Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

De standaard manier om een stamcel te verkrijgen uit tandheelkundige pulp is slecht efficiënt, en dit hangt af van verschillende variabele. Ons protocol toegestaan om een succesvolle isolatie van stamcel van behandelde tanden te verkrijgen in 90% van de gevallen. Het verkrijgen van een hoog aantal cellen in een paar weken is het belangrijkste voordeel.

Dat stelt ons in staat om de cel te gebruiken in regeneratieve geneeskunde en om een biobank te creëren die andere wetenschappers van dit nuttige hulpmiddel voorziet. De procedure voor het openen van de tand zal worden uitgevoerd door Dr.Constantino Santacroce. Vervolgens zal het protocol worden getoond door Stefano Martellucci, de promovendus van mijn lab, die de eerste auteur van het artikel is.

Om te beginnen, haal de derde kies uit de patiënt, spoel het snel af met PBS, stop in een 15-milliliter reageerbuis met het medium en breng deze in minder dan twee uur naar het laboratorium. Onder een biohazard kap, gebruik een snijder om de tand te openen door een coronale snijpas, parallel en raaklijn, door het dak van de pulpkamer. Verwijder met een kleine graafmachine voorzichtig de pulp en plaats deze in een reageerbuis.

Was vervolgens drie keer met PBS en vercentrifuge 10 minuten bij 2,500 g bij kamertemperatuur. Verwijder na de centrifugatie de supernatant. Resuspend de pellet in Hank's oplossing, en breng het monster naar een petrischaaltje.

Verwijder de oplossing van de Hank door centrifugeren op 2, 500 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Dan, met een wegwerp scalpel, verdeel de pulp in ongeveer een millimeter plakjes, en voeg een milliliter van type IV collagenase. Vervolgens centrifugeren het monster op 2, 500 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Verwijder de supernatant, en resuspend de pellet in het medium. Kweek het in een T25-kolf die specifiek is voor stamcellen bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide. Tijdens de incubatietijd wijzigt u het cultuurmedium om de drie dagen.

Zodra de aanhangende cellen samenvloeiing bereiken, voeg een milliliter trypsine-EDTA oplossing aan de cellen om ze los te maken, en de cellen in te broeden op 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Voeg vervolgens vier milliliter van het kweekmedium toe in een één-op-vijf-verhouding om de trypsine-actie te stoppen en de celsuspensie zes minuten lang te centrifugeren bij 259 keer g. Verwijder de supernatant.

Plaats vervolgens de cellen in een T25-kolf om zich voort te planten. Maak de cellen vervolgens drie minuten los met een milliliter trypsine-EDTA bij 37 graden Celsius. Centrifuge de celsuspensie op 259 keer g gedurende zes minuten.

Verwijder de supernatant en ga verder met het testen van de cellen op cytofluorimetrische analyse. Om de voorbijgaande priipleïteïne-eiwituitschakelingsstap uit te voeren, kweekt de menselijke tandpulpstcellen eerst gedurende 24 uur in zes-putplaten met twee milliliter van het kweekmedium. Voeg vervolgens 400 microliter van het kleine storende RNA PrP-medium toe aan elk monster en broed ze zes uur lang uit met 37 graden Celsius.

Zonder siRNA PrP-medium weg te gooien, voeg 1,6 milliliter van het kweekmedium toe in een één-op-vijf-verhouding en laat u de cellen gedurende 72 uur op 37 graden Celsius staan. Na de incubatietijd, verwijder de supernatant, en was de cellen met twee milliliters PBS drie keer bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens twee milliliter van het neuronale kweekmedium toe en houd de cellen zeven tot 14 dagen in een incubator op 37 graden Celsius.

Na de incubatietijd, was de cellen met twee milliliters PBS drie keer bij kamertemperatuur, en ga naar westerse vlekanalyse om te testen op neuronale oppervlakteantigenen. Om het neuronale inductieproces uit te voeren, kweekt u 2 miljoen menselijke tandpulpcellen in zes-putplaten, tot 28 dagen na de pulpscheiding. Om de drie dagen, gooi de supernatant weg.

Was drie keer met twee milliliter PBS bij kamertemperatuur en vervang twee milliliter van het neuronale kweekmedium. Na zeven tot 14 dagen, los de cellen met een milliliter trypsin-EDTA op 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Voeg vervolgens vier milliliter van het kweekmedium toe in een een-op-vijf-verhouding om de trypsine-actie te stoppen.

Om de menselijke tandpulp stamcellen te karakteriseren door flow cytometrie, cultuur 2 miljoen per milliliter van de cellen in zes-put platen met twee milliliter van het cultuurmedium. Voeg na 28 dagen na de tandheelkunde pulpscheiding of na een extra 14 dagen met neuronaal kweekmedium een milliliter van de trypsine-EDTA bij 37 graden Celsius toe gedurende drie minuten om de cellen los te maken. Voeg vervolgens vier milliliter van het kweekmedium toe in een één-op-vijf-verhouding om de trypsine-actie te stoppen en centrifugate bij 259 keer g bij kamertemperatuur gedurende zes minuten.

Bevestig de onbehandelde of behandelde cellen met 300 microliter van 4% paraformaldehyde in PBS op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Vervolgens centrifuge, gooi de supernatant, en permeabiliseren van de cellen met 1% niet-ionische oppervlakteactieve stoffen in PBS op kamertemperatuur voor een extra 10 minuten. Dan, centrifuge opnieuw, gooi de supernatant, en voer de blokkering met 5% vetvrije gedroogde melk in een milliliter PBS op kamertemperatuur gedurende een uur.

Was drie keer met een milliliter PBS, en incubeer de cellen met anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-drie-tubuline, anti-NFH, en anti-GAP43 monoklonale antilichamen bij kamertemperatuur gedurende een uur. Vervolgens centrifugeren de cellen opnieuw drie opeenvolgende keer met een milliliter PBS op zes minuten intervallen, en vervolgens inbroed met anti-muis PE of anti-konijn CY5 monoklonale antilichamen bij kamertemperatuur gedurende een extra uur. Gebruik de secundaire antilichamen voor het gating van de immuun-positieve cellen, en analyseren alle monsters met een stroom cytometer.

Cultuur 2 miljoen cellen per milliliter van de menselijke tandpulp stamcellen in zes-put platen met twee milliliter van het cultuurmedium. Voeg na 28 dagen na de tandheelkundige pulpscheiding of na nog eens zeven tot 14 dagen met het neuronale kweekmedium een milliliter van de trypsine-EDTA bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten toe om de cellen los te maken. Dan, centrifuge, gooi de supernatant, en bevestig vervolgens de exemplaren met 4% paraformaldehyde in PBS op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Vervolgens centrifuge, gooi de supernatant, en vervolgens doordringen met 1% niet-ionische oppervlakteactieve in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant, en vlek de cellen met konijn anti-PrP monoklonale antilichaam bij kamertemperatuur gedurende een uur. Tot slot, centrifuge, gooi de supernatant, en vervolgens incubeer met anti-konijn CY5 monoklonale antilichaam op kamertemperatuur voor een extra uur.

Analyseer alle monsters met een stroomcytometer. Na de pulpscheiding werden clusters van menselijke tandpulpstamcellen aan de periferie uitgebreid. Een vergelijking tussen de groei van deze cellen voor en na de neuronale differentiatie veroorzaakt door EGF/bFGF toonde significante veranderingen in de celmorfologie en de uitgroei van neurites.

Onbehandelde menselijke tandpulp stamcellen uitgedrukt multipotent mesenchymale stromale specifieke oppervlakte antigenen, zoals CD44, CD90, CD105, CD73, en STRO-1. Na de juiste neuronale inductie stimuli, deze cellen uitgedrukt specifieke neuronale markers, zoals bèta-drie-tubuline, NFH, en GAP43. Onbehandelde of behandelde cellen drukten geen hematopoietische markers uit, zoals CD14 en CD19.

Na 28 dagen werd prion-eiwit vroegrijp uitgedrukt in menselijke tandpulpstamcellen in vergelijking met de overeenkomstige negatieve controle, en de expressie ervan werd verhoogd na het neuronale differentiatieproces veroorzaakt door EGF/bFGF. Westerse vlekanalyse toonde aan dat het uitschakelen van het prion-eiwit door sRNA vóór EGF/bFGF-stimuli het neuronale differentiatieproces van menselijke tandpulpcellen kan beïnvloeden door de expressie van neuronale markers bèta-drie-tubuline en NHF te voorkomen. Het belangrijkste is de keuze van het enzym om de cellen te scheiden van de pulp.

In feite, als het enzym te agressief is, kunnen de cellen beschadigd raken en hun groei- en differentiatiecapaciteit kunnen worden aangetast. De tandpulp stamcellen zijn een uitstekend experimenteel model dat kan worden gebruikt in vivo en in vitro studies in de regeneratieve geneeskunde veld. Aangezien PrP speelt een belangrijke rol in neuronale differentiatie proces van tandheelkundige pulp stamcellen, deze marker kan een uitstekende kandidaat als effectief doelwit in neurodegeneratieve ziekten.

Het belangrijkste aspect om te adviseren is de gezondheidstoestand van de patiënten, zoals de afwezigheid van infectieziekten.