Identificeren van aminozuur Overproducers met behulp van zeldzame-codon-Rich markers

Deze methode biedt een efficiënt alternatief voor de conventionele analoge benadering bij het verkrijgen van aminozuur overproducers. Deze techniek bestendigt de traditionele op analoge basis gebaseerde methode door tegelijkertijd nauwkeurigheid, gevoeligheid en hoge doorvoer te bieden. Deze methode werpt nieuw licht op het begrijpen van aminozuur overproductie sterke punten en de vertaling van zeldzame codons en kan, theoretisch, worden toegepast op alle micro-organismen.

Dit protocol is meestal gebaseerd op elementaire moleculaire experimentele operaties die gemakkelijk te volgen zijn, maar die meerdere proeven vereisen om de juiste selectie van overspannen stringencies te bereiken. Een visuele demonstratie van deze techniek biedt een directe waardering voor de prestaties van de selectie en een screeningsysteem bij het identificeren van aminozuurproducenten. Om deze procedure te beginnen, voeg de vector in de marker fragmenten, op ijs, in een kies verhouding van een tot zeven punt vijf microliters van de assemblage mix aan een totaal volume van tien microliters.

Broed een uur lang op 50 graden Celsius. Transformeer vijf microliter van het assemblageproduct in 50 microliter van componentcellen bij 42 graden Celsius gedurende 30 seconden. Herstel de cellen in Super Optimale bouillon met Kataboliet onderdrukking medium op 37 graden Celsius gedurende een uur.

Dan, plaat ze op LB Agar medium en incubeer 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende dag, gebruik maken van een voorkeur commerciële kit om de plasmid te isoleren. Ten eerste, transformeer 50 microliter van de bevoegde cellen met een microliter plasmide die het wild-type KanR draagt.

Transformeer een tweede set van de bevoegde cellen met de plasmide met KanR RC 29 met alle leucine codons vervangen door de zeldzame codon CTA. Plaat en incubeer de celcultuur zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng vervolgens de kolonies over die het wild-type selectiemarkeringsgen in het zeldzaam-codon-rijke derivaat individueel in vijf milliliter van vijfvoudig verdund LB-medium met kanamycine met een concentratie van 50 microgram per milliliter bevatten.

Incubeer de monsters in een shaker bij 37 graden Celsius tijdens het schudden bij 250 rpm. Breng vervolgens 200 microliter van elk van de celculturen over in een 96-putplaat in drievoud op bepaalde tijdstippen. Gebruik een plaatlezer om de OD600 te meten.

Inenting van de vlekken herbergen de KanR RC 29 marker gen in twee sets van vijf milliliter van de 0,2 x LB medium dat kanamycine bevat, met of zonder een levering van L-leucine. Voeg L-leucine toe aan een van de media tot een uiteindelijke concentratie van één gram per liter. Broed de monsters in een shaker bij 37 graden Celsius met schudden bij 250 rpm en meet de OD600 voor elke cultuur op bepaalde tijdstippen.

Om te beginnen, transformeren 50 microliters van de ouder stam gebruikt voor mutagenese met een microliter van plasmide dat de wilde-type GFP of de wild-type PPG draagt. Plaat en uitbroeden de celculturen zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng de kolonies vervolgens individueel over naar vijf milliliter van het goed verdunde LB-medium.

Incubeer de monsters in een shaker bij 37 graden Celsius met schudden bij 250 rpm. Voor fluorescentiemarkers, breng 200 microliters van de celculturen in een 96 goed duidelijke bodemrugplaat in drievoud op bepaalde tijdspunten over. Meet de OD600 in de fluorescentie en bereken de fluorescentieintensiteit.

Voor chromogene markers, meet de kleurontwikkeling van de celculturen. Voer de voertest uit zoals eerder beschreven en meet de fluorescentieintensiteit of de kleurontwikkeling op bepaalde tijdstippen. Transformeer eerst 50 microliter van de gemuteerde cellen met één microliter van de plasmide die de selectiemarker KanR RC 29 draagt, of de screeningmarkers GFP RC of PPG RC. Vervolgens centrifugeren de celculturen op 4000 keer G gedurende vijf minuten.

Gooi voor de selectie de supernatant weg en voeg vijf milliliter 0,2 x LB-medium toe met kanamycine aan cellen die de selectiemarkering dragen. Incubeer het monster 's nachts in een shaker op 37 graden Celsius. De volgende dag, plaat de nachtelijke cultuur op 0,2 x LB agar medium met kanamycine en incubbate op 37 graden Celsius voor 12 uur.

Voor de screening, plaat het juiste aantal cellen die de screening marker op LB agar medium met het juiste antibioticum. Broed acht uur lang op 37 graden Celsius. Daarna inentuleer het LB-medium met het juiste antibioticum bij elke kolonie van de plaat.

Incubeer de monsters in een shaker bij 37 graden Celsius tijdens het schudden bij 250 rpm. Meet de OD600 en de fluorescentie en bereken de fluorescentieintensiteit als GFP RC wordt gebruikt. Meet de kleurontwikkeling van de celculturen als PPG RC wordt gebruikt.

Om de aminozuurproductiviteiten van de kandidaatstammen te verifiëren, bereidt u zaadkweek voor door vijf milliliter LB-medium te inenten met elk van de kandidaatstammen en laat u de cellen 's nachts groeien in een shaker bij 250 tpm en bij 37 graden Celsius. De volgende dag, oogst de cellen van een milliliter van de celcultuur door te centrifugeren op 4000 keer G gedurende twee minuten. Gooi het supernatant weg en verleg het palet met een milliliter steriel water.

Inenting 20 milliliter M9 medium met vier procent glucose met 200 microliter van de cel suspensie en incubbate in een 250 milliliter shaker bij 250 rpm en bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De volgende dag, centrifuge een milliliter van het cultuurmedium op 4000 keer G gedurende vijf minuten. Breng 200 microliter van de supernatant over in een schone buis van 1,5 milliliter.

Bereid L-leucine standaardoplossingen voor op de hier getoonde concentraties. Voeg in een rookkap 100 microliter van één millimolar triethylamine en 100 microliter van één molaire fenylfenothiocyanaat toe aan zowel de supernatant als de normen. Meng de oplossingen voorzichtig en broed ze een uur lang op kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 400 microliters n-hexaan toe aan dezelfde buis en draaikolk gedurende tien seconden. De onderste fase bevat de aminozuurderivaten en wordt gebruikt voor HPLC-analyse. Filtreer de onderste fase door 0,2 microliter polytetrafluorethyleenmembranen.

Voer hierna een microliter van het monster uit op een ultra HPLC die is uitgerust met een C18-kolom met een stroomsnelheid van 0,42 milliliter per minuut en bij kolomtemperatuur van 40 graden Celsius. Gebruik een diode array detector om de beoogde aminozuren te detecteren op 254 nanometer en hun concentraties te berekenen door het in kaart brengen van de piekgebieden onder de standaardcurve. In deze studie worden aminozuuroverproducenten geïdentificeerd met behulp van zeldzame codon-rijke markers om tegelijkertijd nauwkeurigheid, gevoeligheid en hoge doorvoer te bereiken.

Voor het selectiesysteem moet een scherpe afname van OD600 worden waargenomen voor stammen die het zeldzame codon-rijke antibioticaresistentiegen herbergen, in vergelijking met de stam die het wilde type herbergt. De remming van zeldzame codon op eiwituitdrukkingen vindt meestal plaats onder uitgehongerde omstandigheden. Na extra voeding van het overeenkomstige aminozuur neemt de OD600 voor de stam die het zeldzame codonrijke antibioticaresistentiegen herbergt aanzienlijk toe.

Voor het screeningssysteem is de fluorescentieintensiteit in het aantal fluorescerende cellen aanzienlijk lager voor de stam die het fluorescerende eiwit uit het zeldzame codon-rijke gen uitdrukt dan van het wild-achtige gen. Het voeden van het overeenkomstige aminozuur zal eiwituitdrukkingen van de zeldzame codon-rijke genen herstellen. Bij het gebruik van het paarse eiwit, de kleur ontwikkeld uit de zeldzame codon-rijke PPG is lichter dan die van het wild-type gen.

Het onverdunde LB-medium maakt langzame expressie van de zeldzame codon-rijke PPG mogelijk zonder L-leucine voeding in het uitgedrukte paarse eiwit wordt zichtbaar zodra de cellen worden gepeld. Dit verhult echter niet het feit dat genexpressie van de zeldzame codon-rijke PPG wordt versterkt door het voeden van de L-leucine. De zeldzame codon-gebaseerde strategie kan overproduceren van de beoogde aminozuren uit de mutatiebibliotheek identificeren en deze mutanten zouden hogere hoeveelheden van de beoogde aminozuren moeten produceren dan de ouderstammen.

Bij een poging tot deze procedure is het belangrijk om zeldzame codonfrequentie aan te passen om een duidelijke discriminatie in de OD of kleur te bereiken tussen cellen die de wild-type markers en de zeldzame codon-rijke derivaten herbergen. Transcriptome analyse en de genoom sequencing kan worden toegepast op de geselecteerde stammen om het mechanisme in verband met aminozuur producties te onderzoeken. Met behulp van deze techniek kunnen aminozuuroverproducers efficiënt worden geïdentificeerd en zou de analyse van hun genetische informatie nieuwe inzichten bieden in hun mechanismen achter overproducties van aminozuur.

Aminozuurafleiding kan schadelijk zijn. Zorg ervoor dat u handschoenen en de beschermende kleding te dragen en deze stappen uit te voeren in een rookkap.