Name: In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer in vivo calciumbeeldvorming van lichaamsmuurspieren in C. elegans met optogenetische stimulatie. Deze techniek onthult calciumdynamica en excitatie-contractiekoppeling in spiercellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Dr. Alexander Gottschalk voor ZX1659, de RCaMP en channelrhodopsin met worm stam, Dr. Hongkyun Kim voor de SLO-1 (eg142) worm stam, en het nationale Bioresource project voor de SCA-1 (tm5339) worm stam.

1. Microscoop-installatie
<ol><li>Gebruik een samengestelde microscoop met fluorescentie mogelijkheden. Voor deze studie werden gegevens verzameld op een rechtopstaande Microscoop (tabel van materialen) uitgerust met led's voor excitatie.</li>
	<li>Om fluorescentie veranderingen in de spieren van het lichaam goed te visualiseren, gebruik een hoge vergroting doelstelling.<ol>
<li>Voor ontleed preparaten, gebruik een 60x NA 1,0 water onderdompeling doel (tabel van materialen).</li>
		<li>Voor preparaten die nano kralen gebruiken, gebruik maken van een 60x NA 1,4 olie onderdompeling objectief (tabel van materialen). Deze vergroting zorgt voor een voldoende resolutie van de spieren op de camerasensor.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een camera met hoge gevoeligheid die aan de Microscoop is bevestigd om beelden met een hoge beeldsnelheid vast te leggen om snelle veranderingen in calcium niveaus te kunnen volgen. Voor deze studie, beeld met een sCMOS systeem (tabel van de materialen) geschikt voor volledige beeldvorming op 100 Hz, als de opkomst tijden voor de CA2 + signalen kunnen zo snel als tientallen milliseconden.</li>
	<li>Bedien camera overname en LED fluorescentie excitatie met een Micro-Manager software die in ImageJ10 wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen).</li>
	<li>Gebruik een open-source elektronische platform plugin, die een externe open-source microcontroller board (tafel van materialen) verbindt, om de externe timing pulsen te beheren om de fluorescentie excitatie te regelen. Opmerking: digitale uitgangen zijn beschikbaar vanaf de digitale pinnen 8 tot en met 13 voor het leveren van output bits 0 tot 5. Deze kunnen worden aangepakt als basis 2-waarden van 1, 10, 100, enz. De instellingen voor de seriële poort zijn aangegeven in tabel 1 en zijn beschikbaar via de Micro-Manager-website (tabel met materialen). Firmware voor de microcontroller board is op dezelfde manier beschikbaar op deze website.</li>
	<li>Om de timing logica te bepalen, activeert u het Micromanager Acquisition protocol in de software volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen). Opmerking: Dit initieert tegelijkertijd een vooraf ingestelde camera frameduur en het aantal te activeren frames, evenals de logische sluiter en vooraf ingestelde oranje LED voor fluorescentie excitatie. In dit geval wordt de oranje LED Solid State schakelaar bestuurd door microcontroller bit 1 uitgang via pin 9. De camera frames out TTL (back Plate out 3 connector) activeert een stimulator. Dit precies keer de activering van de blauwe licht LED voor de activering van channelrhodopsin op een vast tijdstip na de activering van de beeld sequentie.</li>
	<li>Om te stimuleren channelrhodopsin met blauw licht en record RCaMP veranderingen, gebruik twee LEDs. Activeer channelrhodopsin met een LED met een piek emissie golflengte van 470 nm en een band pass filter (455 tot 490 nm) en Excite RCaMP met een LED met een piek emissie golflengte van 594 nm en een bandpas filter (570 tot 600 nm).</li>
	<li>Om gelijktijdig channelrhodopsin te activeren en veranderingen in RCaMP-fluorescerende niveaus vast te leggen, verlicht u beide Led's en zendt u het licht naar hetzelfde optische pad met behulp van een dichroïde bundel combiner.</li>
	<li>Controle van de timing van LED-verlichting met Solid-State switches (tabel met materialen) bestuurd door TTL-signalen (maximale nominale tijd, 1 MS, turn-off tijd 0,3 MS: 0 tot 90% Turn-on en uitschakelen tijd van < 100 μs).</li>
	<li>Stel de LED-intensiteit in met de huidige lineaire voedingen met lage ruis (tabel met materialen).</li>
	<li>Om de precieze timing van het blauwe lampje te waarborgen, activeert u het direct door TTL-puls naar het Solid-State Relais van een stimulator. Program meer het Blue Light stimulatie protocol in een stimulator (tabel met materialen), die als een precieze timer fungeert vanaf het begin van de beeld verwerving tot blauwe LED-verlichting. In dit experiment, schakel blauw licht stimulatie na 2 s van het vastleggen van RCaMP fluorescentie alleen en gebruik een trein van 5, 2 MS blauw lichtpulsen met 50 MS interpulse intervallen om te activeren channelrhodopsin. Opmerking: de vertraging voor blauw lichtpulsen, de duur van de blauwe lichtpulsen, de tijd tussen pulsen, en het aantal pulsen in de trein kan allemaal worden ingesteld op dit punt en moet de specifieke parameters van de experimentele interesse weerspiegelen.</li>
</ol>2. C. elegans monstervoorbereiding en gegevensverzameling
<ol><li>Om presynaptische neuronen optisch te stimuleren, dieren te verkrijgen die channelrhodopsin uitdrukken in excitatory cholinerge neuronen, gedreven door de UNC-17- promotor regio, en rcamp uitgedrukt in alle Body Wall-spieren aangedreven door de Myo-3- promotor regio2. Opmerking: alleen het gebruik van dieren met geïntegreerde transgenen en robuuste niveaus van fluorescentie worden aanbevolen, omdat de variabele expressie in de overeenkomstige celtypen de betrouwbaarheid van het verzamelen van gegevens kan beïnvloeden.</li>
	<li>Maak een werkende voorraad van all-trans retinale door het retinale poeder (tabel met materialen) in ethanol te verdunen om een eindconcentratie van 100 mm te creëren en bij-20 °c op te slaan. Deze werkvoorraad zal ongeveer een jaar stabiel zijn.</li>
	<li>Maak een voorraad van OP50 E. coli, GETEELD in lb media, aangevuld met all-trans retinale uit de werk kolf gemaakt in stap 2,2, bij een eindconcentratie van 80 μM. Het volume dat wordt gebruikt voor de OP50 + retinale voorraad zal afhankelijk zijn van het aantal platen dat nodig is voor het experiment.</li>
	<li>Zaad nematode groeimedia (NGM) platen met ongeveer 300 μL van de OP50 + retinale voorraad en laat platen te drogen 's nachts op kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Kweek C. elegans stammen naar de gewenste leeftijd in het donker op OP50 + RETINALE NGM platen bij 20 °c. Gebruik voor dit experiment volwassen wormen.<ol>
<li>Voor het experiment met behulp van de ontleed preparaat, gebruik alleen zwangere volwassen wormen als het uitvoeren van de dissectie op jongere, kleinere dieren is zeer uitdagend. Laat de dieren op de OP50-retinale platen voor een minimum van 3 dagen voor een effectieve channelrhodopsin activering.</li>
	</ol></li>
	<li>Bij gebruik van de ontleed preparaat8,11 (Figuur 1A), het uitvoeren van dissecties bij weinig licht.<ol>
<li>Plaats dieren in een ontsnij bare schaal met een silicone gecoate afdek basis die is gevuld met een 1 mM CA2 + extracellulaire oplossing bestaande uit 150 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm CACL2, 4 mm MgCl2, 10 mm glucose, 5 mm sucrose en 15 mm HEPES (pH 7,3 ,-340 OSM).</li>
		<li>Lijm de dieren met behulp van de vloeibare actuele huid lijm met blauwe kleurplaat langs de rugzijde van de worm en maak een laterale cuticula incisie langs de lijm/worm-interface met behulp van glazen naalden.</li>
		<li>Gebruik een pipet om de inwendige ingewanden uit de worm holte te wissen.</li>
		<li>Lijm de cuticula flap van het dier om de ventrale mediale lichaamsspieren te blootstellen voorbeeld vorming.</li>
	</ol></li>
	<li>Bij gebruik van de nanobead bereiding (Figuur 1B)<ol>
<li>Maak een gesmolten 5% agarose oplossing met ddH2O tot een eindvolume van 100 ml.</li>
		<li>Gebruik een Pasteur-pipet om een druppel gesmolten agarose-oplossing op een glazen glijbaan te plaatsen en plaats onmiddellijk een tweede glazen Slide over de bovenkant, loodrecht op de eerste, met behulp van zachte druk om een gelijkmatige agarose pad te maken. Verwijder de bovenste dia voor gebruik.</li>
		<li>Voeg ongeveer 4 μL polystyreen nano kralen (tabel met materialen) toe aan het midden van het agarose pad.</li>
		<li>In het lage licht, pick 4-6 C. elegans in de nano kraal oplossing, ervoor te zorgen dat de dieren niet op elkaar te leggen, en zorgvuldig plaats een dekslip op de top.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de bereide glij-of dissectie schaal op de Microscoop en zoek en concentreer u op een worm met 10x vergroting en Dim heldere veldverlichting.</li>
	<li>Schakel over naar 60x vergroting en RCaMP fluorescentie excitatie om een ventromediale Body Wall muscle te identificeren die anterieur is aan de vulva en in het juiste brandvlak. Opmerking: spieren voorste naar de vulva zijn geselecteerd als ze weerspiegelen spieren vaak gestimuleerd in elektrofysiologie experimenten.</li>
	<li>Verander het beeld traject van het oculair naar de camera door de Toggle uit te trekken en op Live te klikken binnen de Data Acquisition software (tabel met materialen). Opmerking: Zorg ervoor dat de blauwe lichtstimulatie route op dit punt is uitgeschakeld om ervoor te zorgen dat de channelrhodopsin niet wordt geactiveerd voordat beelden worden vastgelegd.</li>
	<li>Focus de afbeelding binnen de software voor gegevensverzameling met behulp van de Microscoop Fine focus.</li>
	<li>Zodra de spier duidelijk scherp is, schakelt u het live-beeld uit door op de knop Live te klikken.</li>
	<li>Klik op de ROI -knop in de software voor het verzamelen van gegevens en maak een vak rond de spier waarop wordt gefocust.</li>
	<li>Schakel op de stimulator het blauwe lichtstimulatie traject in dat eerder is geprogrammeerd in stap 1,10.</li>
	<li>Klik op verwerven in de beeldvormings software om de afbeelding via de CMOS-camera vast te leggen. Om dit te doen, stelt u de belichtingstijd in op 10 s met 1.000 frames en 2x binning.</li>
</ol>3. gegevensanalyse
<ol><li>Open het gegevensbestand in de imaging software (tabel met materialen) en schets met behulp van het gereedschap Veelhoekde spier van belang. Dit is de ROI.</li>
	<li>Ga naar afbeelding | Stapels | Plot Z-AXIS profile en exporteer de resulterende gegevenspunten naar de spreadsheet software (tabel met materialen). Deze functie plots de gemiddelde waarde van de ROI-selectie ten opzichte van het tijdspunt.</li>
	<li>Verplaats de spier ROI gemaakt met het veelhoek gereedschap buiten het dier om een achtergrond fluorescentie meting te krijgen met behulp van de stappen beschreven in 3,2. Exporteer de resulterende gegevens naar de werkblad werkmap.</li>
	<li>In de werkblad werkmap trekt u de achtergrond fluorescentie waarden van de spier fluorescentie waarden op elk moment af. Hiermee wordt het fluorescerende signaal op de achtergrond afgetrokken.</li>
	<li>Gemiddelde de achtergrond van de fluorescentie voor de eerste 2 s van gegevenspunten afgetrokken. Dit geeft de baseline fluorescentie meting, F.</li>
	<li>Gebruik de baseline fluorescentie meting om het genormaliseerde fluorescentie niveau op elk tijdpunt te berekenen. Gebruik hiervoor de vergelijking (ΔF/F) + 1. ΔF vertegenwoordigt (F (t)-F), waarbij F (t) de fluorescentie meting is op een bepaald tijdstip en F de baselinewaarde is. De + 1 wordt toegevoegd als een offset van de y-as.</li>
	<li>Herhaal stap 3.2-3.6 voor elk spier beeld dat wordt verzameld. Het gebruik van één of meerdere spiercellen per afbeelding is naar goeddunken van de onderzoeker. De n van het experiment kan worden bepaald door een vermogens analyse uit te voeren.</li>
	<li>Gebruik de verwerkte gegevens uit de stappen 3.2 tot en met 3.6 om een spoor te maken van de fluorescentie waarden in de grafische software volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen).</li>
	<li>Meet vanuit dit spoor de kinetiek van de calcium transiënt, zoals de stijg-en tijdperiode en de halve vervaltijd, met behulp van de gereedschappen in de grafische software volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+analysis+of+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li>
<li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li>
<li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+umanager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li>
<li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li>
<li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+isoforms+of+sarco%2Fendoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+%28SERCA%29+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li>
<li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2%2B+ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li>
<li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+sarco%28endo%29plasmic+reticulum+calcium-ATPases+%28SERCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serca+pumps+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling+and+Disease%3A+Molecular+Pathology+of+Calcium%22%5BJournal%5D)">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li>
<li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCA+pump+isoforms%3A+Their+role+in+calcium+transport+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li>
<li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle%3A+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li>
<li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sarco%28endo%29plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li>
<li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li>
<li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li>
<li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+differentially+modulates+Ca2%2B+transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li>
<li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li>
<li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li>
<li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li>
<li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-type+voltage-dependent+Ca2%2Bchannel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li>
<li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

GECIs zijn een krachtig hulpmiddel in C. elegans neurobiologie. Vorige werk heeft gebruikt calcium Imaging technieken om een breed scala van functies in zowel neuronen en spiercellen, met inbegrip van zintuiglijke en gedragsmatige reacties, met gevarieerde methoden van stimulatie te onderzoeken. Sommige studies hebben chemische stimuli gebruikt om te leiden tot calcium transiënten in sensorische as neuronen22,23 of voor het opwekken van calcium golven in...

Dit document presenteert methoden voor in vivo calcium beeldvorming van C. elegans lichaam wand spieren met behulp van optogenetische neuronale stimulatie. Het koppelen van een spier uitgedrukt genetisch gecodeerde calcium indicator (GECI) met blauw licht veroorzaakte neuronale depolarisatie en biedt een systeem om de Evoked postsynaptisch calcium transiënten duidelijk te observeren. Dit vermijdt het gebruik van elektrische stimulatie, waardoor een niet-invasieve analyse van mutanten die de postsynaptische calcium dynamiek beïnvloeden.
Single-fluorophore GECIs, zoals GCaMP, maakt gebruik van een enkele fluorescerende proteïne molecuul gesmolten tot de M13 domein van myosin Light Chain kinase aan de N-Terminal einde en Calmoduline (CaM) op de C-Terminus. Bij calcium binding ondergaat het CaM-domein, dat een hoge affiniteit heeft met calcium, een conformationele verandering die een daaropvolgende conformationele verandering in het fluorescerende eiwit veroorzaakt, wat leidt tot een toename van de intensiteit van de fluorescentie1. GCaMP fluorescentie is opgewonden op 488 nm, waardoor het ongeschikt is om te worden gebruikt in combinatie met channelrhodopsin, die een vergelijkbare excitatie golflengte van 473 nm heeft. Daarom moet het groene fluorescerende eiwit van GCaMP worden vervangen door een rood fluorescerende proteïne, mRuby (RCaMP), om de calcium metingen met channelrhodopsine stimulatie te kunnen koppel. Met behulp van de spier uitgedrukt RCaMP, in combinatie met de cholinerge motorische neuron expressie van channelrhodopsin, maakt studies mogelijk op de worm neuromusculaire kruising (NMJ) met gelijktijdig gebruik van optogenetica en functionele beeldvorming binnen hetzelfde dier 2.
Het gebruik van channelrhodopsin omzeilt de noodzaak van de elektrische stimulatie om de neuromusculaire knooppunten van C. eleganste depolariseren, wat alleen kan worden bereikt in ontleed preparaten, waardoor deze techniek zowel eenvoudiger in gebruik en preciezer bij het targeten van specifieke weefsels. Bijvoorbeeld, channelrhodopsin is eerder gebruikt in C. elegans om reversibel activeren specifieke neuronen, leidt tot ofwel robuuste activering van excitatory of remmende neuronen3,4. Het gebruik van lichtgestimuleerde depolarisatie omzeilt ook de kwestie van neuronale schade als gevolg van de directe elektrische stimulatie. Dit biedt de mogelijkheid om de effecten van veel verschillende stimulatie protocollen, met inbegrip van aanhoudende en herhaalde stimulaties, op postsynaptisch calcium Dynamics4te onderzoeken.
Het transparante karakter van C. elegans maakt het ideaal voor de fluorescerende beeldvormende functionaalanalyse. Echter, bij het stimuleren van de excitatory acetylcholine neuronen op de NMJ, dieren worden verwacht te reageren met een onmiddellijke spiercontractie4, waardoor de immobilisatie van de wormen kritisch in het visualiseren van discrete calcium veranderingen. Traditioneel, farmacologische agenten zijn gebruikt voor het verlammen van de dieren. Een dergelijke drug gebruikt is Levamisole, een cholinerge acetylcholine receptor agonist5,6,7. Aangezien levamisol leidt tot de aanhoudende activering van een subtype van excitatory spier receptoren, is dit reagens ongeschikt voor de studie van de spier calcium dynamiek. De werking van levamisol induceert postsynaptische depolarisatie, verheffende het cytosolische calcium en occluderende waarnemingen na presynaptische stimulatie. Om het gebruik van verlamde drugs te voorkomen, we onderzochten twee alternatieve methoden om te immobiliseren C. elegans. Dieren werden ofwel gelijmd en vervolgens ontleed open om de lichaamsspieren bloot te stellen, vergelijkbaar met de bestaande C. elegans nmj elektrofysiologie methode8, of nano kralen werden gebruikt om intacte dieren te immobiliseren9. Beide procedures toegestaan voor de reproduceerbare metingen van de rust en Evoked spier calcium transiënten die gemakkelijk kwantificeerbaar waren.
De methoden in dit papier kunnen worden gebruikt om de baseline cytosolische calciumspiegels en transiënten in postsynaptisch Body Wall spiercellen in C. eleganste meten. Voorbeelden van gegevens met de twee verschillende immobilisatie technieken worden gegeven. Beide technieken maken gebruik van optogenetics om de spiercellen te depolariseren zonder het gebruik van elektrische stimulatie. Deze voorbeelden tonen de haalbaarheid van deze methode aan bij het evalueren van mutaties die de postsynaptische behandeling van calcium in de wormen beïnvloeden en wijzen op de voors en tegens van de twee immobilisatie benaderingen.

```html
<table><tbody><tr><td>all-trans retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500</td><td>Noodzakelijk voor excitatie van kanaalrhodopsine</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td></td><td></td><td>RCaMP-verlichting</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>Mouser</td><td>782-A000066</td><td>Bestuurt fluorescentie-verlichting</td></tr><tr><td>Blauwe LED</td><td></td><td></td><td>kanaalrhodopsine-verlichting</td></tr><tr><td>BX51WI microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Vaste staat samengestelde microscoop</td></tr><tr><td>Stroomgestuurde lage ruis lineaire voeding</td><td>Ametek</td><td>Sorenson</td><td>Bestuurt LED-intensiteit</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>Wavemetrics</td><td>Wavemetrics.com</td><td>Grafische software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov</td><td>Afbeeldingsverwerkingssoftware</td></tr><tr><td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Water-immersie objectief voor gedissecteerde voorbereiding</td></tr><tr><td>Master-8 Stimulator</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td>Hoofdtimer voor beeldverwerving en LED-verlichting</td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td></td><td>micro-manager.org</td><td>Bestuurt camera-acquisitie en LED-excitatie</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Spreadsheetsoftware</td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 CMOS-camera</td><td>pco.</td><td>4.2</td><td>Snelheidscamera</td></tr><tr><td>PlanApo N 60x olie NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Olie-immersie objectief voor nanobead-voorbereiding</td></tr><tr><td>Polybead-microsferen</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876-15</td><td>Voor worm-immobilisatie</td></tr><tr><td>Solid state-schakelaars</td><td>Sensata Technologies</td><td>Crydom CMX100D6</td><td>Bestuurt timing van LED-verlichting</td></tr><tr><td>Transgene stam, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td>SY1627</td><td>Excitatorische neuronale kanaalrhodopsine en lichaamswandspier RCaMP expresserende wormlijn met SERCA-mutante allel</td></tr><tr><td>Transgene stam, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td></td><td>Excitatorische neuronale kanaalrhodopsine en lichaamswandspier RCaMP expresserende wormlijn met calcium-geactiveerd BK-kaliumkanaal mutant allel</td></tr><tr><td>Transgene stam, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Gottschalk Lab</td><td>ZX1659</td><td>Excitatorische neuronale kanaalrhodopsine en lichaamswandspier RCaMP expresserende wormlijn</td></tr></tbody></table>
```

in vivo calcium beeldvorming in c. elegans lichaam muur spieren

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Het modelorganisme C. elegans biedt een uitstekend systeem om in vivo calcium beeldvorming uit te voeren. Het transparante lichaam en de genetische manipulability zorgen voor de gerichte expressie van genetisch gecodeerde calcium sensoren. Dit protocol schetst het gebruik van deze sensoren voor de in vivo beeldvorming van de calcium dynamica in gerichte cellen, met name de lichaamsspieren van de wormen. Door gebruik te maken van de co-expressie van presynaptische channelrhodopsin, stimulatie van acetylcholine vrijlating van excitatory motorneuronen kan worden geïnduceerd met behulp van blauw lichtpulsen, resulterend in spier depolarisatie en reproduceerbare veranderingen in cytoplasmatische calcium Niveaus. Twee worm immobilisatie technieken worden besproken met verschillende moeilijkheidsgraden. Vergelijking van deze technieken toont aan dat beide benaderingen de Fysiologie van het neuromusculaire knooppunt behouden en de reproduceerbare kwantificering van calcium transiënten mogelijk maken. Door optogenetica en functionele calcium beeldvorming te koppelen, kunnen veranderingen in postsynaptische calcium behandeling en homeostase worden geëvalueerd in een verscheidenheid aan Mutante achtergronden. Gepresenteerde gegevens valideert zowel immobilisatie technieken en onderzoekt specifiek de rollen van de C. elegans Sarco (endo) plasmische Reculaire calcium ATPase en het calcium-geactiveerde BK kalium kanaal in de Body Wall muscle calcium regulatie.

Deze techniek evalueerde veranderingen in mutanten die invloed hadden op de behandeling van calcium of spier depolarisatie. De baseline fluorescentie spiegels en de fluorescerende transiënten werden gevisualiseerd en de rust cytosolische calcium-en calcium kinetiek in de spier werden geëvalueerd. Het is belangrijk dat de dieren gedurende ten minste drie dagen op het all-trans retinale zijn geteeld om te zorgen voor een geslaagde opname van retinale, waardoor de channelrhodopsin vervolgens...

Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Dit protocol biedt twee methoden om C.Elegans te mobiliseren om in vivo calciumbeeldvorming van lichaamswandspieren uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot calcium homeostase en calcium behandeling, en een toegankelijke synaps in genetisch goed bereikbaar organisme. Deze techniek kan een beter begrip bieden van de mechanismen die spiercalciumhomeostase reguleren en kan daarom belangrijk zijn bij het identificeren van omstandigheden of moleculaire paden die van invloed zijn op de samentrekking van opwinding door de verkeerde regulering van calciumfietsen.Deze methoden kunnen inzicht geven in onderzoeksgebieden, waaronder, maar ook niet beperkt, neurobiologie, ontwikkelingsbiologie en celbiologie. Deze technieken kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan celtypen en C.elegans, andere verwante aaltjes en filsafatlarven te bestuderen. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, zodat de onderzoeker de dessectietechniek kan begrijpen en calciumtransiënten van goed geïmmobiliseerde dieren nauwkeurig kan beoordelen.Begin met het opzetten van de microscoop voor fluorescerende beeldvorming. Gebruik een wetenschappe

in-vivo-calcium-imaging-in-c-elegans-body-wall-muscles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Doser, R., et al. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates in vivo imaging of subcellular calcium flux in the ventral nerve cord neurons of transgenic Caenorhabditis elegans strains. Two distinct calcium indicators are employed: a cytoplasmic indicator in one strain and a mitochondrial indicator in another. Neurons are observed under a fluorescence microscope to monitor real-time changes in fluorescence intensity within the...

Imaging Subcellular Calcium Dynamics in Neurons of Caenorhabditis elegans

Met zijn kleine transparante lichaam, goed gedocumenteerde neuroanatomie en een groot aantal vatbaar genetische technieken en...

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

Het in beeld brengen van gedrag en neurale activiteit over lange tijdschalen zonder het dier te immobiliseren, is een voorwaarde om gedrag te begrijpen. Agarose microfluïdische kamersbeeldvorming (AMI) kan worden gebruikt om neurale activiteit en gedrag voor alle levensfasen van Caenorhabditis elegans in beeld te brengen.

Agarose microkamers naar Lange termijn Calcium Imaging van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

Hier gerapporteerd is een systeem voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen. Dit systeem stelt onderzoekers in staat om niet-gelokaliseerde trillingen op te roepen met goed gecontroleerde eigenschappen op nanoschaalverplaatsing en om calciumstromen te kwantificeren tijdens reacties van C. elegans op de trillingen.

Calciumbeeldvorming bij vrij gedragen caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen

Dendritische stekels zijn belangrijke cellulaire kenmerken van het zenuwstelsel. Hier worden live beeldvormingsmethoden beschreven voor het beoordelen van de structuur en functie van dendritische stekels in C. elegans. Deze benaderingen ondersteunen de ontwikkeling van mutante schermen voor genen die de dendritische wervelkolomvorm of -functie definiëren.

Beeldvorming van dendritische stekels bij Caenorhabditis elegans

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Hier presenteren we protocollen en hulpmiddelen voor het visualiseren van calcium tijdens bevruchting en vroege embryogenese met behulp van een genetisch gecodeerde calciumreporter die tot expressie komt in de kiembaan van de modelnematode C. elegans.

In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans

Leer in vivo calciumbeeldvorming van lichaamsmuurspieren in C. elegans met optogenetische stimulatie. Deze techniek onthult calciumdynamica en excitatie-contractiekoppeling in spiercellen.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Meer video's verkennen