Name: Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Leer een in vitro model voor tauopathieën door lentivirale transductie van menselijke neuronen met mutant tau. Deze methode versnelt het onderzoek naar tau-toxiciteit en therapeutische interventies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen bedanken Dr. Peter Davies bij Albert Einstein College of Medicine voor het leveren van PHF-1 en CP13 antilichamen en Dr Marc Diamond aan de Universiteit van Texas, het zuidwesten, voor het verstrekken van de tau constructen. Dit werk werd gesteund door toelagen van de vereniging van Alzheimer (NIRG-14-322164) aan S.H.Y. en van het Instituut van Californië voor regeneratieve geneeskunde (TB1-01193) aan P.R.

1. bereiding van media en reagentia
<ol><li>Ontdooi de kelder membraan matrix coating voor cultuur platen op 4 ° c (niet toestaan dat de kelder membraan matrix op te warmen of het zal stollen). Maak 1 mL hoeveelheid en bewaar ze bij-20 °C of-70 °C.</li>
	<li>Reconstrueren fundamentele fibroblastgroei factor (bFGF) in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op 10 µ g/mL en maak 10 µ L-hoeveelheid. Bewaar ze bij 4 °C.</li>
	<li>Om een nieuwe, ongeopende, 500 mL fles DMEM/F12 met glutamine, voeg B27 (10 mL), N2 (5 mL), en penicilline-streptomycine (5 mL). Plaats 50 mL van deze neurale stamcel (NSC) media in een conische buis en voeg 10 µ L van 10 µ g/µ L (2 µ g/mL Final) bFGF. Bewaar de NSC (+) bFGF media bij 4 °C.</li>
	<li>Om (-) bFGF media te maken, gebruik hetzelfde recept als beschreven in stap 1,3 maar Voeg geen bFGF toe. Deze media zullen worden gebruikt om NSCs te differentiëren tot neuronen en om neuronale culturen te handhaven na differentiatie.</li>
</ol>2. Lentiviral constructen
Opmerking: Voor het begin van het werk met lentiviral constructen, ervoor te zorgen dat het lab is goedgekeurd om bioveiligheid niveau-2 (BSL-2) agenten te gebruiken. Bovendien, BSL-2 cultuur kappen, persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE), en verwijdering methoden moeten worden gebruikt bij het werken met lentiviral vectoren.
<ol><li>Verkrijg tau constructies verpakt in lentivirus van een voorkeurs bron (Zie Sanders et al.10 voor construct informatie).</li>
</ol>3. kweken menselijke neurale stamcellen
Opmerking: NSCs worden meestal gezaaid op 100000-150000 cellen/cm2 en de meeste commercieel beschikbare NSCs worden verkocht als 1 x 106 cellen/flacon. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 10 cm cel cultuur gerechten (hoewel andere maten van de gerechten kunnen worden gebruikt); Daarom, indien commercieel beschikbare NSCs worden gebruikt, de NSCs kan nodig zijn om te worden uitgebreid door eerst wordt gekweekt in zes-well gerechten om te resulteren in voldoende cellen om zaad 10 cm gerechten. Dit protocol kan ook worden aangepast voor een verscheidenheid van de cel cultuur schotel maten (maar het bevat geen instructies voor passaging NSCs als deze protocollen beschikbaar zijn elders11,12).
<ol><li>
Voor de bereiding van de cellen van de cultuur van de cel, Verwijder één hoeveelheid bevroren kelder membraan matrijs deklaag voor de platen van de cel cultuur en laat het aan dooi bij 4 °C (de fracties kunnen bij 4 °C 's nachts worden geplaatst de dag alvorens de cellen moeten worden gezaaid). Voeg 385 µ L van kelder membraan matrix coating tot 5 mL van DMEM/F12 media + penicilline-streptomycine. Opmerking: 5 ml van DMEM/F12 media + penicilline-streptomycine is genoeg om een jas een enkele 10 cm schotel (1 ml van deze kelder membraan matrix coating oplossing is voldoende om een jas goed van een zes-well schotel). Als alternatief, als de cellen worden vastgesteld en immunostained, of gekleurd voor thioflavin, cultuur cellen op glas-dekglaasjes in 24-Well cultuur gerechten.<ol>
<li>Houd de media en de matrix coating koud voor en terwijl ze toe te voegen aan cultuur gerechten. Voeg de kelder membraan matrix coating aan cultuur gerechten en plaats de gerechten in een incubator (bij 37 ° c) voor 1 uur. Voor een optimale coating, niet incuberen de kelder membraan matrix voor meer dan of minder dan 1 uur. Na 1 uur, aspireren de kelder membraan matrix coating van de cel culturen gerechten. Zorg ervoor dat dit samenvalt met de NSCs klaar om te worden geplateerd. Opmerking: Als de cellen niet worden ontdooid van bevroren voorraden, Skip stap 3,2 en ga verder met stap 3,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als cellen worden ontdooid uit bevroren NSC voorraden, neem een flacon van bevroren cellen en verwarm het in een waterbad verwarmd tot 37 ° c door het bewegen van de flacon heen en weer in het water. Eenmaal ontdooid, spuit de flacon met 70% ethanol en plaats deze in een cel cultuur kap. Breng de cellen naar ~ 10 mL van DMEM/F12 + penicilline-streptomycine media en centrifugeer de buis bij kamertemperatuur bij 1.000 x g voor 5 min. aspireren de media en de cellen opnieuw op te schorten in NSC media.</li>
	<li>Verdun de cellen in de NSC media om de juiste zaai dichtheid voor de cel cultuur vaartuig dat wordt gebruikt te verkrijgen. Opmerking: Bijvoorbeeld, als NSCs worden geplateerd op een zes-well plaat-een goed op een zes-well cultuur schotel heeft een oppervlakte van 9 cm2-900.000 tot 1.350.000 cellen nodig zijn om zaad. Dus, een flacon met 1.000.000 cellen kunnen worden opgehangen in 2 mL van de media en toegevoegd aan een enkele put van een zes-well schotel.</li>
	<li>Voeg genoeg cellen geschorst in NSC media om het zaad van de kelder membraan matrix-gecoate cultuur gerechten (100.000 cellen/cm2) en verander de media om de andere dag (bij gebruik van een bevroren voorraad, verander de media de dag na plating en elke andere dag daarna). Kweek de cellen tot ze 75%-80% Confluent. Opmerking: De cellen zullen waarschijnlijk bereiken 75%-80% samenloop kort na plating, maar dit kan langer duren als bevroren voorraden worden gebruikt.</li>
	<li>Zodra de NSCs zijn 75%-80% Confluent, beginnen neuronale differentiatie door het verwijderen van de NSC (+) bFGF media en te vervangen door NSC (-) bFGF media. Kweek de cellen in deze media (ter vervanging van de media om de andere dag) gedurende ten minste 4 weken. Opmerking: De cellen zullen blijven verdelen voor een paar dagen na de intrekking van bFGF; Daarom kunnen cellen bereiken 90 tot 100% samenloop. Na kweken voor 4 weken, zullen de cellen hebben bereikt een neuronale lot en zal klaar zijn voor de behandeling van lentivirus.</li>
</ol>4. transductie en onderhoud van neuronale culturen
<ol><li>Om trans Duce neuronen met lentivirus, gebruik een titer graaf van 3,4 x 105 transducible eenheden/cel (een 100% Confluent 10 cm schotel zal bevatten ~ 10.000.000 neuronen). Verdun de transducible eenheden om de nodige concentratie in de cel cultuurmedia en voeg ze toe aan de cellen (gebruik het normale volume van de media voor de cel cultuur schotel). Twee dagen na het toevoegen van de lentivirus, was de cellen 1x met verse (-) bFGF media (zonder lentivirus) en verder kweken in (-) bFGF media zoals gewoonlijk.</li>
	<li>Voor de post-lentiviral behandeling, voer de transduced neuronen door het veranderen van de cel cultuurmedia ([-] bFGF media) om de andere dag. Handhaaf de cellen voor ~ 8 weken na transductie. Visualiseer routinematig de cellen onder een lichte Microscoop om levensvatbaarheid te verzekeren. Opmerking: Schaarste of dendritische breuken zijn tekenen dat de cellen niet meer levensvatbaar zijn.</li>
</ol>5. beeldvorming van cellen
<ol><li>
Live-cel beeldvorming
	<ol>
<li>Na de transductie (4 dagen na de toevoeging van lentivirus), observeren YFP signalen onder een fluorescerende Microscoop in staat van Live-cel beeldvorming. Neem de cel cultuur gerechten uit de incubator en zorg ervoor dat de cultuur putten steriel blijven door het deksel te houden op de top van de cultuur gerechten. Visualiseer de cellen met behulp van een 10x doelstelling met een excitatie golflengte van ~ 514 nm en een emissie filter van ~ 527 nm. Opmerking: Aggregaten zijn meestal zichtbaar in transduced Cell cultures 6 – 8 dagen na de toepassing van lentivirus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vaste-cel kleuring (β-tubulin III etikettering en thioflavin kleuring)
	<ol>
<li>Om de cellen in Paraformaldehyde (middel) te bevestigen, verwijder de cultuurmedia van transduced neuronen die op glas-dekglaasjes worden gekweekt. Was de cellen 1x met PBS, verwijder het wassen, en voeg 300-500 µ L (bij gebruik van 24-Well platen) van 4% (verdund in PBS) op de-dekglaasjes voor 20 min bij kamertemperatuur. Verwijder de-dekglaasjes en was de 2x met PBS.</li>
		<li>Bereid een blokkerende oplossing, bestaande uit PBS, 3% boviene serum albumine (BSA), en 0,3% Triton X-100. Voeg 300 – 500 µ L van de oplossing aan de putten toe en broed de-dekglaasjes voor 2 h bij 4 °C uit. Na 2 h, Verdun primaire antilichamen (bij een antilichamen concentratie van 1:500) in het blokkeren van oplossing en voeg 300 – 500 µ L van primaire antistof oplossing aan elk goed toe. Plaats de plaat op een schommelend of roterend platform (bij lage snelheid) overnachting bij 4 °C.</li>
		<li>De volgende dag, verwijder de primaire antilichaam oplossing en was de-dekglaasjes 3x voor 5 min elk met PBS. Verdun secundaire antilichamen in een blokkerende bufferoplossing (bij een concentratie van 1:1000) en voeg secundaire antilichamen oplossing aan elk goed toe. Selecteer het juiste secundaire antilichaam door een fluorescerende tag te gebruiken die niet overlapt met het YFP-signaal (bijvoorbeeld CY-3). Incubeer de cellen bij kamertemperatuur voor 2 uur op een schommelend of roterend platform. Na 2 h, verwijder de secundaire antilichaam oplossing en was de-dekglaasjes 3x voor 10 min elk met PBS.</li>
		<li>Was de-dekglaasjes in dubbel-deioniseerde water (DDW) voor 10 min. Verwijder de DDW en voeg 300 µ L/put van 0,015% thioflavin-S verdund in 50% ethanol voor 10 min. Verwijder de thioflavin oplossing en was de-dekglaasjes 2x voor 4 min elk met 50% ethanol, gevolgd door een 4 min wassen met 30% ethanol en twee wasbeurten voor 5 min elk met 30% ethanol. Was de-dekglaasjes 1x met DDW voorafgaand aan de montage. Opmerking: De thioflavin kleuring beschreven in stap 5.2.4 is optioneel.</li>
		<li>Om de-dekglaasjes te monteren op glas dia's, plaats een enkele druppel van de montage van media op de "+" kant van een glazen glijbaan. Verwijder alle vloeistof uit de put met de glazen dekglaasje en, met behulp van fijne Tang, zorgvuldig verwijderen van de glazen dekglaasje, het bijhouden van welke kant heeft de gekweekte cellen.</li>
		<li>Druk zachtjes op de rand van de dekglaasje tegen een Kimwipe om overtollig vocht te verwijderen. Nog steeds aangrijpend de dekglaasje met fijne Tang, raak de rand (met de cel zijde naar de daling van de montage van de media) van de dekglaasje aan de montage media, en vervolgens voorzichtig plaats de dekglaasje op de montage media (het plaatsen van de gekweekte cellen in de montage media en beboteren ze tussen de dekglaasje en de glazen glijbaan). Laat de bevestigings media gedurende 30 minuten uitharden voorafgaand aan de beeldvorming. De dia's kunnen worden opgeslagen bij-20 °C voor toekomstig gebruik.</li>
		<li>Afbeelding van de cellen met behulp van een fluorescerende Microscoop en de juiste excitatie/emissie spectra (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 nm, en thioflavin S = ~ 390/426 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. facultatieve methodes
<ol><li>Om de 2 dagen, verzamel geconditioneerde media van de culturen en bewaar het bij-20 °C voor toekomstige analyses van Tau soorten die door culturen worden vrijgegeven.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft de generatie van een in vitro model van de menselijke tauopathy dat vertoont zilver-vlek-positieve aggregaten en thioflavin-positieve neurofibrillaire klitten (NFTs). Bovendien, transduced cellen weer te geven tau-geïnduceerde pathologieën zoals morfologische gebreken, verminderde synaptogenese, en een verhoogd lysosomale volume. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een toegankelijke en kosteneffectieve model van neuronale tauopathy, die kan worden gebruikt voor drug screening st...

Pathologische aggregatie van de microtubule-geassocieerde proteïne Tau is een bepalend kenmerk van vele neurodegeneratieve ziekten, waaronder AD, Frontotemporale dementie (FTD), de ziekte van pick, en Progressieve supranucleaire parese (PSP)1. In een niet-zieke staat, tau bindt aan en stabiliseert microtubule filamenten in neuronale axonen2. Echter, ziekte-geassocieerde hyperphosphorylation van Tau bevordert tau aggregatie, dissociatie van microtubuli, en neuronale toxiciteit3. De toxische effecten van geaggregeerde tau kan leiden tot afwijkende activering van cholinerge4 en glutamaterge receptoren5 resulteert in de ontregeling van intracellulaire calcium en, uiteindelijk, celdood. In diermodellen, de vermindering van de hersenen tau verbetert de pathologie in AD muizen6 en in muismodellen van repetitieve mild traumatisch hersenletsel7.
Montage bewijs toont aan dat de structuur en bindende affiniteit van muis-afgeleide tau zijn verschillend van de mens afgeleide tau en dat de muis Tau is ongeschikt voor het modelleren van de menselijke therapeutische8. Echter, menselijke cel tauopathy modellen zijn niet op grote schaal commercieel beschikbaar. Het algemene doel van dit werk is het beschrijven van een in vitro model van Tau aggregatie waarin menselijke neuronen worden transduced met lentiviral-afgeleide vectoren met Mutant menselijke tau constructen9. Tau aggregaat waardoor lentiviral constructen codeert voor de tau te herhalen domein harboring P301L en V337M mutaties gesmolten tot een YFP Reporter (tau-RDLM-YFP), terwijl de controle construeert code voor de wild-type (WT) tau herhalen domein gesmolten tot een YFP Reporter (tau-WT-YFP). Neuronale culturen transduced met behulp van deze methode Express ongeveer negen keer meer tau dan nontransduced culturen. Hoewel het bedrag van de tau-expressie overexpresse is ruwweg gelijk tussen tau-RDLM-YFP-en tau-WT-YFP-transduced cellen, alleen neuronen transduced met tau-RDLM-YFP display aggregaten. Culturen transduced met tau-RDLM-YFP vlek positief voor thioflavin en display reducties in axonale lengte en synaptische dichtheid. Daarom is dit cellulaire model kan een nuttig instrument voor het bestuderen van Tau aggregatie in vitro.

<table><tbody><tr><td>10 cm kweekschalen</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>15 mL buizen</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Thermofisher</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>24 wel kweekplaten</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>50 mL buizen</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol in spuitfles</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane matrix (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Basic FGF</td><td>Biopioneer</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Celkweek incubator</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 kweekmedium met glutamine</td><td>Thermofisher</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (50% concentratie of hoger)</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent gelabelde secundaire antilichamen</td><td>Diverse bronnen, afhankelijk van het experiment</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes</td><td>Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>Glazen objectglaasjes</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke neurale stamcellen</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirale vectoren</td><td>Diverse bronnen</td><td>op bestelling</td><td></td></tr><tr><td>Montage medium</td><td>Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Primaire antilichamen</td><td>Diverse bronnen, afhankelijk van het experiment</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Schud- of draaitafel</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Steriele celkweek kap</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavine S</td><td>Sigma</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Diverse bronnen</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

een in vitro model voor het bestuderen van tau-aggregatie met behulp van lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Afwijkende aggregatie van het eiwit tau is pathogeen betrokken bij een aantal neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD). Hoewel de Muismodellen van tauopathy hebben een waardevolle bron voor het onderzoek van de neurotoxiciteit mechanismen van geaggregeerde tau, is het steeds duidelijker dat, als gevolg van interspecies verschillen in fysiologie, de muis hersenen is ongeschikt voor het modelleren van de menselijke conditie. Vooruitgang in de cel cultuur methoden hebben gemaakt menselijke neuronale culturen toegankelijk voor experimenteel gebruik in vitro en hebben geholpen bij de ontwikkeling van neurotherapeutics. Echter, ondanks de aanpassing van de menselijke neuronale cel culturen, in vitro modellen van de menselijke tauopathy zijn nog niet op grote schaal beschikbaar. Dit protocol beschrijft een cellulair model van Tau aggregatie waarin menselijke neuronen zijn transduced met lentiviral-afgeleide vectoren die code voor pathogene gemuteerde tau gesmolten tot een gele fluorescerende eiwit (YFP) verslaggever. Transduced culturen produceren tau aggregaten die positief vlek voor thioflavin en display markers van neurotoxiciteit, zoals verminderde axonale lengte en verhoogde lysosomale volume. Deze procedure kan een nuttig en kostenbesparend model zijn voor het bestuderen van menselijke therapeutische.

Tau-RDLM-YFP-transduced neuronen werden fluorescerend gelabeld met YFP, en RDLM-transduced culturen weergegeven aggregaten na transductie. Deze inclusies gekleurd positief voor thioflavin (Figuur 1). Zoals Figuur 1 aantoont, produceert dit protocol neuronale culturen die thioflavin-positieve tau aggregaten weergeven. Voor de eerste experimenten, is het aanbevolen dat neuronale differentiatie wordt bevestigd door immunolabeling de neuron-specifieke marker β-tubul...

Dit protocol Details een procedure waarin menselijke neuronale culturen zijn transduced met lentiviral constructen codering voor Mutant Human tau. Transduced culturen weer te geven tau aggregaten en geassocieerde pathologieën.

Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

In dit protocol beschrijven we een in vitro model van menselijke tauopathie. Deze methode vult een materiaalbehoefte die nuttig kan zijn voor onderzoek naar geneesmiddelen en studies naar ziektemechanismen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de cel cultuur paradigma zorgt voor een snellere beoordeling van tau toxiciteit en potentiële tau therapeutica in vergelijking met dierlijke studies Om te beginnen met deze procedure ontdooien de kelder membraan matrix coating voor cultuur platen op vier graden Celsius.Maak een milliliter aliquots en bewaar ze op min 20 of min 70 graden Celsius. Reconstrueren vervolgens de basisfiblastgroeifactor in steriele PBS bij een concentratie van 10 microgram per milliliter. Maak 10-microliter aliquots en bewaar ze op vier graden Celsius.Vervolgens uiteengezet een nieuwe ongeopende 500-milliliter fles DMEM-F12 met glutamine. Voeg 10 milliliter B27, vijf milliliter N2 en vijf milliliter penicilline-streptomycine toe om neurale stamcelmedia voor te bereiden. Plaats 50 milliliter van de NSC-media in een conische buis en voeg 10 microliter van de bereide bFGF toe.Bewaar deze NSC plus bFGF media op vier graden Celsius. Verwijder eerst een aliquot van bevroren keldermembraanmatencoating voor celkweekplaten uit de vriezer en het laat toe om bij vier graden Celsius te ontdooien. Voeg 385 microliters van de ontdooide keldermembraanmatrijslaag toe aan vijf milliliter DMEM-F12-media met penicilline-streptomycine.Als cellen worden ontdooid uit bevroren NSC-voorraden, neem dan een flesje bevroren cellen uit de vriezer en verwarm deze in een waterbad verwarmd tot 37 graden Celsius door het flesje heen en weer te bewegen in het water. Spray hierna de flacon met 70% ethanol. Breng de cellen vervolgens onder een celkweekkap over op ongeveer 10 milliliter DMEM-F12-media met penicilline-streptomycine.Centrifuge bij kamertemperatuur op 1.000 keer g gedurende vijf minuten. Dan aspirate de media en resuspend de cellen in NSC media. Verdun de cellen in NSC-media om de juiste zaaidichtheid te verkrijgen voor het celkweekvat dat wordt gebruikt.Voeg genoeg cellen opgehangen in NSC media om de kelder membraan matrix gecoate kweekgerechten zaad. Kweek de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide totdat ze 75 tot 80% confluent, zorg ervoor dat de media te veranderen om de andere dag. Om neuronen te transduceren met lentivirus, gebruik dan een titer telling van 340,000 transducible eenheden per cel.Verdun de transducible eenheden in celkweekmedia aan de noodzakelijke concentratie, en voeg hen aan de cellen toe. Twee dagen na het toevoegen van het lentivirus, was de cellen een keer met verse media die geen bFGF bevatten. Blijf de cellen kweken bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide in media zonder bFGF.Onderhoud de cellen voor ongeveer acht weken na transductie, zorg ervoor dat de celcultuur media te veranderen om de andere dag. Gebruik een lichtmicroscoop om de cellen routinematig te visualiseren en de levensvatbaarheid te garanderen. Na transductie, verwijder de cultuurschotels uit de couveuse om ervoor te zorgen dat het deksel op hen te houden van de cultuur goed steriel.Gebruik een fluorescerende microscoop die in staat is om te leven celbeeldvorming om de cellen onder een 10X-doelstelling te visualiseren met een excitatie van 514 nanometer en een emissiefilter van 527 nanometer. In deze studie neuronen doorgegeven met tau-RDLM-YFP lentivirus zijn fluorescerend gelabeld met YFP. Door RDLM-getransduceerde culturen worden gezien als aggregaat na transductie.Deze insluitsels vlekken positief voor thioflavine. Neuronale differentiatie wordt bevestigd door immunolabeling van de neuron-specifieke marker beta-tubuline III in culturen. Het is belangrijk om te onthouden dat fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen een excitatie-emissiespectrum moeten hebben dat niet overlapt met dat van YFP.Hoewel gele fluorescentie tau aggregaten zichtbaar zullen zijn bij afwezigheid van vlekken, moet thioflavine ook worden gebruikt voor beeldvorming om te bevestigen dat het fluorescerende signaal tau is geaggregeerd en niet cellulair puin. Na de generatie van tau overexpressing cellen, een aantal beoordelingen van neuronale gezondheid en tau aggregatie kan worden uitgevoerd. We hebben bijvoorbeeld ontdekt dat deze cellen axonale degeneratie vertonen.Naast celkweekstudies hebben we deze methode gebruikt om de pathogeniteit exosoomale-afgeleide tau te onderzoeken.

an-vitro-model-for-studying-tau-aggregation-using-lentiviral-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video showcases a cell-based assay quantifying Tau uptake by murine microglia using pH-sensitive fluorescent-labeled Tau aggregates, analyzed via fluorescence-activated cell sorting for a quantitative assessment.

A Cell-Based Assay to Assess the Tau Protein Uptake by Microglia

This video demonstrates the process of transducing human neuronal cells with a lentivirus encoding a mutant human tau protein tagged with yellow fluorescent protein (YFP) to study protein aggregation. It outlines the steps from viral entry to mutant tau expression, culminating in the formation of visible cytoplasmic tau aggregates in the neurons.

Lentiviral-Mediated Transduction of Human Neurons for Tau Protein Aggregation Analysis

Ongemodificeerde en hypergefosforyleerd tau-eiwitten werden twee in vitro aggregatie-assays om de hyperfosforylering afhankelijke snelle aggregatie kinetiek onthullen. Deze assays weg effenen voor toekomstige schermen voor verbindingen die de neiging van hypergefosforyleerde tau kan moduleren fibrillen die de progressie van de ziekte van Alzheimer ten grondslag vormen.

In vitro aggregatietesten gebruiken hypergefosforyleerd Tau proteïne

De overdracht van eiwitaggregaten, of proteopathische zaden, van cel tot cel kan ten grondslag liggen aan de progressie van pathologie in neurodegeneratieve ziekten. Hier wordt een nieuwe FRET-flowcytometrische assay beschreven die een specifieke en gevoelige detectie van zaaiactiviteit uit recombinante of biologische monsters mogelijk maakt.

Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

De tau aggregatie assay beschreven in dit manuscript bootst de verwachte kenmerken van in vivo misfolding tau en aggregatie.

In Vitro Assay voor het bestuderen van de aggregatie van eiwitten Tau en Drug Screening

Hier beschrijven we een cel-gebaseerde test om te beoordelen kwantitatief tau opname door microglia met als doel van het creëren van een instrument voor onderzoek beter karakteriseren de mechanismen van de actie van de anti-tau antilichamen.

Cel-gebaseerde Assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde Tau goedkeuring door Microglia

Tau is een neuronale eiwit aanwezig zowel in het cytoplasma, waar het bindt microtubuli, en in de Nucleus, waar het oefent onconventionele functies, met inbegrip van de modulatie van de ziekte van Alzheimer-gerelateerde genen. Hier beschrijven we een methode om de functie van nucleaire tau te onderzoeken, terwijl alle interferenties uit cytoplasmatische tau worden uitgesloten.

Modulatie van Tau Subcellulaire lokalisatie als een instrument om de uitdrukking van ziektegerelateerde genen te onderzoeken

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Polyglutamine spinocerebellaire ataxieën worden veroorzaakt door CAG-expansies die aggregatiegevoelige eiwitten produceren. Dit protocol beschrijft vectorproductie, stereotaxische toediening en analyse van inclusies en verlies van neuronale markers, en biedt een gecontroleerd platform om mechanismen te onderzoeken en gerichte therapieën voor neurodegeneratieve ziekten te evalueren.

Lentiviraal-geïnduceerde striatale pathologie als preklinisch model van polyglutamine spinocerebellaire ataxie

Leer een in vitro model voor tauopathieën door lentivirale transductie van menselijke neuronen met mutant tau. Deze methode versnelt het onderzoek naar tau-toxiciteit en therapeutische interventies.

Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen (Video) | JoVE Journal

Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

Meer video's verkennen