Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

Dit protocol presenteert ion-uitwisseling MALs, een nieuwe methode voor eiwit kwaliteitscontrole en karakterisering, kwaliteitscontrole die essentieel is voor consistentie en integriteit van de resultaten in life science onderzoek en farmaceutische productontwikkeling. Mals van ionenuitwisseling bepaalt de eiwitzuiverheid, oligomerische toestand, homogeniteit, identiteit, conformatie, structuur, wijzigingen na de vertaling en andere eigenschappen. Metingen zijn niet-destructief en worden in oplossing gemaakt onder bijna fysiologische bufferomstandigheden.

Deze methode bepaalt nauwkeurig de molaire massa van eiwitten of peptiden, de oligomerische toestand en de mate van vervoeging, bijvoorbeeld glycoproteïnen. Het kan ook worden toegepast op membraaneiwitten. IEX scheidt macromoleculen door hun oppervlaktelading.

Anion exchange, AIEX, en kation exchange, CIEX, matrixen binden respectievelijk negatief en positief geladen varianten. Met een fijne scheiding tussen eiwitpopulaties die een relatief nauwe massa of vorm delen, bepaalt IEX-MALS met succes de molaire massa van elke individuele eiwittoestand in een mengselmonster. Gebruik om te beginnen een filter van 0,1 micrometer om alle reagentia te filteren, inclusief de was- en elutiebuffers.

Filtreer de eerste buffer van 50 tot 100 milliliter in een afvalfles om deeltjes uit de droge filters te verwijderen. In een schone, steriele fles die grondig is gewassen met gefilterd water en afgetopt om te voorkomen dat stof binnenkomt, filtert u de rest van de buffer. Verdun met pH-acht Tris-buffer en 50-millimolar natriumchloride een BSA-monster tot zes milligram per milliliter, zodat de pH en ionische sterkte zich aan de ionenwisselkolom kunnen binden.

Gebruik een spuit om ten minste 0,3 tot 0,5 milligram BSA te injecteren in een kolom van één milliliter voor het bereiken van een MALS-analyse van goede kwaliteit. Als u een MALS-experiment met ionuitwisseling wilt starten, opent u Nieuw, Experiment van Methode in de MALS-software en selecteert u de onlinemethode in de map Met de methoden van het Light Scattering-systeem. Als de DLS-module beschikbaar is en DLS-gegevens moeten worden aangeschaft, selecteert u de onlinemethode in de submap Light Scattering, Met QELS.

Als u de parameters wilt instellen, stelt u onder de sectie Configuratie eerst de stroomsnelheid van de run in de sectie Generieke pomp in op de stroomsnelheid die in de FPLC wordt gebruikt als 1,5 milliliter per minuut. Voer onder de sectie Oplosmiddel de bufferparameters in of verifieer deze. Voer onder de sectie Injector de eiwitnaam BSA in, refractieve indextoename als 0,185 milliliter per gram en de UV-extinctiecoëfficiënt op de golflengte van 280 nanometer als 0,66 liter per gram per centimeter.

Voer in het tabblad Monster de concentratie van het eiwitmonster in als zes milligram per milliliter en voeg het monstervolume voor injectie ook in als 170 microliter. Schakel onder de sectie Procedures op het tabblad Basisverzameling het selectievakje Trigger op Automatisch injecteren in en stel de duur van de run in op 70 milliliter, zodat het verzamelen van gegevens ten minste vijf minuten wordt voortgezet nadat het verloop de uiteindelijke waarde heeft bereikt. Maak vervolgens in de FPLC-software een nieuw experiment op het tabblad Methodeeditor.

Maak voor het eerste experiment een lineair verloop van zout of pH, terwijl voor de geoptimaliseerde methode een specifiekere verloop of een stapsgewijs programma wordt gemaakt volgens het manuscript. Neem een pulssignaal op in de methode die het verzamelen van gegevens in de MALS-software activeert. Open vervolgens de pompklep en was met 0,5-molaire natriumhydroxide om sterk gebonden onzuiverheden te verwijderen, gevolgd door een neutralisatiebufferwassing.

Was vervolgens de kolom met Tris buffer pH acht, de A-klep met wasbuffer en de B-klep met elutionbuffer. Gebruik de wasbuffer met de lage zoutconcentratie als laatste wasbeurt om de kolom te spoelen, zodat het eiwit aan de kolommatrix kan worden verbonden. Vóór de monsterinjectie, na de wasbeurt en aan het einde van de elutie moet de lichtverstrooiingsbasislijn worden gestabiliseerd om een laag geluidsniveau en volledig zuivere verdunning te garanderen.

Met behulp van een spuit, plaats het eiwit monster in de lus. Start het experiment eerst in de MALS-software door op de knop Uitvoeren en vervolgens in de FPLC-software te klikken. Gegevens worden verzameld na ontvangst van het pulssignaal van het FPLC-instrument via de MALS-detector.

Als de MALS voor ionuitwisselingen handmatig wordt uitgevoerd met een continue stroommodus in plaats van een zelfstandige methode, passen dezelfde parameters van de run en instructies toe als eerder beschreven. Zodra de uiteindelijke methode is geverifieerd en uitgevoerd, voert u precies dezelfde methode uit met behulp van een lege injectie door buffer te laden in plaats van het monster. Het is belangrijk dat de timing tussen de automatisch injecterende puls en het verloop van de lege run identiek is aan die van de samplerun.

Gebruik onder de sectie Procedures in de MALS-software het tabblad Despiking en het normale niveau om de chromatogrammen glad te strijken om de analyse te starten. Als ze veel lawaai vertonen, stel het niveau op Zwaar. Definieer in de weergave Basislijn de basislijn voor alle signalen, inclusief LS-, UV- en RI-detectoren.

Definieer in de weergave Pieken de pieken voor analyse. Controleer de juiste waarden van de RI-verhogingswaarde dn/dc en UV-extinctiecoëfficiënt voor het eiwit onder elke piek. Analyseer onder de Molaire Massa en Radius van Light Scattering view de molaire massa en de straal met behulp van het Zimm-model en de pasvormgraad van nul.

Als QELS beschikbaar is, in de rh van QUELS-weergave, observeren Rh waarden en de kwaliteit van de pasvorm van de correlatie functie. Het RI-signaal verandert aanzienlijk tijdens de ionenwissel MALS-run als gevolg van de toename van de zoutconcentratie. Om het basislijnsignaal af te trekken van de blanco injectie, opent u zowel de eiwit- als de blanco ionenuitwisseling MALS-experimenten.

Klik met de rechtermuisknop op de naam van het eiwitexperiment, selecteer Methode toepassen en kies de map Subtractie basislijn in het bestandsdialoogvenster. Selecteer de online methode voor standaard molaire massaanalyse. Klik onder de weergave Subtractie basislijn op Leeg importeren om de signalen van de lege run te importeren.

Controleer onder Instrumenten alle detectoren om af te trekken. Om het MALS-systeem voor ionenuitwisseling te kalibreren met BSA-monomeer, onder Procedures en Configuratieweergave, lijnt u de pieken uit. Voer onder de weergave Normalisatie 3,0 nanometer in als de Rg-waarde om normalisatie uit te voeren.

Kies vervolgens onder Band Verbreding in hetzelfde tabblad Configuratie de piek en gebruik de Perform Fit-knop om de UV- en LS-signalen aan te passen aan het RI-signaal. De grafiek van de resultaten wordt weergegeven in de weergave Resultatenmontage. Wijzig de asschalen en andere grafiekparameters door met de rechtermuisknop op de grafiek te klikken, Bewerken te selecteren en vervolgens op de knop Geavanceerd te klikken.

Als u meer weergaveopties wilt hebben, selecteert u het tabblad EASI-grafiek en selecteert u boven aan het venster in het vervolgkeuzemenu Weergave Molaire massa of Rh Q.All, inclusief molaire massa, straal, zuiverheidsniveau en andere resultaten zijn beschikbaar in de rapportweergave onder de sectie Resultaten. Gebruik de knop Rapportontwerper om meer resultaten of parameters en cijfers aan het rapport toe te voegen. In dit experiment werd BSA geanalyseerd op ion-exchange MALS met behulp van een anion uitwisseling analytische kolom.

De chromatogrammen vertoonden de UV op 280 nanometer, lichtverstrooiing onder een hoek van 90 graden, de brekingsindex en de geleidbaarheidscurven samen met de molaire massa van elke piek. Een brede lineaire gradiënt bestaande uit 30 kolomvolumes van 75 millimolar tot 350 millimolar natriumchloride scheidde BSA monomeren van dimers en hogere oligomeren. Downstream MALS-analyse resulteerde in een berekende monomeer molaire massa van 66,8 kilodaltonen en een berekende dimerkiester massa van 130 kilodaltons.

Op basis van de buffergeleiding op de elu-toeren werd het verloop veranderd in een ander programma, een lange stap van 175 millimolar natriumchloride, gevolgd door een lineair verloop van 175 millimolar tot 500 millimolar natriumchloride. De nieuwe gradiënt sterk verbeterd de resolutie en produceerde een uitstekende scheiding tussen BSA monomeer en hogere oligomeric soorten. Een stapsgewijs programma van 200 millimolar en 250 millimolar natriumchloride werd toegepast om zich ook op de hoge oligomeric soorten te concentreren.

Het resulteerde in een uitstekende scheiding tussen BSA monomeer, dimer, en trimer. Na deze procedure kunnen methoden zoals massaspectrometrie, SDS-PAGE activiteit en stabiliteitstests worden uitgevoerd op elke variant gescheiden door ionenuitwisseling om elk variant te identificeren en verder te karakteriseren. We ontdekten dat ion-exchange MALS de kracht van MALS-analyse uitbreidt naar monsters die niet volledig kunnen worden geanalyseerd door SEC-MALS.

Scheiding per lading oplossen van verschillende soorten die coelute in SEC.