Name: Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Leer een efficiënte protocol voor isolatie en vermeerdering van humane tandmergstamcellen met evaluatie van prion-eiwitexpressie tijdens neuronale differentiatie. Deze methode verbetert regeneratieve geneeskunde-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de "Fondazione Varrone" en Rieti Universiteit Hub "Sabina Universitas" aan Vincenzo Mattei.
Figuur 5 (A, B) herdrukt met toestemming van de uitgever, Taylor & Francis Ltd uit: rol van Prion-eiwit-EGFR multimolecular complex tijdens neuronale differentiatie van menselijke tandheelkundige pulp-afgeleide cellen van de stam. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C. Santilli F. Piccoli L., Sorice M., Mattei V. Prion. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.

Derde kiezen gebruikt in de studie werden weggesneden uit patiënten (13-19 jaar) met geen voorafgaande geschiedenis van drugs- of alcoholgebruik, alle niet-rokers en passende mondhygiëne. Op de dag van de uitleg, bij het departement wetenschap tandheelkunde en Maxillofacial van "Sapienza" Universiteit van Rome, was geïnformeerde toestemming verkregen van de patiënt of de ouders. Geïnformeerde toestemming werd verkregen op basis van ethische overwegingen en goedkeuring van de ethische commissie.
1. tand en tandmerg extractie
<ol><li>
Voorbereiding van geschikte voedingsbodem voor de instandhouding of het vervoer.
	<ol>
<li>Bereiden van Dulbecco bewerkt Eagle's medium lage concentratie van glucose (DMEM-L) met L-glutamine (494.5 mL).</li>
		<li>Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%) en 0,5 mL amfotericine (0,1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>De derde Kies extract van de patiënt, snel spoelen met PBS, zet in een tube van 15 mL test met het medium en overbrengen naar het laboratorium in minder dan 2 h.</li>
	<li>Onder de motorkap van een biohazard, open de tand met een kotter bij coronale snijden doorgang parallel en tangent door het dak van de pulp kamer.</li>
	<li>Zachtjes Verwijder het vruchtvlees met een kleine graafmachine en plaats deze in een reageerbuis.</li>
	<li>Wassen met PBS driemaal samen en centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 10 minuten op RT.</li>
</ol>2. de verwerking van het tandmerg en de introductie van de cel van de stam
<ol><li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in Hank's oplossing plaatst u deze in een petrischaal. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in 5% CO2.</li>
	<li>
Typ IV collagenase oplossing voorbereiding.
	<ol>
<li>Bereiden van 0,8 mL van DMEM-L.</li>
		<li>Smelten van 1 mg van type IV collagenase in 0,8 mL DMEM-L en vortex gedurende enkele minuten.</li>
		<li>Toevoegen van DMEM-L hebben een eindconcentratie tot 1 mL 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtreer de oplossing met een 0,22 µM filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijderen van Henks oplossing door centrifugatie bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij RT en verdelen van de pulp in kleine plakjes ongeveer 1 mm van elkaar met een disposable scalpel.</li>
	<li>Plaats van de segmenten van de pulp in een petrischaal en incubeer met 1 mL van type IV collagenase gedurende 15 minuten bij 37 ° C in 5% CO2.</li>
	<li>
Middellange cultuur voorbereiding (500 mL).
	<ol>
<li>445 ml DMEM-L met L-glutamine.</li>
		<li>Voeg 50 mL van foetale runderserum (FBS) (10%).</li>
		<li>Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 2.500 x g gedurende 10 minuten op RT, verwijder de bovendrijvende substantie, resuspendeer de pellet in het medium (stap 2.5) en cultuur in T25 kolf specifiek voor stamcel bij 37 ° C in 5% CO2.</li>
</ol>3. de cel van de stam cultuur en vermeerdering
<ol><li>Elke dag Controleer de cultuur en na 3 dagen van de groei, het observeren van verschillende klonen van Adherente cellen binnen de kolf.</li>
	<li>Om de 3 dagen wijzigen het kweekmedium.</li>
	<li>Tussen 7 en 12 dagen, eenmaal de Adherente cellen bereik samenvloeiing, loskoppelen hen door de behandeling van de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of voorzichtig met behulp van een cel schraper.</li>
	<li>Voeg 4 ml (verhouding 1:5) van het kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen.</li>
	<li>Centrifugeren van de celsuspensie voor 6 min bij 259 x g, verwijder het supernatant en plaats van de cellen in een maatkolf van T25 doorgeven. Opmerking: Om de 3 dagen de cellen bereiken samenvloeiing.</li>
	<li>Het propageren van de cellen tot 21 of 28 dagen (ongeveer 6-8 passages) de aanwezigheid van niet-stam als cellen in de cultuur te voorkomen.</li>
	<li>Loskoppelen van de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of voorzichtig afschrapen. De celsuspensie voor 6 min bij 259 x gcentrifugeren.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en testen van de cellen voor cytofluorimetric analyse (stap 6).</li>
</ol>4. Pre-steady PrPC Silencing door siRNA
<ol><li>Cultuur van de hDPSCsin 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5) gedurende 24 uur.</li>
	<li>
Overmorgen, bereiden siRNA PrP medium (400 µL).
	<ol>
<li>Voeg aan een steriele reageerbuis, 384 µL DMEM-L.</li>
		<li>Voeg 1 µL voor elk type van siRNA PrP naar DMEM-L om een eindconcentratie van 5 nM (4 siRNA PrP werden gebruikt en geverifieerd door de leverancier te waarborgen van een vechtpartij efficiëntie ≥70%).</li>
		<li>Voeg 12 µL van transfectionreagent naar DMEM-L.</li>
		<li>Vortex het mengsel en incubeer gedurende 10 min op RT dat de vorming van transfectie complexen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 μL van siRNA PrP medium toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Voeg zonder teruggooi siRNA PrP medium, 1.6 mL (verhouding van 1 tot en met 5) kweekmedium (stap 2.5).</li>
	<li>Laat de cellen gedurende 72 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en was 3 keer met 2 mL PBS op RT.</li>
	<li>Voeg 2 mL neuronale kweekmedium voor 7 en/of 14 dagen (stap 5.1).</li>
	<li>De neuronale kweekmedium elke 3 dagen wijzigen. Opmerking: Vervang de siRNA PrP oplossing elke keer vervangen de neuronale kweekmedium.</li>
	<li>Aan het einde van de tijd, was 3 keer met 2 mL PBS op RT en test voor neuronale oppervlakte antigenen door analyse van de Western Blot.</li>
</ol>5. de neuronale inductie proces van hDPSCs
<ol><li>
Neuronale kweekmedium voorbereiding (500 mL).
	<ol>
<li>Voorbereiden 444.7 mL van basale media geformuleerd naar neuronale cellen.</li>
		<li>Voeg 50 mL van serumvrij supplement gebruikt ter ondersteuning van de levensvatbaarheid op lange termijn van embryonale en volwassen neuronale stamcellen (10%) op het medium.</li>
		<li>200 µL van fundamentele Fibroblast Growth Factor (bFGF) (eindconcentratie 40 ng/mL) en 100 µL van de epidermale groeifactor (EGF) toevoegen aan het medium (eindconcentratie 20 ng/mL).</li>
		<li>Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%) aan het medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultuur hDPSCs in 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) tot 28 dagen van de scheiding van de pulp en hen te stimuleren met 2 mL neuronale kweekmedium.</li>
	<li>Om de 3 dagen Verwijder het supernatant, was 3 keer met 2 mL PBS op RT en vervangen van 2 mL van de neuronale voedingsbodem.</li>
	<li>Na 7 en/of 14 dagen, loskoppelen de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of zachtjes met een schraper.</li>
	<li>Voeg 4 mL (verhouding 1:5) van kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen.</li>
	<li>Testen op de aanwezigheid van neuronale oppervlakte antigenen (stap 6) of het prion-eiwit expressie (stap 7) door stroom cytometry analyse.</li>
</ol>6. karakterisering van hDPSCs door Stroom Cytometry
<ol><li>Selecteer mesenchymale stromale (MSC)-specifieke of neuronale oppervlakte antigenen.</li>
	<li>Cultuur van de hDPSCs in 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5).</li>
	<li>Loskoppelen hDPSCs na 28 dagen vanuit tandmerg scheiding of na 14 dagen van neuronale kweekmedium (stap 5.1) met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of zachtjes schraper.</li>
	<li>Voeg 4 ml (verhouding 1:5) van kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen en centrifugate op 259 x g voor 6 min op RT. wassen andere 2 keer met 2 mL PBS op RT.</li>
	<li>Herstellen van de hDPSCs onbehandeld of behandeld met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize hDPSCS met 0,1% (v/v) niet-ionogene oppervlakteactieve stof in PBS voor extra 10 min op RT.</li>
	<li>Uitvoeren van de afscherming met 5% nonfat melkpoeder in 1 mL PBS voor 1 h op RT.</li>
	<li>Was 3 keer met 1 mL PBS en Incubeer de cellen met anti-CD105 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD44 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-STRO-1 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD90 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD73 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti β3-tubuline (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-NFH (1:100 / 5 x 105 cellen) en anti-GAP43 (1:100 / 5 x 105 cellen) mAb gedurende 1 uur op RT.</li>
	<li>Spoel de cellen 3 keer met 1 mL PBS en incubeer met anti-muis PE (1:50 / 5 x 105 cellen) of anti-konijn CY5 (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb voor extra 1 h op RT.</li>
	<li>Gebruiken van de secundaire antilichamen voor de cellen van de immunopositive (anti-muis PE of anti-konijn CY5 mAb) gating en analyseren van alle monsters met een stroom cytometer en verwerven van minstens 20.000 gebeurtenissen.</li>
</ol>7. evaluatie van PrPC expressie in hDPSCs door Stroom Cytometry analyse
<ol><li>Cultuur van de hDPSCsin 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5).</li>
	<li>Ontkoppelen van hDPSCs op 21 en 28 dagen van tandmerg scheiding en na 7 en/of 14 dagen met neuronale kweekmedium (stap 5.1) met 1 mL trypsine-EDTA en stoppen van de trypsine actie, zoals beschreven in stap 6.4. Herstellen van de specimens met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilize met 0,1% (v/v) niet-ionogene surfactantin PBS voor 10 min op RT. Verwijder het supernatant en vlekken van de cellen met konijn anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb gedurende 1 uur op RT. Incubate met anti-konijn CY5 (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb voor extra 1 h op RT.</li>
	<li>Analyseren van alle monsters met een stroom-cytometer en het verwerven van minstens 20.000 gebeurtenissen.</li>
</ol>

<ol><li>Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+assays%3A+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 1-49 (2002).</li>
<li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).</li>
<li>Zannettino, A. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-potential+Human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipid+rafts+in+neuronal+differentiation+of+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells.</a> Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).</li>
<li>Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).</li>
<li>Young, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+in+the+neuronal+and+glial+differentiation+of+dental+pulp+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells.</a> Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).</li>
<li>Pisciotta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells+%28hDPSCs%29%3A+isolation%2C+enrichment+and+comparative+differentiation+of+two+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations.</a> BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).</li>
<li>Atari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+of+the+third+molar%3A+a+new+source+of+pluripotent-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells.</a> Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).</li>
<li>Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+pluripotency+in+human+dental+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+oral+and+maxillofacial+surgery%3A+official+journal+of+the+American+Association+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells.</a> Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).</li>
<li>Gronthos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).</li>
<li>Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+dental+pulp+stem+cells+differentiate+toward+functionally+active+neurons+under+appropriate+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues.</a> Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskakov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+is+involved+in+controlling+cell+cycle+dynamics%2C+self-renewal%2C+and+the+fate+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).</li>
<li>Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+%28PrPc%29+positively+regulates+neural+precursor+proliferation+during+developmental+and+adult+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).</li>
<li>Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+cellular+prion+protein%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The biological function of the cellular prion protein: an update.</a> BMC Biology. 15, 34(2017).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+cellular+prion+protein+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+contributes+to+apoptosis+execution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).</li>
<li>Linden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Function+of+the+Prion+Protein%3A+A+Cell+Surface+Scaffold+of+Signaling+Modules%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).</li>
<li>Garofalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+raft-like+microdomains+in+the+regulation+of+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis.</a> Apoptosis. , 621-634 (2015).</li>
<li>Watt, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+beta-cleavage+of+the+prion+protein+in+the+cellular+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Withdrawal+Modifies+Prion+Protein+Expression+in+Rat+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus.</a> PLoS One. 12, 0169571(2017).</li>
<li>Hu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+proteins%3A+physiological+functions+and+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders.</a> Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).</li>
<li>Sorice, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+PrPC+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+during+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis.</a> Prion. 6, 354-358 (2012).</li>
<li>Martellucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Prion+protein-EGFR+multimolecular+complex+during+neuronal+differentiation+of+human+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells.</a> Prion. 12 (2), 117-126 (2018).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskokov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+guides+the+differentiation+of+human+embryonic+stem+cell+into+neuron-%2C+oligodendrocyte-+and+astrocyte-committed+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages.</a> Prion. 8, 266-275 (2014).</li>
<li>Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+human+dental+pulp+cells%3A+various+isolation+methods+and+culturing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments.</a> Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).</li>
<li>Suchanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells+and+their+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+papers+of+the+Medical+Faculty+of+the+University+Palack%C3%BD%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells and their characterization.</a> Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).</li>
<li>Bressan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age-related+biological+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells+change+in+nanostructured+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), 49146(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit werk, we gericht op methodologie voor isolatie en neuronale differentiatie van hDPSCs; we geëvalueerd bovendien de rol van PrPC in dit proces. Er zijn verschillende methoden om te isoleren en hDPSCs in neuron-achtige cellen en kritische stappen onderscheiden tijdens het proces. hDPSCs zijn bekwaam om te onderscheiden in verschillende geslachten zoals chondroblasts, adipocytes, botcellen en neuronen. In onze papier onderzochten we de mechanismen voor Neuronale Differentiatie en de aanwezigheid van PrP<su...

Mesenchymale stamcellen zijn geïsoleerd uit verschillende weefsels, met inbegrip van het beenmerg, navelstrengbloed, menselijke tandmerg, adipeus weefsel en bloed1,2,3,4,5 , 6. zoals gemeld door verschillende auteurs, hDPSCs kunststof hechting, een typische morfologie van de fibroblast-achtige Toon. Deze vertegenwoordigen een zeer heterogene populatie met verschillende klonen en verschillen in proliferatieve en onderscheidende capaciteit7,8. hDPSCs express specifieke markers voor mesenchymale stamcellen (d.w.z. CD44 CD90, CD73, CD105, STRO-1), ze zijn negatief voor sommige hematopoietische gegevensmarkeringen (bijvoorbeeld in CD14 en CD19) en zijn geschikt voor in-vitro differentiatie van de multilineage9, 10,11.
Verschillende auteurs hebben aangetoond dat deze cellen zijn bekwaam om te onderscheiden in neuron-achtige cellen met behulp van verschillende protocollen, waaronder de toevoeging van de NGF, bFGF, EGF in combinatie met de specifieke media en supplementen7,12. Ook veel eiwitten zijn betrokken neuronale differentiatie tijdens, en daaronder verscheidene papers Toon een relevante rol en aanzienlijke expressie van cellulaire prion-eiwit PrP (C), beide in embryonale en volwassen stamcellen13, 14. PrPC vertegenwoordigt een pleiotropic molecuul staat van het uitvoeren van verschillende functies binnen cellen als koper metabolisme, apoptosis, en weerstand tegen oxidatieve stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
We onderzochten in onze eerdere papier23, de rol van PrPC in het proces van de neuronale differentiatie hDPSCs. In feite, hDPSCs express precociously PrPC en, na de neuronale differentiatie, was het mogelijk om een extra verhoging van observeren. Andere auteurs hypothetische een mogelijke rol van PrPC in processen van de neuronale differentiatie van stamcellen. Inderdaad, PrPC drijft de differentiatie van menselijke embryonale stamcellen in neuronen, oligodendrocyten en de astrocyten24. Het doel van deze studie was om te benadrukken de methodologie voor het verkrijgen van stamcellen van tandmerg, zijn differentiatie-proces en de rol van PrPC tijdens neuronale differentiatie.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Het wordt gebruikt om celkweekmedia aan te vullen, het is een polyeen antischimmel antibioticum van Streptomyce</td></tr><tr><td>Anti-B3tubulin</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp;</td><td>#4466</td><td>Een van de zes B-tubuline-isovormen, het wordt sterk tot expressie gebracht tijdens de foetale en postnatale ontwikkeling, blijft hoog in het perifere zenuwstelsel</td></tr><tr><td>Anti-CD105&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>Endoglin (CD105), een belangrijk glycoproteïne van menselijk vasculair endotheel, is een type I integraal membraaneiwit met een groot extracellulair gebied, een hydrofobe transmembraanregio en een kort cytoplasmatisch staartje</td></tr><tr><td>Anti-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>Positieve celmarkeringsantilichamen gericht tegen mesenchymale stamcellen</td></tr><tr><td>Anti-CD73&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73 is een glycosylfosfatidylinositol-geankerde, membraangebonden glycoproteïne van 70 kDa die de hydrolyse van extracellulaire nucleosidemonofosfaten in bioactieve nucleosiden katalyseert</td></tr><tr><td>Anti-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>Positieve celmarkeringsantilichamen gericht tegen mesenchymale stamcellen</td></tr><tr><td>Anti-GAP43&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp;</td><td>#8945</td><td>Is een zenuwstelselspecifiek, groei-geassocieerd eiwit in groeikonen en gebieden met hoge plasticiteit</td></tr><tr><td>Anti-mouse PE&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>Is een antilichaam dat wordt gebruikt in flowcytometrie of FACS-analyse</td></tr><tr><td>Anti-NFH&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp;</td><td>#2836</td><td>Is een antilichaam dat endogene niveaus van totaal Neurofilament-H-eiwit detecteert</td></tr><tr><td>Anti-PrP mAb EP1802Y&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>Konijnenmonoklonaal [EP 1802Y] voor PrP-prion-eiwit</td></tr><tr><td>Anti-rabbit CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>Is een antilichaam dat wordt gebruikt in flowcytometrie of FACS-analyse</td></tr><tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>Positieve celmarkeringsantilichamen gericht tegen mesenchymale stamcellen</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco by life technologies</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp; kan worden gebruikt om de inductie van humane neurale stamcellen (hNSCs) uit pluripotente stamcellen (PSCs), uitbreiding van hNSCs, differentiatie van hNSCs en onderhoud van volwassen gedifferentieerde neuronen in cultuur te ondersteunen</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 flow cytometer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>Flowcytometer uitgerust met een blauwe laser (488 nm) en een rode laser (640 nm)</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Software&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Bestuurt het BD Accuri C6 flowcytometersysteem om gegevens te verzamelen, statistieken te genereren en resultaten te analyseren</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>basic Fibroblast Growth Factor&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuge CL30R</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>het is een apparaat dat wordt gebruikt voor de scheiding van vloeistoffen, gas of vloeistof, op basis van dichtheid</td></tr><tr><td>CO2 Incubator 3541</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>het zorgt voor optimale en reproduceerbare groeiomstandigheden voor celculturen</td></tr><tr><td>Collagenase, type IV&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>Collagenase is een protease die de binding tussen een neutraal aminozuur (X) en glycine in de sequentie Pro-X-Glyc-Pro klieft, die met hoge frequentie in collageen wordt aangetroffen</td></tr><tr><td>Disposable scalpel&nbsp;</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>Het wordt gebruikt om weefsels te snijden</td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium Laag Glucose met L-Glutamine met Natrium Pyruvaat</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>Epidermale Groeifactor&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS is een populair media-supplement omdat het een breed scala aan functies in celcultuur biedt. FBS levert voedingsstoffen, groei- en hechtingsfactoren en beschermt cellen tegen oxidatieve schade en apoptose door mechanismen die moeilijk te reproduceren zijn in serumvrije media (SFM) systemen</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter</td><td>Sarstedt</td><td>831,823,101</td><td>het is een apparaat dat wordt gebruikt voor het filteren van oplossingen</td></tr><tr><td>Flexitube GeneSolution for PRNP</td><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>4 siRNA's voor Entrez-gen 5621. Doelsequentie N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp; N.4&nbsp; CAGTGACTATGAGGACCGTTA</td></tr><tr><td>Hank's solution 1x</td><td>Gibco by life technologies</td><td>240200083</td><td>De essentiële functie van Hanks' Balanced Salt-oplossing is om de pH en osmotische balans te handhaven. Het biedt ook water en essentiële anorganische ionen aan cellen</td></tr><tr><td>HiPerFect Transfection Reagent&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>HiPerFect Transfectiereagens is een unieke mix van cationische en neutrale lipiden die effectieve siRNA-opname en efficiënte afgifte van siRNA in cellen mogelijk maakt, resulterend in hoge gen-knockdown, zelfs bij gebruik van lage siRNA-concentraties</td></tr><tr><td>Neurobasal A&nbsp;</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A Medium is een basaal medium dat is ontworpen voor langetermijnonderhoud en rijping van pure post-natale en volwassen hersenneuronen&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Paraformaldehyde is gebruikt voor het fixeren van cellen en weefselsecties tijdens kleuringsprocedures</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>Het wordt gebruikt om celkweekmedia aan te vullen om bacteriële besmetting te beheersen</td></tr>

isolatie, vermeerdering en prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Bio-ethische kwesties in verband met de manipulatie van embryonale stamcellen hebben belemmerd vooruitgang op het gebied van medisch onderzoek. Om deze reden is het zeer belangrijk voor het verkrijgen van volwassen stamcellen uit verschillende weefsels zoals adipeus, bloed, navelstrengbloed en beenmerg. Onder de mogelijke bronnen is tandmerg bijzonder interessant omdat het is gemakkelijk te verkrijgen met betrekking tot bio-ethische overwegingen. Inderdaad, menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen (hDPSCs) zijn een soort van volwassen stamcellen kunnen onderscheiden in neuronale-achtige cellen en kan worden verkregen bij de derde Kies voor gezonde patiënten (13-19 leeftijden). In het bijzonder werd het tandmerg verwijderd met een graafmachine, snijd in kleine plakjes, behandeld met collagenase IV en gekweekt in een maatkolf. Om de neuronale differentiatie, werden hDPSCs gestimuleerd met EGF/bFGF voor 2 weken. Eerder, hebben wij aangetoond dat tijdens de differentiatie wordt de inhoud van cellulaire prion eiwit (PrPC) in hDPSCs verhoogd. De cytofluorimetric-analyse toonde een vroege uiting van PrPC dat na het proces van de neuronale differentiatie is toegenomen. Ablatie van PrPC door siRNA PrP voorkomen neuronale differentiatie geïnduceerd door EGF/bFGF. In deze paper illustreren we dat als we het isolement, de scheiding en de in vitro cultivatie-methoden van hDPSCs met verschillende eenvoudige procedures versterkt, efficiënter cel klonen verkregen en grootschalige uitbreiding van de mesenchymale stamcellen (MSCs werden) werd waargenomen. Ook laten we zien hoe de hDPSCs, verkregen met methoden die zijn beschreven in het protocol, zijn een uitstekend experimenteel model om het proces van de neuronale differentiatie van MSCs en latere cellulaire en moleculaire processen te studeren.

De procedures voor isolatie en afscheiding van de hDPSCs van tandmerg, verkregen uit de derde kies, zijn complexe processen waarin kleine veranderingen een ruïneuze resultaat kan leiden. In dit document gebruiken we het protocol van Arthur et al.. 12 met verschillende verbeteringen. Een representatieve stelsel van procedures is afgebeeld in Figuur 1.
hDPSCs vertegenw...

Hier presenteren we een protocol voor menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen isolatie en vermeerdering teneinde het prion-eiwit expressie tijdens neuronale differentiatie.

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

De standaard manier om een stamcel te verkrijgen uit tandheelkundige pulp is slecht efficiënt, en dit hangt af van verschillende variabele. Ons protocol toegestaan om een succesvolle isolatie van stamcel van behandelde tanden te verkrijgen in 90% van de gevallen. Het verkrijgen van een hoog aantal cellen in een paar weken is het belangrijkste voordeel.Dat stelt ons in staat om de cel te gebruiken in regeneratieve geneeskunde en om een biobank te creëren die andere wetenschappers van dit nuttige hulpmiddel voorziet. De procedure voor het openen van de tand zal worden uitgevoerd door Dr.Constantino Santacroce. Vervolgens zal het protocol worden getoond door Stefano Martellucci, de promovendus van mijn lab, die de eerste auteur van het artikel is.Om te beginnen, haal de derde kies uit de patiënt, spoel het snel af met PBS, stop in een 15-milliliter reageerbuis met het medium en breng deze in minder dan twee uur naar het laboratorium. Onder een biohazard kap, gebruik een snijder om de tand te openen door een coronale snijpas, parallel en raaklijn, door het dak van de pulpkamer. Verwijder met een kleine graafmachine voorzichtig de pulp en plaats deze in een reageerbuis.Was vervolgens drie keer met PBS en vercentrifuge 10 minuten bij 2,500 g bij kamertemperatuur. Verwijder na de centrifugatie de supernatant. Resuspend de pellet in Hank's oplossing, en breng het monster naar een petrischaaltje.Verwijder de oplossing van de Hank door centrifugeren op 2, 500 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Dan, met een wegwerp scalpel, verdeel de pulp in ongeveer een millimeter plakjes, en voeg een milliliter van type IV collagenase. Vervolgens centrifugeren het monster op 2, 500 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Verwijder de supernatant, en resuspend de pellet in het medium. Kweek het in een T25-kolf die specifiek is voor stamcellen bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide. Tijdens de incubatietijd wijzigt u het cultuurmedium om de drie dagen.Zodra de aanhangende cellen samenvloeiing bereiken, voeg een milliliter trypsine-EDTA oplossing aan de cellen om ze los te maken, en de cellen in te broeden op 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Voeg vervolgens vier milliliter van het kweekmedium toe in een één-op-vijf-verhouding om de trypsine-actie te stoppen en de celsuspensie zes minuten lang te centrifugeren bij 259 keer g. Verwijder de supernatant.Plaats vervolgens de cellen in een T25-kolf om zich voort te planten. Maak de cellen vervolgens drie minuten los met een milliliter trypsine-EDTA bij 37 graden Celsius. Centrifuge de celsuspensie op 259 keer g gedurende zes minuten.Verwijder de supernatant en ga verder met het testen van de cellen op cytofluorimetrische analyse. Om de voorbijgaande priipleïteïne-eiwituitschakelingsstap uit te voeren, kweekt de menselijke tandpulpstcellen eerst gedurende 24 uur in zes-putplaten met twee milliliter van het kweekmedium. Voeg vervolgens 400 microliter van het kleine storende RNA PrP-medium toe aan elk monster en broed ze zes uur lang uit met 37 graden Celsius.Zonder siRNA PrP-medium weg te gooien, voeg 1,6 milliliter van het kweekmedium toe in een één-op-vijf-verhouding en laat u de cellen gedurende 72 uur op 37 graden Celsius staan. Na de incubatietijd, verwijder de supernatant, en was de cellen met twee milliliters PBS drie keer bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens twee milliliter van het neuronale kweekmedium toe en houd de cellen zeven tot 14 dagen in een incubator op 37 graden Celsius.Na de incubatietijd, was de cellen met twee milliliters PBS drie keer bij kamertemperatuur, en ga naar westerse vlekanalyse om te testen op neuronale oppervlakteantigenen. Om het neuronale inductieproces uit te voeren, kweekt u 2 miljoen menselijke tandpulpcellen in zes-putplaten, tot 28 dagen na de pulpscheiding. Om de drie dagen, gooi de supernatant weg.Was drie keer met twee milliliter PBS bij kamertemperatuur en vervang twee milliliter van het neuronale kweekmedium. Na zeven tot 14 dagen, los de cellen met een milliliter trypsin-EDTA op 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Voeg vervolgens vier milliliter van het kweekmedium toe in een een-op-vijf-verhouding om de trypsine-actie te stoppen.Om de menselijke tandpulp stamcellen te karakteriseren door flow cytometrie, cultuur 2 miljoen per milliliter van de cellen in zes-put platen met twee milliliter van het cultuurmedium. Voeg na 28 dagen na de tandheelkunde pulpscheiding of na een extra 14 dagen met neuronaal kweekmedium een milliliter van de trypsine-EDTA bij 37 graden Celsius toe gedurende drie minuten om de cellen los te maken. Voeg vervolgens vier milliliter van het kweekmedium toe in een één-op-vijf-verhouding om de trypsine-actie te stoppen en centrifugate bij 259 keer g bij kamertemperatuur gedurende zes minuten.Bevestig de onbehandelde of behandelde cellen met 300 microliter van 4% paraformaldehyde in PBS op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Vervolgens centrifuge, gooi de supernatant, en permeabiliseren van de cellen met 1% niet-ionische oppervlakteactieve stoffen in PBS op kamertemperatuur voor een extra 10 minuten. Dan, centrifuge opnieuw, gooi de supernatant, en voer de blokkering met 5% vetvrije gedroogde melk in een milliliter PBS op kamertemperatuur gedurende een uur.Was drie keer met een milliliter PBS, en incubeer de cellen met anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-drie-tubuline, anti-NFH, en anti-GAP43 monoklonale antilichamen bij kamertemperatuur gedurende een uur. Vervolgens centrifugeren de cellen opnieuw drie opeenvolgende keer met een milliliter PBS op zes minuten intervallen, en vervolgens inbroed met anti-muis PE of anti-konijn CY5 monoklonale antilichamen bij kamertemperatuur gedurende een extra uur. Gebruik de secundaire antilichamen voor het gating van de immuun-positieve cellen, en analyseren alle monsters met een stroom cytometer.Cultuur 2 miljoen cellen per milliliter van de menselijke tandpulp stamcellen in zes-put platen met twee milliliter van het cultuurmedium. Voeg na 28 dagen na de tandheelkundige pulpscheiding of na nog eens zeven tot 14 dagen met het neuronale kweekmedium een milliliter van de trypsine-EDTA bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten toe om de cellen los te maken. Dan, centrifuge, gooi de supernatant, en bevestig vervolgens de exemplaren met 4% paraformaldehyde in PBS op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Vervolgens centrifuge, gooi de supernatant, en vervolgens doordringen met 1% niet-ionische oppervlakteactieve in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant, en vlek de cellen met konijn anti-PrP monoklonale antilichaam bij kamertemperatuur gedurende een uur. Tot slot, centrifuge, gooi de supernatant, en vervolgens incubeer met anti-konijn CY5 monoklonale antilichaam op kamertemperatuur voor een extra uur.Analyseer alle monsters met een stroomcytometer. Na de pulpscheiding werden clusters van menselijke tandpulpstamcellen aan de periferie uitgebreid. Een vergelijking tussen de groei van deze cellen voor en na de neuronale differentiatie veroorzaakt door EGF/bFGF toonde significante veranderingen in de celmorfologie en de uitgroei van neurites.Onbehandelde menselijke tandpulp stamcellen uitgedrukt multipotent mesenchymale stromale specifieke oppervlakte antigenen, zoals CD44, CD90, CD105, CD73, en STRO-1. Na de juiste neuronale inductie stimuli, deze cellen uitgedrukt specifieke neuronale markers, zoals bèta-drie-tubuline, NFH, en GAP43. Onbehandelde of behandelde cellen drukten geen hematopoietische markers uit, zoals CD14 en CD19.Na 28 dagen werd prion-eiwit vroegrijp uitgedrukt in menselijke tandpulpstamcellen in vergelijking met de overeenkomstige negatieve controle, en de expressie ervan werd verhoogd na het neuronale differentiatieproces veroorzaakt door EGF/bFGF. Westerse vlekanalyse toonde aan dat het uitschakelen van het prion-eiwit door sRNA vóór EGF/bFGF-stimuli het neuronale differentiatieproces van menselijke tandpulpcellen kan beïnvloeden door de expressie van neuronale markers bèta-drie-tubuline en NHF te voorkomen. Het belangrijkste is de keuze van het enzym om de cellen te scheiden van de pulp.In feite, als het enzym te agressief is, kunnen de cellen beschadigd raken en hun groei- en differentiatiecapaciteit kunnen worden aangetast. De tandpulp stamcellen zijn een uitstekend experimenteel model dat kan worden gebruikt in vivo en in vitro studies in de regeneratieve geneeskunde veld. Aangezien PrP speelt een belangrijke rol in neuronale differentiatie proces van tandheelkundige pulp stamcellen, deze marker kan een uitstekende kandidaat als effectief doelwit in neurodegeneratieve ziekten.Het belangrijkste aspect om te adviseren is de gezondheidstoestand van de patiënten, zoals de afwezigheid van infectieziekten.

isolation-propagation-prion-protein-expression-during-neuronal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door...

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

This video showcases a technique for establishing a co-culture of trigeminal neurons and primary dental pulp cells using a transwell filter. In this physically separated condition, mesenchymal cells obtained from dental pulp tissue secrete paracrine signaling molecules that traverse through the pores, promoting the differentiation and migration of neurons towards the mesenchymal cells establishing a co-culture system.

Establishing a Co-Culture of Dental Pulp Cells and Trigeminal Neurons for Cross-Communication

This video demonstrates the process of inducing human pluripotent stem cells to differentiate into neurons by transfecting them with engineered lentiviruses carrying a neurogenic transcription factor gene under the control of  tetracycline-responsive element, followed by treatment with a tetracycline derivative and maturation medium.

Human Pluripotent Stem Cell Differentiation in Neurons Using Engineered Lentiviruses

Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

We beschrijven de isolatie, dispersie en beplating van tandheelkundige pulp (DP) primaire cellen met trigeminale (TG) neuronen gekweekt bovenop bovenliggende transwell filters. Cellulaire reacties van DP-cellen kunnen worden geanalyseerd met immunofluorescentie of RNA/eiwitanalyse. Immunofluorescentie van neuronale markers met confocale microscopie maakt de analyse van neurite outgrowth reacties mogelijk.

Een co-cultuur methode om Neurite Outgrowth studie in reactie op tandheelkundige pulp paracrine signalen

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding voor het opzetten van een primaire cultuur van stamcellen van tandpulp met behulp van de explantatiecultuurmethode en karakterisering van deze cellen op basis van ICSCRT-richtlijnen. De cellen die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen worden beschouwd als mesenchymale stamcellen voor verdere toepassingen.

Primaire cultuur van stamcellen van tandpulpa

Dit protocol legt de nadruk op de extractie, kweek en conservering van multipotente stamcellen uit tandpulp door middel van enzymatische vergisting. Bovendien toont het hun potentieel aan om te differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, wat het belang van precisie en consistentie in het proces benadrukt.

Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Dit protocol beschrijft de isolatie van varkens-vetafkomstige stamcellen (pADSC) uit subcutaan vetweefsel met onderzoek van multipotentie. De multipotente pADSC worden gebruikt om processen van adipocytendifferentiatie te bepalen en transdifferentiatie in meerdere cellijnen van mesodermaal mesenchym of verdere lijnen van ectoderm en endoderm te bestuderen voor regeneratieve onderzoeken.

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Leer een efficiënte protocol voor isolatie en vermeerdering van humane tandmergstamcellen met evaluatie van prion-eiwitexpressie tijdens neuronale differentiatie. Deze methode verbetert regeneratieve geneeskunde-onderzoek.

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Meer video's verkennen