Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

Super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie, 3D-SIM, is een innovatieve techniek voor de visualisatie van fluorescerende reporter eiwitten van kiemreceptor clusters in sporenmembranen. Met behulp van deze procedures kan een onovertroffen oplossing van germinosome lokalisatie en sporen binnenmembraan lipide domeinen worden bereikt. De techniek wordt gedemonstreerd door promovendus Juan Wen en Master of Science student Raymond Pasman van ons laboratorium.

Voordat u met de procedure begint, moet u hoge precisie coverslips met één-molaire zoutzuur gedurende 30 minuten reinigen in een zacht schuddend waterbad, gevolgd door twee, vijf minuten wasbeurten in ultrazuiver type 1-water. Na de tweede wasbeurt, plaats de coverslips in 100% ethanol gedurende ongeveer drie minuten voor het drogen van de coverslips en het verifiëren van hun helderheid. Vervolgens, schoon glas microscoop dia's met 70% ethanol voor een minuut voordat de dia's te drogen en het verifiëren van hun helderheid.

Voor fluorescerende microsfeer en sporenbeeldvorming, eerst pre-warm twee dia's op een 70-graden Celsius verwarming blok voor een paar seconden voor het toevoegen van een 70-graden Celsius, 65-microliter druppel van gesteriliseerde 2%agarose op een van de dia's. Plaats de andere dia op de top om de agarose tussen de dia's te verspreiden. Verwijder na vijf minuten een van de glijbanen en snijd de gedroogde agarose in een sectie van één voor één centimeter.

Voeg een keer 10 toe aan de achtste fluorescerende microsferen of sporen in 0,4 microliter steriel, ultrazuiver type 1-water aan de agarose en plaats een hoge precisie coverslip op de patch met behulp van de coverslip om de patch van de dia op het coverslipoppervlak te schuiven. Bevestig vervolgens een 65-microliter, 1,5 bij 1,6 centimeter Gen Frame op een gedroogde dia, en plaats de coverslip op het frame, het sluiten van alle hoeken van het frame. Voor beeldvorming van de monsters, plaats de dia op een gestructureerde verlichting microscoop uitgerust met een 100X olie doelstelling, en focus op de 100-nanometer fluorescerende microsferen.

Pas de correctiering op de 100x-doelstelling aan totdat een symmetrische puntspreadfunctie is verkregen om vervaging van de beelden te minimaliseren en selecteer een gezichtsveld met ongeveer 10 ronde fluorescerende microsferen. Breng een roosterfocusaanpassing toe voor de aangewezen excitatiegolflengten, in dit geval 561 en 488 nanometer, als een leidraad voor de beeldanalysesoftware voordat u zich richt op de sporen met het transmissielicht. Leg een transmissielichtbeeld vast in de 16x gemiddelde modus met belichtingen van 20 milliseconden voor elke afbeelding.

Leg vervolgens 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscoop ruwe fluorescerende beelden van de sporen vast met de 3D-SIM-verlichtingsmodus. Klik voor segmentreconstructie op Param op het tabblad gestructureerde verlichtingsblok om het venster N-SIM-segmentreconstructie te openen. Volg de voorgestelde instructies en klik op de juiste besturingselementen om het contrast van de verlichtingsmodulatie in te stellen op automatisch, de ruisonderdrukking met hoge resolutie op één en de onscherpteonderdrukking van de focus op 0,05 als uitgangspunten.

Klik vervolgens op Slice reconstrueren om de afbeelding te reconstrueren en de kwaliteit van de gereconstrueerde afbeeldingen te evalueren aan de hand van de snelle door Fourier getransformeerde afbeeldingen en reconstructiescore die na de reconstructie worden weergegeven. Pas de ruis met hoge resolutie aan van 0,1 naar 5 en de onscherpteonderdrukking van 0,01 naar 0,5 totdat de beste parameterinstellingen zijn verkregen. Klik vervolgens op Toepassen om de wijzigingen toe te passen.

Klik op Sluiten om het venster te sluiten. Open een FM4-64 bevlekte PS4150 sporen ruwe beeld. Klik vervolgens op Slice reconstrueren om de segmentreconstructie uit te voeren en sla de gereconstrueerde afbeelding op.

Om de 3D-SIM raw afbeeldingen van de KGB80 geminosome om te zetten in pseudo-widefield afbeeldingen, klik links op de ImageJ SIMcheck plugin en selecteer Raw Data SI en Pseudo Widefield. Selecteer willekeurig ongeveer 25 sporen in elk omgekeerd transmissiebeeld voor een latere kiemachtige analyse in de fluorescerende pseudo-widefield beelden tot ongeveer 350 sporen zijn geselecteerd. Gebruik vervolgens ImageJ om de maximale intensiteit te beoordelen voor elk fluorescerend signaal uitgedrukt door elke groep sporen en de geïntegreerde intensiteit van elk 3D-sporenbeeld.

Om de pseudo-widefield beelden van de KGB80 germinosome te analyseren, gebruik de gemiddelde geïntegreerde intensiteitswaarde van zeven stapels als de geïntegreerde signaalintensiteit van de KGB80 spore. Bepaal vervolgens de achtergrondintensiteiten door de PS4150-achtergrondstam te imagingen met behulp van identieke instellingen en beschouw de fluorescerende vlekken in individuele KGB80-sporen als germinosome foci wanneer ze duidelijk van de achtergrond te onderscheiden zijn. In dit representatieve experiment verschenen twee foci van de GerD-GFP fluorescerende sporen in verschillende stapels met drie totale GerD-GFP foci waargenomen in de compositive Z3 stack.

Hier werd een spore waargenomen met slechts één GerD-GFP brandpunt in de spore. In totaal had ongeveer 40 tot 50% van de sporen respectievelijk twee of één GerD-GFP en GerKB-mCherry-cluster. Terwijl de geïntegreerde intensiteit van het GerD-GFP steigereiwit tussen verschillende populaties verschilde, was de geïntegreerde intensiteit van GerKB-mCherry ongeveer hetzelfde in verschillende populaties.

Toen de sporen meerdere foci hadden, was de maximale fluorescentieintensiteit van GerD-GFP en GerKB-mCherry foci de neiging om te verminderen, en de maximale fluorescentie van alle lichtpuntjes, beschouwd als de germinosome foci, was hoger dan de maximale autofluorescentie van de PS4150 sporen. Met name helderder FM4-64 vlekken vergelijkbaar met germinosome foci verschijnen in zowel intacte als gedecoated PS4150 sporen, wat suggereert dat deze helderdere FM4-64 vlekken betrokken kunnen zijn bij de clustering van germinosome eiwitten in het binnenste membraan. Het toevoegen van sporen aan de agarose en het plaatsen van agarose in het frame vereist een continue en zorgvuldige vloeiende beweging voor deze mini's materialen.

De omzetting van 3D-SIM ruwe beelden van de KGB80 germinosome in pseudo-widefield beelden en hun interpretatie vereist deskundige kennis over sporenbiologie. Onze gestructureerde verlichting microscopie procedure kan worden toegepast op de beeldvorming van lage overvloedige eiwitten of dim fluorescentie verslaggevers in verschillende bacteriën of andere band materialen. De organisatie van het germinosome kan nu worden bestudeerd met behulp van dubbele etikettering procedures om co-lokalisatie van Bacillus kiemeiwitten en specifieke membraandomeinen te beoordelen.