Overexpressing lang Noncoding RNAs met behulp van gen-activeren CRISPR

Niet-codering RNAs hebben vaak meerdere isovormen. In in vitro overexpressiestudies is het vaak moeilijk om al deze uitgedrukte isovormen te bestuderen. Deze techniek stelt gebruikers in staat om expressie rechtstreeks uit het genoom af te leiden en de cellen in staat te stellen de endogene isovormen uit te drukken voor een bepaald niet-coderend RNA.

Deze krachtige techniek stelt de gebruiker in staat om specifiek de expressie van elk gen in het genoom met trouw en nauwkeurigheid te sturen. Door het ontwerpen van gids RNAs naar specifieke genen, is men in staat om de endogene gen-splicing machines te gebruiken om de natuurlijke isovormen in een bepaalde cel uit te drukken. Het aantonen van de procedure zal Robert Rankin zijn, een post-doc uit mijn laboratorium.

Als u de RNA-reeks voor gids wilt ontwerpen die zich binnen 100 basisparen van de transcriptiestartsite bevindt, gebruikt u genetische databases zoals BLAT om ervoor te zorgen dat de gids RNA uniek is voor het gen van belang. Bewaar de gids RNA en de gedeactiveerde Cas9 plasmids op vier graden Celsius. Streep E.coli uit op een Luria bouillon agar plaat met ampicilline en laat de bacteriën 's nachts groeien bij 37 graden Celsius.

De volgende dag, kies een kolonie en groeien de bacteriën in vijf milliliter LB met ampicilline 's nachts, krachtig schudden van de buis in een 37-graden Celsius incubator. De volgende dag, voeg twee milliliter bacteriën tot 200 milliliter LB met ampicilline in een twee-liter fles, krachtig schudden van de fles 's nachts in een 37-graden Celsius incubator. Draai de bacteriën op 3, 724 keer g gedurende 20 minuten en ga naar DNA-zuivering.

Om het dCas9-bevattende lentivirus te maken, eerste laag 100 milliliter weefsel kweekschotels met vijf milliliter van 0,01%Poly-L-Lysine en plaat vijf miljoen HEK293T cellen per schotel in 10 milliliter van volledige Dulbecco's Modified Eagles Medium, bereid vervolgens DNA-transfectiemonsters voor door 10 microgram van een LTR-bevattende gidsRNA-vector of een LTR-bevattende gedeactiveerde Cas9-vector met plasmiden die componenten van virussen bevatten te mengen. Voeg water toe aan een totaal volume van 450 microliters en filtreer het mengsel door een filterpunt van 0,2 micron die aan een spuit is bevestigd. Voeg vervolgens 50 microliter van 2,5-molaire calciumdichloride toe aan elk transfectiemonster van het DNA en meng zachtjes.

Filtreer het calcium-DNA mengsel door een 0,2-micron filterpunt aan een spuit. Pipette 500 microliter van 2X HBS in een vijf milliliter polystyreenbuis. Voeg 500 microliters van het calcium-DNA mengsel dropwise en voorzichtig vortex.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende drie minuten. Voeg een milliliter van de DNA-calcium HBS suspensie toe aan elke HEK293T-bevattende weefselkweekschotel en broed ze 's nachts uit in een 5%koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Op dag drie, langzaam verwijderen en gooi de media uit de gerechten.

Was de cellen een keer voorzichtig met PBS. Voeg zes milliliter complete DMEM aangevuld met 20-millimolar HEPES en 10-millimolar natrium butyraat. Dan incubeer de cellen in een 5%koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende vijf tot zes uur.

Na de incubatie, was de cellen met PBS een keer en voeg vijf milliliter van volledige DMEM met 20-millimolar HEPES aan de HEK293T cellen. Incubeer de cellen in een 5%koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende 12 uur. Verzamel op dag vier de HEK293T-celsupernatants en filter de supernatant die het virus bevat.

Om te beginnen met de virale deeltjes tellingen, eerst verdunnen de wasconcentraat uit de P24 ELISA kit door het toevoegen van 19 delen van gedestilleerd, gedeïsteerd water. Verdun vervolgens de positieve controle van deze kit tot 200 nanogram per milliliter met RPMI 1640 als verdunningsvat en maak verdunningen voor een standaardcurve in 1,5-milliliter buizen volgens de P24 ELISA verdunningstafel. Om de concentratie van het virus in de monsters te meten, voegen u de monsterverdunningen toe aan de aangewezen putten van een 96-bronplaat, te beginnen met de verdunning van 1:1000 en het volume zo nodig aan te passen om binnen het bereik van de standaardcurve te zijn.

Verdun vervolgens de monsters met Triton X-100 tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% en voeg 200 microliter van elk monster en RPMI 1640 toe aan de aangewezen putten. Verzegel de plaat en broed het twee uur lang uit op 37 graden Celsius. Was de plaat met 300 microliter per put van de 1X wasbuffer zes keer.

Verwijder overtollige vloeistof door het omkeren van de plaat en tikken op een papieren handdoek. Voeg vervolgens 100 microliter detectorantilichaam uit de kit toe aan alle putten, behalve het substraat leeg. Verzegel de plaat en broed het een uur lang uit op 37 graden Celsius.

Was de plaat en verwijder vervolgens overtollige vloeistof door de plaat om te keren en op een papieren handdoek te tikken. Om het detectorantilichaam te meten, verdun de streptavidin mierikswortelperoxidase bij 1:100 verdunning met SA-HRP verdunningsmiddel. Meng de verdunde SA-HRP grondig en voeg 100 microliter toe aan alle putten behalve de blanco.

Verzegel en ontcubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was vervolgens de plaat met de 1X wasbuffer en tik overtollige vloeistof weg. Laat een orthofenylenediaminetablet vallen in 11 milliliter van het substraatverwijdingsmiddel om voldoende substraatoplossing voor één plaat te maken.

Vortex de OPD oplossing krachtig om het volledig op te lossen en te beschermen tegen licht. Voeg 100 microliter OPD substraatoplossing toe aan alle putten, inclusief de blanco. Met behulp van een spectrofotometer, lees absorptie op 450 nanometer onmiddellijk.

Herhaal 10 keer met intervallen van één seconde en neem de gemiddelde meting. Resuspend en cultuur Jurkat T-cellen in een T75 kolf met een dichtheid van een miljoen cellen in vijf milliliter van de verminderde serummedia met polybrene. Voeg dan HEK293T-geconditioneerde media toe die een miljoen dCas9-bevattende virale deeltjes bevatten.

Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Drie dagen na infectie, spin de cellen op 233 tijd g gedurende vijf minuten en resuspend ze in 10 milliliter van volledige DMEM aangevuld met puromycine. Kweek de cellen in T75 kolven en broed ze uit op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.

Elke derde dag gedurende een periode van negen dagen, draai de cellen op 233 keer g gedurende vijf minuten en vervang de media door de volledige DMEM aangevuld met puromycine. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller. Voeg vervolgens op een plaat met 96-bron met weefselkweek behandeld weefsel 10.000 cellen toe in 100 microliters van de volledige DMEM aangevuld met puromycine in de eerste put.

Maak 1:1 seriële verdunningen van de inhoud van de volgende putten met de volledige DMEM aangevuld met puromycine. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Vouw klooncellen uit in twee platen met 24-bron en zet vervolgens twee miljoen cellen per put van een zesputige plaat voor drie van de klonen.

Plaat de andere drie putten met niet-getransduceerde Jurkat cellen als controles. Ten slotte, plaat de cellen in een T75 kolf en zet de cellen in een cel cultuur incubator 's nachts. Om te beginnen kwantitatieve PCR om genexpressie te meten, eerst complementair DNA synthetiseren door een microgram RNA toe te voegen, vier microliters van cDNA synthesebuffer, en een microliter van omgekeerde transcriptase tot 250 microliter buizen, voeg dan water toe aan een laatste volume van 20 microliter.

Gebruik vervolgens gedurende vijf minuten een thermische cycler bij 42 graden Celsius en vijf minuten bij 95 graden Celsius om de omgekeerde transcriptie te activeren. Verdun de cDNA met 60 microliter water na de synthese. Voer polymerasekettingreacties uit voor buizen die 0,5 microliter bevatten van elke voorwaartse en omgekeerde primer bij de uiteindelijke concentratie van 10 micromolar, vijf microliters SYBR-groen en vier microliter van cDNA.

Selecteer tenslotte Jurkat-dCas9 cellen in DMEM aangevuld met Hygromycine B gedurende 10 dagen. Draai de cellen naar beneden en verander de media om de drie dagen. Zuiver RNAse en ga naar RT-qPCR.

In deze studie werden gRNA-sequenties gebruikt die zich binnen 10 tot 100 basisparen verwijderd waren van de transcriptiestartplaats voor het aansturen van het Cas9-activerende complex naar de transcriptie locus van IFNG-AS1, een lang niet-coderend RNA geassocieerd met inflammatoire darmziekte. Om de selectie van dubbele getransduceerde cellen mogelijk te maken, werd een tweeplasmi systeem gebruikt om dCas9- of gRNAse-versterkers om te zetten in cellen. Hier verbeteren MS2-eiwitten de overexpressie van IFNG-AS1.

Cas9 uitdrukking werd bevestigd voor beide klonen. Primers tegen HPRT1 werden gebruikt om de aanwezigheid van RNA in de niet-getransduceerde cellen te bevestigen. mRNA-expressie werd bevestigd door het weglaten van de omgekeerde transcriptase van de cDNA-reactie.

Drie splice varianten van IFNG-AS1 kunnen worden gedetecteerd met transcript-specifieke primer sets of een primer set tegen alle bekende IFNG-AS1 transcripties. Alle fluorescentiekrommen waren exponentieel met het huishoudensgen HPRT1 dat de exponentiële fase binnen een halve cyclus tussen controle en IFNG-AS1 gRNA-uitdrukkende cellen bereikt. Primers tegen alle bekende IFNG-AS1 transcripties waren de meest detecteerbare tussen experimenten, met metingen van 20-voudige toename van IFNG-AS1 expressie.

Echter, de derde transcriptie van IFNG-AS1 toonde een vijf-tot 10-voudige aanzienlijke toename van IFNG-AS1 niveaus. Om uw gewenste gen actief te overexpressen, is het ontwerpen van het gidsRNA in stap 2.1 van cruciaal belang voor het succes van het protocol. Bovendien zorgt de productie van virale deeltjes van hoge kwaliteit voor een robuuste expressie van uw protocolcomponenten.

Zodra het gewenste gen is overuitgedrukt, functionele studies kunnen worden uitgevoerd om de genmechanismen te onderzoeken. In ons voorbeeld hebben we ervoor gekozen om te kijken naar cytokine productie na overexpressie van ons gen van belang. Deze techniek werd in 2013 ontwikkeld door de Griesbach Groep en is breed toegepast en uitgewerkt door andere groepen.

We waren enthousiast om deze techniek toe te passen op lange niet-gecodeerde RNAs om hun specifieke functies te verkennen. Replicatie-defecte lentivirussen moeten worden behandeld in een laboratorium dat is goedgekeurd voor viraal werk. Bovendien worden menselijke cellijnen en E.coli-bacteriën als biogevaarlijk beschouwd.

Ten slotte moet recombinant DNA plasmiden worden behandeld door opgeleid personeel.