Lipidomics en Transcriptomics bij neurologische aandoeningen

Dit modulaire protocol maakt het mogelijk om meerdere moleculaire gebeurtenissen te onderzoeken die worden weergegeven door structurele en signalerende lipiden en / of RNA's, in discrete weefselgebieden en in bloed met een verbeterde kwantitatieve en kwalitatieve gegevensuitvoer per monstermonster. De methode is van toepassing op elk experimenteel model en kan ook worden toegepast op menselijke weefselmonsters en bloed. Claudia Schwitter, een technicus, Julia Post, een afgestudeerde student, en Raissa Lerner, een postdoc in mijn groep, demonstreren de procedure.

Neem om te beginnen eerder geïsoleerde, hele, bevroren hersenen van muizen met acute en profylactisch behandelde kaienzuur-geïnduceerde epilepsie. Monteer de hersenen op het montagesysteem van de cryostaat. Stel de dikte in op 50 micrometer en snijd de hersenen in trimmodus dicht bij het interessegebied.

Wanneer u het interessante gebied nadert, stelt u de dikte in op 18 tot 20 micrometer. Om de subregio van belang te lokaliseren, kleurt u hersenplakken met behulp van toluidineblauw. Gebruik een microscoop om de gekleurde plakjes te inspecteren om de interessegebieden te identificeren die moeten worden geponst en gebruik een muizenatlas als referentie om de juiste anatomische hersengebieden te vinden.

Gebruik monstercorers om ponsen met een diameter van 0,8 tot 1,0 millimeter te nemen. Breng de ponsen voor co-extracties van endocannabinoïden en eicosanoïden over in voorgekoelde amberkleurige buizen van 2 milliliter met zeven voorgekoelde stalen kogels per buis. Voor fosfolipiden en endocannabinoïden co-extractie, dubbele lipide en RNA co-extractie, breng de ponsen over in 2 milliliter RNase-vrije extractiebuizen met keramische kralen.

Weeg bevroren stoten in de koelcel en ga onmiddellijk verder met afzuiging of bevries bij 80 graden Celsius. Om vloeistof-vloeistof lipide co-extractie van endocannabinoïden en eicosanoïden uit hersenstukken, ponsen of weefselpoedermonsters uit te voeren, plaatst u de extractiebuizen met de weefselmonsters en zeven stalen ballen op ijs. Voeg 600 microliter ijskoude MTBE en 50 microliter acetonitrilwater toe met daarin de interne normen.

Gebruik na het toevoegen van 400 microliter 0,1 molair mierenzuur een weefsellyser om gedurende 30 seconden tot 1 minuut te homogeniseren. Centrifugeer dit homogenaat gedurende 15 minuten bij 5.000 maal g bij 4 graden Celsius. Plaats het gedurende 10 minuten in de vriezer bij 80 graden Celsius om de waterige onderste fase te bevriezen, wat de overdracht van de bovenste organische fase zal vergemakkelijken.

Breng de bovenste organische fase over in nieuwe amberkleurige buizen van 1,5 milliliter, verdamp onder een zachte stroom stikstof bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten en reconstitueer vervolgens in 50 microliter acetonitrilwater voor verdere analyse. Bewaar de waterige fase bij 20 of 80 graden Celsius voor verdere analyse van het eiwitgehalte. Om endocannabinoïden en eicosanoïden uit plasmamonsters te co-extraheren, plaatst u de bevroren plasmamonsters op ijs en laat u ze volledig ontdooien.

Voeg 800 microliter MTBE en 50 microliter acetonitrilwater toe met daarin de interne normen die zijn geoptimaliseerd voor spiking met behulp van referentieplasmamonsters. Voeg 600 microliter mierenzuur van 0,1 molair mierenzuur en vortex bij 4 graden Celsius gedurende 2 minuten toe. Centrifugeer de monsters op 4.000 keer g gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius.

Breng de organische fase over in nieuwe buizen. Verdamp het onder een zachte stroom stikstof bij 37 graden Celsius en reconstitueer het vervolgens met 50 microliter acetonitrilwater voor vloeistofchromatografie meervoudige reactiemonitoringanalyse. Om co-extractie van fosfolipiden en endocannabinoïden uit hersengebieden, ponsen of andere weefselpoedermonsters uit te voeren, plaatst u de extractiebuizen met de weefselmonsters en keramische kralen op ijs.

Voeg 800 microliter methyltert-butylether en methanolmengsel en 10 microliter methanol toe die de interne normen bevat. Voeg vervolgens 200 microliter mierenzuur van 0,1% toe met 25 micromolair tetrahydrolipstatine/URB597 en 50 microgram per milliliter BHT. Na homogenisatie met een weefselhomogenisator, centrifugeer op 5.000 keer g en 4 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Breng de bovenste organische fase over in nieuwe buizen, verdamp onder een zachte stroom stikstof bij 37 graden Celsius en reconstitueer dit lipide-extract vervolgens met 90 microliter methanol. Voeg bij onmiddellijke actie 10% water toe aan een hoeveelheid lipidenextract en injecteer 10 microliter in de LC/MS voor fosfolipideanalyse. Ga voor verdere analyse van endocannabinoïden verder met de volgende stap.

Neem een aliquot van het lipide-extract, verdamp tot droogheid en reconstitueer in acetonitrilwater. Om dubbele extractie van RNA en lipiden en co-extractie van fosfolipiden en endocannabinoïden uit weefselmonsters uit te voeren, ontdooi weefselpoeder aliquots of hersentrossen bij 4 graden Celsius. Voeg het weefsel toe aan extractiebuizen met keramische kralen.

Voeg vervolgens 600 microliter RLT-buffer toe samen met 200 microliter chloroform. Voor fosfolipide en co-extractie van endocannabinoïden, spike monsters met 10 microliter intern standaardmengsel en homogeniseren met hoge snelheid gedurende 20 seconden. Breng gehomogeniseerde monsters over in nieuwe centrifugebuizen en centrifugeer gedurende vijf minuten op volle snelheid en 4 graden Celsius om de fasescheiding mogelijk te maken.

Breng de bovenste fase over naar een verse buis voor RNA-extractie met behulp van een standaardkit. Elute extraheerde RNA in een totaal volume van 50 microliter RNase-vrij water en sloeg het op bij 80 graden Celsius. Voeg voor lipidenextractie 800 microliter MTBE/methanol en 200 microliter mierenzuur toe aan de onderste chloroformbevattende fase.

Vortex gedurende 45 minuten bij 4 graden Celsius. Breng de bovenste organische fase over naar een nieuwe buis. Verdamp het onder een zachte stroom stikstof bij 37 graden Celsius.

Voor verdere LC/MS-analyse reconstitueer je het monster in 90 microliter methanol en bewaar je het bij 20 of 80 graden Celsius, of ga je onmiddellijk verder met de analyse. Ga voor verdere analyse van endocannabinoïden verder met de volgende stap. Neem een aliquot van het lipide-extract, verdamp tot droogheid en reconstitueer in acetonitrilwater.

Injecteer vervolgens 20 microliter in de LC/MS voor endocannabinoïde analyse. Kaienzuurinductie van acute epileptische aanvallen leidde tot een maximale aanvalsintensiteit één uur na de injectie. Lipidomische profilering van endocannabinoïden en eicosanoïden, evenals fosfolipiden en endocannabinoïden, toont veranderingen in het lipidenniveau in de hersenschors, het striatum, het thalamische gebied, de hippocampus, de hypothalamus, het cerebellum en het hart- en longweefsel bij door kaïnzuur geïnduceerde epileptische muizen en controles.

Na dubbele extractie van fosfolipiden en endocannabinoïden en RNA voor kwantitatieve profilering van muizenhersenstoten, werd de kwantitatieve verdeling van lipiden in de hypothalamus, basolaterale amygdala en de ventrale en dorsale hippocampus geanalyseerd. Relatieve expressieniveaus van endogene enzymen en receptoren die betrokken zijn bij lipidesignalering, evenals markers voor hersenactiviteit onderzocht op mRNA-niveau in verschillende hersengebieden en subregio's van muizen die werden onderworpen aan kainic acid-geïnduceerde epileptische aanvallen en controles. Kainic acid-geïnduceerde epilepsie veroorzaakte massaal verlies van NeuN-signaal, voornamelijk in het CA1-, CA3- en hilusgebied van de hippocampus, vergezeld van apoptotische gebeurtenissen aangegeven door caspase-3-signaal in vergelijking met de controlezoutoplossing-geïnjecteerde muizen.

Na behandeling met subchronisch palmitoylethanolamide bleef het signaal van neuronale kerneneiwit merkbaar behouden en was het CASP3-signaal nauwelijks detecteerbaar. Hersenstoten en dissectie van discrete hersengebieden zijn behoorlijk uitdagend en vereisen fijne vaardigheden om consistente steekproeven in meerdere cohorten te verkrijgen. Daarom worden het oefenen op testorganen en een goede kennis van hersenmorfologie ten zeerste aanbevolen.