Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

De toxiciteit testen procedures zullen worden aangetoond door Dr.Ashok Aspatwar, een senior onderzoeker van mijn laboratorium. Ons protocol identificeert off-target effecten en detecteert subtiele toxische effecten van chemische stoffen in de vroege fase van ontdekking die kunnen worden gemist in celkweek of andere diermodellen. De belangrijkste voordelen van onze techniek zijn: het is snel en efficiënt, vereist een zeer kleine hoeveelheid chemische, en de basisfaciliteiten in het laboratorium.

Toxiciteitsscreening zal ons helpen bij het bepalen van de concentratie voor het bestuderen van de efficiëntie ervan tegen mycobacterium dat tuberculose veroorzaakt en voor verdere preklinische berekening. Deze methode maakt gebruik van inzichten in off-target effecten van chemische stoffen, en dus deze methode kan worden gebruikt in elk gebied van onderzoek waar de toxiciteit van chemische is van primair belang. Deze methode is zeer eenvoudig en kan worden uitgevoerd door iedereen zonder voorafgaande ervaring.

Personen zonder ervaring moeten het experiment zorgvuldig plannen en slechts één verbinding gebruiken. Deze methode biedt toxische effecten van de chemische stoffen in de vorm van fenotypische veranderingen in de zich ontwikkelende zebravisembryo's en dus de veiligheid van de geteste verbindingen. Om te beginnen, plaats twee tot vijf volwassen mannelijke zebravissen en drie tot vijf volwassen vrouwelijke zebravissen in paren tanks 's nachts.

In de ochtend, zet het licht als fokken wordt veroorzaakt door de automatische donkere en daaropvolgende lichtcyclus. Om stress voor de dieren te voorkomen, moet u de dieren twee weken laten rusten voordat ze dezelfde personen gebruiken om te fokken. De volgende dag voor de middag, verzamel de embryo's met behulp van een fijne mesh zeef, en breng ze op een petrischaaltje met E3 embryo medium.

Plaats de petrischaal onder een stereomicroscoop om elke partij embryo's te onderzoeken. Identificeer het ondoorzichtige uiterlijk en verwijder ze als onbevruchte of dode embryo's. Houd de embryo's 's nachts op 28,5 graden Celsius in een couveuse.

De volgende ochtend, onderzoek de embryo's onder een stereo microscoop en verwijder alle ongezonde of dode embryo's. Gebruik voorzichtig een pasteur pipet om een embryo over te brengen in elke put van een 24 put plaat. Zorg ervoor dat elke put bevat genoeg E3 medium om de embryo's te dekken.

Haal de flesjes met remmerverbindingen opgeslagen bij 4 graden Celsius in een koelkast. Gebruik een analytische balans om de juiste hoeveelheid van de verbinding te wegen en bereid 250 microliter van 100 millimolar voorraadoplossing voor elke verbinding in E3-medium of een ander geschikt oplosmiddel. Gebruik vervolgens E3-medium om seriële verdunningen van de voorraadoplossingen te maken op basis van toxiciteitsniveaus in 15 milliliter centrifugebuizen.

Gebruik uit de putten die elk één DPF-embryo bevatten, een pasteurpipet en 1 milliliter pipet om het E3-water één rij tegelijk te verwijderen. Verdeel onmiddellijk 1 milliliter van elk verdunningsvermogen van de voorraadoplossingen in de putten van de 24 putplaat die van lagere en het bewegen aan hogere concentratie begint. Voeg voor de controlegroepen E3-water of een ander relevant oplosmiddel toe.

Label 24 goed platen met de naam en concentratie van de verbinding en houd de platen op 28,5 graden Celsius in een couveuse. Zorg ervoor dat de verdunningsmiddelen van de chemicaliën in de putten niet verdampt in de couveuse door het afdichten van de zijkanten van 24 put plaat. Vierentwintig uur na blootstelling van de chemische verbindingen, gebruik een pasteur pipet om de larven blootgesteld aan elke concentratie van de verbinding in een kleine petrischaal met 3% hoog moleculair gewicht methyhylcellulose over te brengen.

Leg het met een metalen sonde zijwaarts. Plaats de petrischaal onder een stereomicroscoop die aan een camera is bevestigd. Neem de afbeeldingen en sla de afbeeldingen elke dag op in een aparte map tot het einde van het experiment.

Voer elke dag alle waarnemingen in een tabel in in een online tabel of op een gedrukt blad. Voor neurotoxische blootstelling aan verbindingen kunnen de vier tot vijf DPF-larven een abnormaal zwempatroon vertonen. Maak in dat geval een record van dergelijke veranderingen door een korte video van 30 seconden tot één minuut van de larven vast te leggen.

Let na vijf dagen blootstelling aan de chemische verbindingen op de concentratie waarbij de helft van de embryo's sterft als de half maximale dodelijke concentratie 50 van elke chemische stof. Maak een curve voor de mortaliteit van embryo's voor alle concentraties met behulp van een geschikt programma. In dit protocol is het cruciale deel van de evaluatie van toxiciteit het testen van verschillende concentraties van een of meerdere chemische verbindingen in één experiment.

Voor de verbindingen die fenotypische defecten in de larven veroorzaken, werden de defecten elke 24 uur geregistreerd gedurende de periode van één tot vijf dagen na blootstelling aan de chemische stof. De embryo's behandeld met bèta-CA-remmers bij de concentraties van 250 micromolar en 125 micromolar vertonen verschillende fenotypische defecten in vergelijking met de controle. Bijvoorbeeld, unhatched embryo's zelfs op dag 3, gebogen lichaamsstructuur, ongebruikte dooierzak en hart-iemetaal oedeem, en afwezigheid van otolietzakjes in de larven op vijf dagen na de behandeling.

In een andere studie toonden de embryo's die met CA-remmers werden behandeld de afwezigheid van otolietzakjes en zwemblaas. De experimenten identificeerden een representatieve samenstelling carbonische anhydrase 9, die minimale of geen fenotypische veranderingen tijdens de embryonale ontwikkeling bij 500 micromolar veroorzaakte. De verbinding vertoonde een hoge LC50-concentratie.

Echter, in een vergelijking met een controle, dezelfde verbinding op 300 micromolar bleek te zijn neurotoxisch en geïnduceerde ataxie in de larven na vijf dagen van blootstelling. Een goede kwaliteit van embryo's is belangrijk voor toxiciteitsscreening van chemische stoffen. Voor het verkrijgen van embryo's van goede kwaliteit, gebruik jonge paar volwassen zebravissen voor de fokkerij.

De verbindingen die als veilig naar voren komen, kunnen verder worden gekenmerkt door het uitvoeren van relevante in vitro en in vivo experimenten. Op het gebied van de ontwikkeling van antituberculosegeneelingen hielp deze techniek bij het opzetten van verdere experimenten voor in vivo remming van mycobacterium marinum in zebravisembryo's. Het protocol omvat het gebruik van chemische stoffen die giftig kunnen zijn voor de mens.

Personen die betrokken zijn bij de experimenten moeten de juiste zorg bij de behandeling van de chemische stoffen.