Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen
23 mei 2019
Dit protocol Details een procedure waarin menselijke neuronale culturen zijn transduced met lentiviral constructen codering voor Mutant Human tau. Transduced culturen weer te geven tau aggregaten en geassocieerde pathologieën.
In dit protocol beschrijven we een in vitro model van menselijke tauopathie. Deze methode vult een materiaalbehoefte die nuttig kan zijn voor onderzoek naar geneesmiddelen en studies naar ziektemechanismen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de cel cultuur paradigma zorgt voor een snellere beoordeling van tau toxiciteit en potentiële tau therapeutica in vergelijking met dierlijke studies Om te beginnen met deze procedure ontdooien de kelder membraan matrix coating voor cultuur platen op vier graden Celsius.
Maak een milliliter aliquots en bewaar ze op min 20 of min 70 graden Celsius. Reconstrueren vervolgens de basisfiblastgroeifactor in steriele PBS bij een concentratie van 10 microgram per milliliter. Maak 10-microliter aliquots en bewaar ze op vier graden Celsius.
Vervolgens uiteengezet een nieuwe ongeopende 500-milliliter fles DMEM-F12 met glutamine. Voeg 10 milliliter B27, vijf milliliter N2 en vijf milliliter penicilline-streptomycine toe om neurale stamcelmedia voor te bereiden. Plaats 50 milliliter van de NSC-media in een conische buis en voeg 10 microliter van de bereide bFGF toe.
Bewaar deze NSC plus bFGF media op vier graden Celsius. Verwijder eerst een aliquot van bevroren keldermembraanmatencoating voor celkweekplaten uit de vriezer en het laat toe om bij vier graden Celsius te ontdooien. Voeg 385 microliters van de ontdooide keldermembraanmatrijslaag toe aan vijf milliliter DMEM-F12-media met penicilline-streptomycine.
Als cellen worden ontdooid uit bevroren NSC-voorraden, neem dan een flesje bevroren cellen uit de vriezer en verwarm deze in een waterbad verwarmd tot 37 graden Celsius door het flesje heen en weer te bewegen in het water. Spray hierna de flacon met 70% ethanol. Breng de cellen vervolgens onder een celkweekkap over op ongeveer 10 milliliter DMEM-F12-media met penicilline-streptomycine.
Centrifuge bij kamertemperatuur op 1.000 keer g gedurende vijf minuten. Dan aspirate de media en resuspend de cellen in NSC media. Verdun de cellen in NSC-media om de juiste zaaidichtheid te verkrijgen voor het celkweekvat dat wordt gebruikt.
Voeg genoeg cellen opgehangen in NSC media om de kelder membraan matrix gecoate kweekgerechten zaad. Kweek de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide totdat ze 75 tot 80% confluent, zorg ervoor dat de media te veranderen om de andere dag. Om neuronen te transduceren met lentivirus, gebruik dan een titer telling van 340,000 transducible eenheden per cel.
Verdun de transducible eenheden in celkweekmedia aan de noodzakelijke concentratie, en voeg hen aan de cellen toe. Twee dagen na het toevoegen van het lentivirus, was de cellen een keer met verse media die geen bFGF bevatten. Blijf de cellen kweken bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide in media zonder bFGF.
Onderhoud de cellen voor ongeveer acht weken na transductie, zorg ervoor dat de celcultuur media te veranderen om de andere dag. Gebruik een lichtmicroscoop om de cellen routinematig te visualiseren en de levensvatbaarheid te garanderen. Na transductie, verwijder de cultuurschotels uit de couveuse om ervoor te zorgen dat het deksel op hen te houden van de cultuur goed steriel.
Gebruik een fluorescerende microscoop die in staat is om te leven celbeeldvorming om de cellen onder een 10X-doelstelling te visualiseren met een excitatie van 514 nanometer en een emissiefilter van 527 nanometer. In deze studie neuronen doorgegeven met tau-RDLM-YFP lentivirus zijn fluorescerend gelabeld met YFP. Door RDLM-getransduceerde culturen worden gezien als aggregaat na transductie.
Deze insluitsels vlekken positief voor thioflavine. Neuronale differentiatie wordt bevestigd door immunolabeling van de neuron-specifieke marker beta-tubuline III in culturen. Het is belangrijk om te onthouden dat fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen een excitatie-emissiespectrum moeten hebben dat niet overlapt met dat van YFP.
Hoewel gele fluorescentie tau aggregaten zichtbaar zullen zijn bij afwezigheid van vlekken, moet thioflavine ook worden gebruikt voor beeldvorming om te bevestigen dat het fluorescerende signaal tau is geaggregeerd en niet cellulair puin. Na de generatie van tau overexpressing cellen, een aantal beoordelingen van neuronale gezondheid en tau aggregatie kan worden uitgevoerd. We hebben bijvoorbeeld ontdekt dat deze cellen axonale degeneratie vertonen.
Naast celkweekstudies hebben we deze methode gebruikt om de pathogeniteit exosoomale-afgeleide tau te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een protocol voor het opzetten van een in vitro model van menselijke tauopathie door neuronale culturen te transduceren met lentivirale constructen die coderen voor mutant menselijk tau. Het model maakt een snellere beoordeling van tau-toxiciteit en potentiële therapeutica mogelijk in vergelijking met traditionele dierstudies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Tauopathieën
Achtergrond
- Humane tauopathieën zijn neurodegeneratieve ziekten die worden gekenmerkt door aggregatie van het tau-eiwit.
- Traditionele modellen hebben vaak lange tijdlijnen en zijn niet altijd representatief voor de humane pathologie.
- Dit protocol presenteert een sneller en specifieker beoordelingsparadigma via celculturen.
- Het pakt de beperkingen van diermodellen aan bij het bestuderen van interacties van het tau-eiwit.
Doel van de studie
- Om een menselijk neuraal cultuurmodel te ontwikkelen voor het bestuderen van tau-pathologie.
- Om bij te dragen aan drugscreening voor tau-gerelateerde ziekten.
- Om het begrip van de rol van tau bij neurodegeneratie te bevorderen.
Gebruikte methoden
- Het gebruikte platform is een menselijk neuronaal celcultuursysteem.
- Het biologische model bestaat uit menselijke neuronen die getransduceerd zijn met mutant tau met behulp van lentivirale constructen.
- Er wordt in de tekst geen multi-omics workflow vermeld.
- De cellen worden ongeveer acht weken na transductie in stand gehouden, met regelmatige mediumverversingen.
- Licht- en fluorescentiemicroscopie worden ingezet om tau-aggregatie te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- De getransduceerde culturen vertoonden tau-aggregaten, wat werd bevestigd door thioflavine-kleuring.
- Neuronale differentiatie werd gevalideerd via immunolabeling van bèta-tubuline III.
- Waarnemingen wezen op axonale degeneratie bij de cellen met tau-overexpressie.
- De studie benadrukt de levensvatbaarheid van het gebruik van dit model voor het evalueren van de neuronale gezondheid in relatie tot tau.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een betrouwbare in vitro benadering om tauopathieën te onderzoeken en tau-toxiciteit te beoordelen.
- Het ontwikkelde model opent mogelijkheden voor het testen van potentiële tau-therapeutica.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van de mechanismen achter tau-aggregatie en neurodegeneratie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit in vitro menselijke neuronmodel vult een kritisch gat in het onderzoek naar tauopathieën door een menselijk-relevant systeem te bieden voor de snelle beoordeling van tau-aggregatie en neurotoxiciteit. Het maakt doelwitvalidatie in een vroeg stadium en mechanische risicoreductie voor tau-gerichte therapieën mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van langdurige dierstudies wordt verminderd. Het model ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid bij de identificatie van lead-verbindingen en preconlinische triage voor programma's gericht op neurodegeneratieve ziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt pathogene tau-mutanten in menselijke neuronen om therapeutische targets te valideren en aggregatiemechanismen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk via kwantitatieve readouts zoals veranderingen in axonale lengte en lysosomaal volume.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portfolio-triage door mensspecifieke tau-pathologie en toxiciteitsprofielen te modelleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gestandaardiseerde, fluorescent gelabelde tau-aggregaten die detecteerbaar zijn via YFP- en thioflavine-kleuring voor compoundscreening.
- Kwantitatieve outputs: Maakt meting van de aggregatielast en neurotoxische fenotypes mogelijk als afhankelijke variabelen in dosis-responsassays.
- Schaalbaarheid: Lentivirale transductie maakt een consistente, schaalbare preparatie van ziekterelevante neuronale culturen mogelijk voor high-content screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Maakt gebruik van menselijke neuronen die pathogene tau-mutanten tot expressie brengen om vroege gebeurtenissen bij de ziekte van Alzheimer en gerelateerde tauopathieën te modelleren.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsfase en preklinisch werk door een menselijk cellulair systeem te bieden voor studies naar het werkingsmechanisme.
- Risico-gecorrigeerde besluitvorming: Maakt evaluatie van tau-gerichte verbindingen mogelijk in een systeem dat thioflavine-positieve aggregaten en neurietdegeneratie vertoont.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het model past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische effectiviteitstesten, ter ondersteuning van iteratieve design-make-test-cycli voor tau-modulatoren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van tau-mutanten en het verduidelijken van signaalpaden via live-cell imaging van aggregatie- en toxiciteitsmarkers.
- Screening: Levert assay-klare culturen met gestandaardiseerde transductie- en aggregatiephenotypes voor de evaluatie van verbindingenbibliotheken.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve afhankelijke variabelen, waaronder fluorescerende aggregaatlast, axonale lengte en lysosomaal volume voor statistische vergelijking.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische validatie door menselijke tau-pathologie te modelleren in een reductionistisch systeem.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het testen van meerdere tau-constructen, inhibitoren of gene-editingbenaderingen over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in het doelwit door menselijke tauopathie te modelleren met pathogene mutanten en aggregaten te valideren via thioflavine-positiviteit.
- Operationele waarde: Biedt een kosteneffectief, reproduceerbaar systeem met gedefinieerde media, transductieprotocollen en een cultuurtijdlijn van acht weken.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege, mens-relevante gegevens over neurotoxiciteit en werkzaamheid te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van tau-therapeutica mogelijk op basis van read-outs van aggregatie en neurietdegeneratie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neuronale celkweek, lentivirale transductie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot menselijke neurale stamcellen, lentivirale vectoren en beeldvormingsapparatuur met passende filtersets.
- Maakt standaardisatie van de transductietiter (340,000 TU/cel) en mediaformuleringen over verschillende locaties noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende tau-mutanten of reporterconstructen naast tau-RDLM-YFP.
- Beperkt door de kweekduur van acht weken en potentiële variabiliteit in de efficiëntie van aggregaatvorming.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Preparation of Media and Reagents
1:41
Culturing Human Neural Stem Cells
3:12
Transduction and Maintenance of Neuronal Cultures
4:05
Live-cell Imaging
4:32
Results: Analysis of Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons
5:22
Conclusion
