In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Dit protocol biedt twee methoden om C.Elegans te mobiliseren om in vivo calciumbeeldvorming van lichaamswandspieren uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot calcium homeostase en calcium behandeling, en een toegankelijke synaps in genetisch goed bereikbaar organisme. Deze techniek kan een beter begrip bieden van de mechanismen die spiercalciumhomeostase reguleren en kan daarom belangrijk zijn bij het identificeren van omstandigheden of moleculaire paden die van invloed zijn op de samentrekking van opwinding door de verkeerde regulering van calciumfietsen.

Deze methoden kunnen inzicht geven in onderzoeksgebieden, waaronder, maar ook niet beperkt, neurobiologie, ontwikkelingsbiologie en celbiologie. Deze technieken kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan celtypen en C.elegans, andere verwante aaltjes en filsafatlarven te bestuderen. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, zodat de onderzoeker de dessectietechniek kan begrijpen en calciumtransiënten van goed geïmmobiliseerde dieren nauwkeurig kan beoordelen.

Begin met het opzetten van de microscoop voor fluorescerende beeldvorming. Gebruik een wetenschappelijke CMOS-camera die full frame imaging op 100 hertz kan gebruiken om snelle veranderingen in calciumniveaus bij te houden. Controle camera acquisitie en LED fluorescerende excitatie met een micromanager software draait in ImageJ.

Gebruik een opensource elektronische platform plug-in die verbinding maakt met een externe opensource microcontroller bord om de externe timing pulsen die fluorescerende excitaties controle te beheren. Als u de timinglogica wilt beheren, activeert u het micromanager-acquisitieprotocol in de software volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik twee LED's om kanaalodopsine met blauw licht te stimuleren en RCaMP-veranderingen op te nemen.

Activeer kanaal rhodopsin met am LED met de piek toelating golflengte van 470 nanometer en een bandpass filter, en prikkel RCaMP met een LED met een piek toelating golflengte van 594 nanometer en een bandpass filter. Co-verlicht beide LED's en zend het licht naar hetzelfde optische pad met behulp van een dichroic beam combiner. Bedien de timing van de LED-verlichting met een solid state switches die worden aangestuurd door TTL-signalen volgens de hand van manuscriptaanwijzingen en stel de LED-intensiteit in met de huidige gecontroleerde load noise lineaire voedingen en programmeer vervolgens het blauwe lichtsimulatieprotocol in een simulator.

In dit experiment zet de blauwe lichtsimulatie aan na twee seconden van het vangen van RCaMP fluorescentie alleen en gebruik een trein van vijf, twee milliseconden blauwe lichtpulsen met 50 milliseconde intervallen om kanaal rhodopsine te activeren. Bij gebruik van de dissectie voorbereiding, uitvoeren C.elegans dissectie bij weinig licht. Plaats de dieren in de dissectieschaal met de met siliconen gecoate coverslipbasis die is gevuld met een één millimole calcium extracellulaire oplossing bereid volgens manuscriptaanwijzingen.

Lijm de dieren met behulp van de vloeibare actuele huid lijm met blauwe kleur langs de rug kant van de worm. En maak een laterale cuticula incisie langs de lijm en worm interface met behulp van glazen naalden. Gebruik een mondpipet om de interne ingewanden uit de wormholte te halen en lijm vervolgens de cuticulaflap van het dier om de ventrale middenwandspieren bloot te leggen voor beeldvorming.

Bij gebruik van de nano-kraal preparaat, maak een gesmolten 5%Agra oplossing met behulp van gedestilleerd water tot een eindvolume van 100 milliliter. Gebruik een Pasteur pipet om een druppel gesmolten-Agra oplossing op een glazen glijbaan te plaatsen en onmiddellijk plaats een tweede glazen glijbaan over de top met behulp van voorzichtig druk om een zelfs Agra's pad te creëren. Verwijder de bovenste dia en op ongeveer vier microliters van polystyreen nano-kralen naar het midden van de pad.

Voeg bij weinig licht vier tot zes C.elegans toe aan de nano-kralenoplossing, om ervoor te zorgen dat de dieren niet op elkaar liggen en leg voorzichtig een coverlip op de top. Wanneer wanneer klaar om beeld, plaats de voorbereide dia of dissectie schotel op de microscoop en vinden en richten op een worm met behulp van 10 keer vergroting en dim heldere veld verlichting. Schakel over op 60 keer vergroting in RCaMP fluorescerende opwinding om een ventrum mediale lichaamswandspier te identificeren die voor de vulva en in het juiste vocale vlak is.

Verander vervolgens de beeldroute van het oculair naar de camera door de schakelaar uit te trekken en live te klikken binnen de software voor gegevensverwerving. Klik op de ORI-knop in de software voor gegevensverwerving en maak een vak rond de spier waarop wordt gefocust. Schakel op de stimulator het eerder geprogrammeerde blauwe lichtstimulatiepad in en klik vervolgens op Acquire op de beeldsoftware om het beeld vast te leggen.

Wanneer C.elegans worden geteeld op all-trans netvlies, met succes waarin retinale en het activeren van het kanaal rhodopsine, een calcium voorbijgaande kan worden opgeroepen. Als dieren niet worden blootgesteld aan all-trans retinale geen spier calcium voorbijgaande wordt geactiveerd. Dit protocol werd gebruikt om verlies van functie sca-1 mutanten te onderzoeken, die invloed hebben op de sarcoplasmatische reticulum calciumpomp gecodeerd door het sca-1 gen.

Maar, de dissectie voorbereiding toeneemt in baseline niveaus van RCaMP fluorescentie werden waargenomen in de mutant in vergelijking met de controle, wat suggereert dat de mutatie de verhoogde niveaus van rustende cytoplasma calcium nodig heeft. Er was een significante afname van piekcalciumniveaus in de sca-1 mutanten in vergelijking met de controle. Echter, geen verandering werd gezien in de stijging van de piektijd of de helft verval tijd.

Belangrijk is dat vergelijkbare resultaten kunnen worden waargenomen met behulp van de minder technisch uitdagende nano-kraal voorbereiding. Verlies van functieslo-mutanten, die de calcium geactiveerde grote kaliumkanalen verstoren, werden geëvalueerd om mutanten te onderzoeken die indirect van invloed zijn op de behandeling van calcium in C.elegans. Toen de basisniveaus van RCaMP werden gemeten, vertoonden de mutanten een verhoogde fluorescentie in vergelijking met de controles.

Bij de evaluatie van de kinetiek van het calcium voorbijgaande geen veranderingen in piek calciumniveaus werden gezien. De slo-1(eg142)mutanten vertoonden echter een aanzienlijk verhoogde stijging tot piektijd. De belangrijkste stap om te onthouden bij het voltooien van de procedure is om proefdieren klaar in all-trans retinale.

Zonder deze stap zal het kanaal rhodopsine inactief zijn, voorkomen dat licht geïnduceerde calcium voorbijgaand wordt geactiveerd. Na deze procedure kunnen elektrofysiologie en gedragsanalyse worden gedaan om de functionele impact van waargenomen veranderingen in calciumhomeostase te evalueren. Met behulp van de immobilisatie methoden hier beschreven, effent de weg voor verdere verkenning van calcium dynamiek en toont aan dat vergelijkbare resultaten kunnen worden waargenomen in reactie op optogenetische neuronale stimulatie en het vastleggen van spier calcium voorbijgaande stoffen met behulp van de veel minder uitdagende kraal immobilisatie techniek.