Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudige methode voor het verbeteren van de betrouwbaarheid van een 3D-cel cultuurmodel zonder het gebruik van speciale apparatuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we het herhaalbare 3D-cultuurexperiment kunnen uitvoeren door de initiële cultuurconditie binnen het kubieke apparaat te controleren. Na het voorbereiden van een vijf bij vijf millimeter polycarbonaat kubieke frame, plaats het frame op een voorgekoelde glijbaan en een ijsdoos en gebruik een pipet om 12 microliters van voorverwarmde 1,5% agarose toe te voegen van de bovenkant van het kubieke frame naar het onderste oppervlak.

Spreid de agarose om een vlakke ondergrond te verkrijgen en laat het polymeer te genezen. Gebruik een pincet om het frame naar de rand van het glas te schuiven en het frame te draaien, zodat de open zijde naar beneden wordt gericht voordat het frame terug op de dia wordt geplaatst. Na het vullen van de volgende twee oppervlakken van het frame met meer agarose, zoals net aangetoond, drop de agarose in een container van een open gezicht om een agarose muur te vormen aan de vierde en vijfde zijden.

Het opzetten van een initiële celclustervorm injecteer een geschikte extracellulaire matrix voor de celcultuur van belang in de hybride gelkubuscultuurruimte en stel een gefabriceerde micromal op de kubus. Plaats de kubus vervolgens 25 minuten in een koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Wanneer de extracellulaire matrix is uitgehard, voorzichtig til de micro-mal, zodat de matrix niet verslechtert.

Een zak in de gewenste vorm van de vorm zal worden vervaardigd in de extracellulaire matrix. Om de cellen te laden concentreert de experimentele celsuspensie na centrifugatie in het aangewezen experimentele celkweekmiddel en injecteer de cellen in de zak binnen de extracellulaire matrijs. Plaats de kubus in de koolstofdioxide incubator gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius om de cellen te vallen in de extracellulaire matrix zak, het vullen van de ruimte gecreëerd door de micro-mal.

Plaats de kubus aan het einde van de incubatie in een put van een 24 putplaat en voeg 100 microliter van het juiste celkweekmedium toe aan de put. Injecteer extracellulaire matrix om de zak te sluiten en breng de kubus 25 minuten terug naar de couveuse. Wanneer de extracellulaire matrix is uitgehard daling ongeveer 10 microliter van 20 graden Celsius agarose op het bovenste oppervlak van de kubus om het oppervlak te sluiten en de daling te genezen gedurende 10 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius.

Bedek vervolgens de gehele kubus met vers medium om osmotische druk te bevorderen voor het vergemakkelijken van de overdracht van voeding naar de cellen in de kubus. Voor niet-invasieve 3D-vormherkenning door multidirectionele observatie plaatst u de plaat op een microscooppodium en verkrijgt u beelden van elke zijde van de kubus door een helder veld- of fasecontrastmicroscopie, met behulp van een pincet om de kubusservice te draaien die tussen vangt moet worden afgebeeld. Voor immunofluorescente beeldvorming door multidirectionele observatie, eerst de supernatant uit de put met de kubus aanzuigen en de kubus 20 minuten bij kamertemperatuur in 4%paraformaldehyde bevestigen.

Aan het einde van de fixatie, was de kubus twee keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Ondoordring de kubus met 0,5%triton x-100 en PBS gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Was vervolgens de kubus drie keer in PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt, voordat u een niet-specifieke binding met geitenserum en immunofluorescentiebuffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur blokkeert.

Bevlek vervolgens de cellen met het juiste primaire antilichaam van belang volgens standaard antilichaam kleuring protocollen. Dan beeld alle zes zijden van de kubus op een laser of fluorescerende microscoop zoals net aangetoond. In dit representatieve experiment toont multidirectionele beeldvorming van hybride gelkubussen, gekweekt met normale menselijke bronchiale epitheelcellen, de generatie van een eerste cilindrische of prismavormige celkweek aan door fasecontrast en immunofluorescente beeldvorming van de culturen.

Hier immuno kleuring van normale menselijke epitheelcellen die aanvankelijk aan een cilindrische vorm in de hybride gelkubus worden gecontroleerd, na generatie van de bronchiale boom wordt getoond. De takken tonen de loodrecht op de cilindrische as, zoals blijkt uit multidimensionale beeldvorming. Het is belangrijk om een hoge dichtheid van cellen in de extracellulaire matrixzak te injecteren, omdat een lage dichtheid van cellen kan leiden tot verslechtering van die celkwaliteit na incubatie.

Deze methode patroon is de herhaalbare vorming van een 3D cellulair patroon met een kwantitatieve meting door multidirectionele beeldvorming om het mechanisme van schotel ontwikkeling te bestuderen.