiding die alle noodzakelijke stappen omvat: monsterverzameling, fixatie, kleuring, montage, Scanning en gegevensanalyses. Een andere reden is de enorme diversiteit van metazoanen, met name mariene ongewervelde dieren. Door de uiteenlopende afmetingen, morfologieën en fysiologieën van mariene ongewervelde dieren is het van cruciaal belang om de experimentele omstandigheden en hardwareconfiguraties bij elke stap aan te passen, afhankelijk van het monster. Hier worden microCT-beeldvormingsmethoden gedetailleerd toegelicht met behulp van drie phylogenetisch diverse mariene ongewervelde dieren: Actinia equina (anthozoa, Cnidaria), Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) en xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Er worden ook suggesties gegeven voor het uitvoeren van microCT-beeldvorming op verschillende dieren.

We voerden microCT Imaging op A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida), en X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) na kleuring van de monsters met 25% Lugol oplossing. De kleuring heeft het contrast van de inwendige structuren in alle specimens met succes verbeterd, waardoor waarnemingen van interne zachte weefsels mogelijk zijn (Figuur 6). Samen met verslagen uit het verleden6,7...

Hier worden protocollen voor het uitvoeren van micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging van drie mariene ongewervelde dieren gedetailleerd uitgelegd. Deze studie beschrijft stappen zoals monster fixatie, kleuring, montage, Scanning, beeld reconstructie en data-analyses. Suggesties over hoe het protocol kan worden aangepast voor verschillende monsters worden ook verstrekt.

MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...

Micro CT is niet op grote schaal toegepast op mariene ongewervelde dieren vanwege hun diversiteit in morfologie. Onze methode maakt het eenvoudig monteren van monsters onder elke hoek die geschikt is voor zijn morfologie. Het kan worden uitgevoerd met gemeenschappelijke materialen, zoals water, klei en buizen, en indien van toepassing, op monsters met een verscheidenheid aan vormen, van een lange worm tot een ronde bal.Het aantonen van de procedure zal Akiteru Maeno, een technicus aan het National Institute of Genetics, Japan. Om te beginnen, bereiden 0,5%agarose door het oplossen van 500 milligram agarose in 100 milliliter gedestilleerd water in een 250-milliliter conische kolf, en plaats de fles in een magnetron op het vermogen van 800 watt te verwarmen ongeveer een tot drie minuten. Koel de kolf af op kamertemperatuur.Om grote monsters te monteren die niet passen in een 1000-microliter micropipet blauwe punt, zoals A.equina, plaats eerst het gekleurde monster in een 60-millimeter schotel met gedestilleerd water af te wassen overmatige kleuring oplossing van het oppervlak. In een 50-milliliter buis, voorzichtig giet vijf milliliter van 0,5%agarose zonder bellen te maken. Leg de buis op ijs om de agarose te verharden.Voeg vervolgens 20 milliliter van 0,5% agarose toe aan de buis, plaats op ijs totdat de agarose begint te verharden en gebruik tangen om het monster in de agarose te plaatsen. Pas de positie van het monster zo aan dat de carrosserieas verticaal is. Verhard de agarose op ijs.Plaats klei op het microCT montagestadium en zet de 50 milliliter buis op de klei. Om kleine monsters te monteren die passen in een 1000-microliter micropipet blauwe punt, zoals Harmothoe sp. en X.japonica, decanteren het gekleurde monster in een 60-millimeter schotel zonder gebruik te maken van tangen.Breng met ringcet een pincet de monsters voorzichtig over in een andere schaal van 60 millimeter gevuld met gedestilleerd water om overmatige kleuroplossing van het oppervlak af te wassen. Vervolgens opstellen 100 microliters van 0,5%agarose in een 1000-microliter micropipet blauwe punt en plaats het op ijs te verharden. Bij de behandeling van Harmothoe sp.voeg 1000 microliter van 0,5% agarose toe aan de agarose plug in de tip. Gebruik ring pincet om harmothoe sp. voorzichtig over te brengen van de 60-millimeter schotel in de agarose oplossing in de tip.Met een petiolate naald of precisie pincet, pas de positie en oriëntatie van de Harmothoe sp. zodat de chaetae niet onnatuurlijk gebogen. Zorg ervoor dat er geen bubbels aanwezig zijn, en plaats het puntje op ijs om de agarose te verharden.Gebruik bij het hanteren van breekbare monsters zoals X.japonica een micropipet om 1000 microliters gedestilleerd water toe te voegen aan de blauwe punt met de geharde agarose plug. Plaats de X.Japonica in het gedestilleerde water zodat deze stabiel is tussen de wanden van de tip. Voor kleinere monsters kan een 200-microliter micropipet gele punt worden gebruikt.Gebruik in dit geval 30 microliter agarose voor de stekker en voeg 200 microliter agarose of gedestilleerd water toe. Snijd vervolgens de punt af van een nieuwe, 1000-microliter micropipet blauwe punt en steek de punt van de aangesloten tip in de nieuwe tip. Plaats klei op de microCT montage fase en zet de tips met het monster binnen op de klei.Schakel onmiddellijk na het monteren van de monsters de röntgenstraal op bij 80 kilovolt en 100 microamps. Tijdens het observeren van de röntgentransmissieafbeelding verplaatst u het podium zodat het hele monster kan worden gezien door op de x- en z-asknoppen te klikken en door de y-asknop handmatig aan te passen op het montagestadium. Pas de contrastvoorwaarden van de afbeelding aan, zodat de interne structuren kunnen worden waargenomen.Pas de oriëntatie van het monster aan door de hoek van de buis in de klei te veranderen. Draai het stadium 90 graden door de rotatieas in te stellen op 90 en op de knop Relatieve beweging te klikken. Voer dezelfde manoeuvre vier keer uit om een volledige rotatie te voltooien.Schakel de röntgenstraal handmatig uit telkens wanneer de monsterdeur wordt geopend, tenzij het systeem deze automatisch uitschakelt. Klik nu op de z-as knop en stel handmatig de y-as knop aan om de montagefase te verplaatsen, zodat het monster zich in het midden van de weergave bevindt. Draai het podium met 90 graden en pas het monster opnieuw aan het midden aan.Draai het podium nog drie keer 90 graden en pas zo nodig aan om er zeker van te zijn dat het monster zich vanuit alle richtingen in het midden van het uitzicht bevindt. Klik vervolgens op de x-as knop om het podium langs de x-as naar de x-ray beam bron te verplaatsen om het monster te vergroten, en aan te passen als dat nodig is, zodat het gewoon past in de weergave. Draai het podium en pas zo nodig aan om er zeker van te zijn dat het monster vanuit alle richtingen in het zicht past.Pas de scanomstandigheden aan en begin vervolgens met scannen. In dit experiment werd microCT imaging uitgevoerd op Actinia equina, Harmothoe sp. en Xenoturbella japonica na vlekken met 25% Lugol's oplossing.De kleuring verbeterde met succes het contrast van de interne structuren in alle exemplaren, waardoor waarnemingen van interne zachte weefsels mogelijk werden. Deze methode is van toepassing op kwetsbare exemplaren, zelfs met externe schade, zoals blijkt uit de X.japonica specimen met zwaar beschadigde opperhuid. Een enkele gegevensset met hoge resolutie van een heel exemplaar werd gereconstrueerd voor Harmothoe sp.en X.japonica van meerdere scans uitgevoerd op verschillende, maar overlappende delen van het monster. Zorg ervoor dat u het monster in de buis of punt instelt en de buis of punt in de microCT monteert, zodat het niet beweegt tijdens het scannen. De gegevens die uit deze procedure worden verkregen, kunnen worden gebruikt voor 3D-beeldreconstructies, waardoor de onderzoeker zowel interne als externe morfologie van het monster volledig kan begrijpen.Alle microCT-systemen maken gebruik van röntgenfoto's, maar de details kunnen van systeem tot systeem verschillen, dus zorg ervoor dat u de instructies van elk systeem op de voet volgt.

microfocus-x-ray-ct-microct-imaging-actinia-equina-cnidaria-harmothoe

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

We gebruikten synchrotron X-ray tomografie bij de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) naar niet-invasieve 3D tomografie datasets te produceren met een pixel-resolutie van 0.7μm. Met behulp van volume rendering software, dit maakt de reconstructie van de interne structuren in hun natuurlijke staat, zonder de artefacten die door histologische coupes.

Niet-invasieve 3D-visualisatie met Sub-micron resolutie met behulp van synchrotronstraling-X-ray-tomografie

Contrast verbeterde kleine dier schip beeldvorming door microCT is een snelle, rendabele en high-throughput techniek voor...

Contrast Enhanced Imaging Schip met behulp van microCT

Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (CT).

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

Source: Choi, J. P. et al. Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the use of micro-CT imaging to visualize cerebral cavernous malformation (CCM) lesions in a mouse brain. It details the steps for sample preparation, imaging, and 3D image reconstruction to evaluate the density and location of CCM lesions in brain tissue.

Contrast-Enhanced Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformation Lesions in a Mouse Brain

Dit document presenteert de voor sonderen ruimtelijk gecorreleerde chemische, structurele en mechanische eigenschappen van het meerlagige omvang van Atractosteus spatel (A. spatel) met nanoindentation methoden Fourier transformatie infrarood (FTIR) spectroscopie, scanning elektronen microscopie (SEM), en X- ray tomografie (X-ray CT). De experimentele resultaten zijn gebruikt om de ontwerpprincipes beschermende biologisch materiaal onderzocht.

Karakterisering van Multi-layered Fish Scales (<em&gt; Atractosteus spatel</em&gt;) Met behulp Nanoindentation, röntgen-CT, FTIR en SEM

Een geïntegreerde suite van beeldvormende technieken is toegepast op poliep morfologie en weefselstructuur in het Caribisch gebied koralen Montastraea annularis en M. te bepalen faveolata. Fluorescentie, serieblok gezicht, en twee-foton confocale laser scanning microscopie hebben lobbige structuur, poliep muren, en de geschatte chromatophore en zoöxanthellen dichtheid en uitkeringen geïdentificeerd.

Multimodale optische microscopie methoden Reveal Poliep Tissue morfologie en structuur in het Caribisch gebied Reef Building Koralen

We demonstreren het gebruik van verschillende microscopiemethoden die nuttig zijn bij het observeren van de verkalking van een buisworm, Hydroides elegans, evenals het lokaliseren en karakteriseren van het eerste verkalkte materiaal. Live microscopie en elektronenmicroscopie worden samen gebruikt om functionele en materiaalinformatie te verstrekken die belangrijk zijn bij het bestuderen van biomineralisatie.

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Wij protocollen ontwikkeld en ontworpen een aangepaste apparatuur om insluiten van millimeter-schaal specimens. We presenteren monsterbereidingsprocedures met de nadruk op het insluiten in acryl hars en polyimide buizen om rigide immobilisatie en langdurige opslag van specimens voor de ondervraging van architectuur en cel morfologie van weefsels door micro-CT.

Stijve inbedding van vaste en gekleurd, geheel Millimeter-schaal Specimens voor sectie-gratis 3D histologie door Micro-berekend tomografie

Snelle herhalingssnelheid fluorometer (FRRf) is een nuttige methode voor het meten van fotosysteem II fotofysiologie en primaire productiviteit. Hier beschrijven we een protocol om PSII-fotofysiologie van epizoïsche alg, Colacium sp. op substraat zoöplankton te meten met behulp van cuvette-type FRRf.

Het meten van fotofysiologie van attached stage van Colacium sp. door een Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Micro-CT is een niet-destructief hulpmiddel dat plantstructuren in drie dimensies kan analyseren. Het huidige protocol beschrijft de monstervoorbereiding om micro-CT te gebruiken om de parasitaire plantstructuur en -functie te analyseren. Verschillende soorten worden gebruikt om de voordelen van deze methode te benadrukken in combinatie met specifieke preparaten.

Gebruik maken van micro-CT-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren

Leer microCT-beeldvorming van mariene ongewervelden zoals Actinia equina, Harmothoe sp. en Xenoturbella japonica. Deze methode maakt flexibele montage met alledaagse materialen mogelijk voor gedetailleerde 3D-morfologiestudies.

MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) (Video) | JoVE Journal

MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Meer video's verkennen