Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

In dit protocol kunnen we de interacties tussen eiwitten en DNA identificeren, waardoor de transcriptieregulatie van het gen wordt onthuld. Dit helpt om de moleculaire mechanismen in de cellen te begrijpen. We wijzigen de reeds bestaande protocollen en stellen vervolgens een eenvoudige en duidelijkere testprotocollen op.

Je volgt gewoon het protocol vanaf de eerste stap, zodat de test met succes kan worden gedaan. Ter voorbereiding van crosslinked chromatine, in een rookkap, voeg vier milliliter van 1%VCaP cel cultuur media en 0.229 milliliter van 18,5%PFA aan een schotel van zes centimeter. Draai de schotel voorzichtig om de PFA gelijkmatig te verdelen.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten. Voeg vervolgens 0,47 milliliter glycine-oplossing van 1,25 molar aan de schotel toe en broed vijf minuten lang bij kamertemperatuur om verdere crosslinking te stoppen. Na het wassen van de cellen volgens het manuscript, schraap de cellen en breng de cel suspensie naar een 1,5-milliliter microcentrifuge buis.

Centrifugeren de buis met de cel suspensie op 3,000 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cel pellet te herstellen. Gebruik een pipet om de PBS volledig te verwijderen. Nota van het celnummer per buis, en bewaar de celpellet bij min 80 graden Celsius.

Om cellyse uit te voeren, ontdooi eerst de opgeslagen VCaP-celpellets op ijs. Voeg 300 microliters van de voorbereide ChIP-cellysebuffer toe, aangevuld met PIC aan elke buis, en resuspend de pellet grondig. Vortex de buis voor 15 seconden, en incubeer de suspensie op ijs voor 10 minuten.

Centrifuge op 9.000 keer g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Verwijder de supernatant volledig, en voeg 300 microliter van van MNase spijsvertering buffer om de pellet resuspend. Verdun MNase met MNase spijsverteringsbuffer in een buis van 1,5 milliliter om 50 geleenheden per microliter op te leveren.

Voeg de verdunde MNase toe aan de suspensie en broed op 37 graden Celsius gedurende precies 10 minuten. Stel het mengen in door inversie om de 2 1/2 minuten. Om de MNase-spijsvertering te beëindigen, voeg 30 microliter van 0,5-molaire EDTA toe bij pH acht en vortex kort.

Na incubatie gedurende vijf minuten op ijs, centrifuge op 9,000 keer g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Verwijder de supernatant volledig, en resuspend de pellet in 300 microliters van de voorbereide ChIP verdunning buffer aangevuld met PIC. Dan, op een sonicator uitgerust met een microtip sonde, stel de sonicatie voorwaarden om amplitude twee, verwerkte tijd 15 seconden, puls op vijf seconden, en puls UIT 30 seconden.

Sonicate de suspensie op ijs. Teken een microliter van de suspensie en spot op een schuifglas. Let onder een microscoop op dat de celstructuur bijna gebroken is.

Centrifugeer de buis op 9,000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, en breng de supernatant naar een nieuwe 1,5-milliliter microcentrifuge buis. Bespaar 20 microliter van de verteerde chromatine in een schroefbuis van 1,5 milliliter voor verdere behandeling en bewaar de rest bij min 80 graden Celsius. Voeg eerst in elke schroefbuis van 1,5 milliliter 75 microliter water toe, vier microliters van natriumchloride van vijf kies, en één microliter proteinase K.To crosslinking tussen eiwit en DNA te verwijderen, voeg 20 microliter verteerd chromatine toe uit elke MNase spijsverteringstoestand aan een schroefbuis.

Sluit de dop goed, meng volledig, en broed de buis op 65 graden Celsius 's nachts. In de ochtend, na het centrifugeren van de buis op twee tot 3, 000 keer g gedurende een paar seconden, voeg 100 microliters van PCI. Vortex krachtig om een emulsie te vormen.

Centrifugeren de buis opnieuw op maximale snelheid gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens twee 1,5 milliliter microcentrifugebuizen per aandoening voor. Voeg 100 microliter PCI toe aan één buis.

Voeg 10 microliter natriumacetaat van drie molaire molaire bij pH 5.2 en twee microliter glycogeen toe aan een andere buis. Uit de buis uit de centrifuge, trek zorgvuldig de bovenste fase met DNA, en voeg het toe aan de buis met PCI. Vortex krachtig, en centrifugeren de buis op maximale snelheid gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur.

Breng vervolgens de bovenste fase over op de buis met natriumacetaat en glycogeen dat eerder is bereid. Voeg 250 microliter ethanol toe en meng door inversie. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Centrifuge de buis op maximale snelheid gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Bevestig de pellets op de bodem van de buis. Verwijder voorzichtig de supernatant om de pellet niet te verstoren en voeg 500 microliter van 70% ethanol toe.

Centrifuge de buis op maximale snelheid gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Verwijder de supernatant volledig, en droog de pellet gedurende ongeveer vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 20 microliter TE toe om de pellet op te lossen.

Meet de DNA-concentratie met behulp van een UV-spectrofotometer. Na bereiding van verteerde chromatine ontdooien alle monsters op ijs. Voeg 1200 microliters van de bereide ChIP verdunningsbuffer toe, aangevuld met PIC om verteerde chromatine te verdunnen aan de concentratie van vijf microgram per 500 microliter.

Voeg als inputmonster vijf microliter van de verdunde verteerde chromatine toe aan een schroefbuis van 1,5 milliliter. Bewaar het monster op min 80 graden Celsius. Voeg 500 microliter elk van de verdunde verteerde chromatine toe aan een schroefbuis van 1,5 milliliter als immunoprecipitatiemonster.

Voeg twee microgram antilichaam aan elke buis, en sluit de dop. Incubeer de buizen op vier graden Celsius 's nachts met zachtjes mengen op een schommelplatform. Voeg 's ochtends 30 microliter chip-grade eiwit G magnetische kralen toe aan elke buis.

Incubeer de buizen weer op vier graden Celsius gedurende twee uur met zachte menging. Draai daarna kort naar beneden op twee tot 3.000 g en plaats de buis in een polyethyleenrek met neodymiummagneten gedurende een minuut. Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant door aspiratie.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter zoutwuncomplexwolie aan elke buis toe. Kort vortex de buis om de kralen te verspreiden. Broed de buis vijf minuten lang op vier graden Celsius met zachte menging op een schommelplatform.

Herhaal de was met hoogzout immuuncomplex en lithiumchloride immuuncomplex volgens het manuscript. Na het volledig verwijderen van de resterende supernatant, voeg 150 microliter elutie buffer aan de buis. Vortex de buis om de kralen volledig te verspreiden.

Sluit de dop en broed de buis 30 minuten lang uit op 65 graden Celsius. Om de kralen grondig te verspreiden, meng je elke vijf minuten door inversie. Bereid tijdens de incubatie een schroefbuis van 1,5 milliliter en voeg zes microliter natriumchloride van vijf mol en twee microliter proteinase K.Thaw het 1%-invoermonster toe dat eerder op ijs was bereid.

Voeg 150 microliter elutiebuffer, zes microliter natriumchloride van vijf mol en twee microliter proteinase K toe aan het inputmonster. Na de incubatie van de buis met kralen, spin naar beneden. Plaats de buis in een magnetisch rek voor een minuut, en breng de supernatant naar de schroefbuis met natriumchloride en proteinase K.Representatieve microfotografen van crosslinked cel pellets voor en na sonicatie vertonen duidelijke verschillen.

Zonder sonicatie blijft de celstructuur intact, wat aangeeft dat de chromatine aanwezig is in de kernen. Een korte sonicatie breekt de celstructuur. Crosslinked chromatine werd bereid uit VCaP cellen en verteerd met verschillende hoeveelheden MNase.

Zonder MNase toe te voegen, verscheen een uitstrijkpatroon met een zeer hoog moleculair gewicht. De toevoeging van MNase gaf een ladderpatroon, waaruit blijkt dat MNase internucleos verteert. Alleen de voorwaarde dat chromatinefragmenten tot 900 bp produceerden, kan worden beschouwd als een goede spijsvertering, terwijl een ongepast spijsverteringspatroon overdigestie laat zien, voornamelijk resulteerde in mononucleosoomproductie.

Spijsverteringspatroon van chromatine in VCaP-cellen duidt op een goede vertering van chromatine. De hoogste bezetting van H3K4methyl3 werd waargenomen rond 0,5 kilobasis en een kilobasis stroomopwaarts van de AR-TSS. Regio's gelegen op 19 kilobasis en acht kb stroomopwaarts en 12 kilobasis stroomafwaarts van AR-TSS, echter, had weinig bezetting van H3K4methyl3, wat aangeeft dat deze kunnen worden gebruikt als negatieve regio's.

Het bepalen van de MNase spijsverteringstoestand is het belangrijkst. Houd celnummer, buffervolume en enzymhoeveelheid in elk experiment. De voorwaarde moet voor elk celtype worden geïdentificeerd.

We kunnen ChIP-sequencing uitvoeren voor wereldwijde bezetting van de factoren en chromatineconformatie vangt om de interacties tussen distale genomische laesies te bepalen. Deze methode kan procesmechanismen van de transcriptie onthullen. ChIP-test is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van transcriptieregulatie, maar het is omslachtig en niet reproduceerbaar.

Onze methode moedigt onderzoekers aan om de test routinematig en gemakkelijk uit te voeren.