Excitatie-Scanning hyperspectrale beeld microscopie om fluorescentie signalen efficiënt te discrimineren

Dit protocol is belangrijk omdat het een methode beschrijft die kan worden gebruikt om verschillende fluorescerende signalen in één monster te scheiden. In vergelijking met traditionele methoden kan excitatiescannen de snelheid van het experiment verhogen en de gevoeligheid van de gegevens verbeteren. Door het gebruik van verschillende verlichtingsbronnen, zoals een supercontinuumlaser, kan deze methode van toepassing zijn op draaiende schijf- of laserscannende confocale microscoopsystemen.

Bij het uitvoeren van excitatie-scannings, spectrale imaging microscopie, is het belangrijk om te controleren of de excitatiepiek van elk fluorescerend label optreedt op een andere golflengte. Om te beginnen, het opzetten van een omgekeerde fluorescentie microscoop en camera zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad vervolgens het monster op het podium.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu van het hoofdvenster van micromanager 475 nanometer voor de eerste steekproefweergave. Dubbelklik vervolgens op het vak naast de belichting en voer 100 in om de belichtingstijd in te stellen op 100 milliseconden. Klik tot slot op live om het voorbeeld te bekijken.

Klik nu op Auto. De knop automatisch intensiteitsweergavebereik om de minimale en maximale waarden in zinvolle, visuele bereiken te brengen. Gebruik vervolgens de focusknoppen van de microscoop om het monster scherp te stellen.

Eenmaal scherp, pas de positie van het monster aan, zodat de rand zich in het midden van het gezichtsveld bevindt. Stem dan de focus af. Het voorbeeld is scherp wanneer de randfuncties in de afbeelding scherp lijken.

Open nu de multidimensionale acquisitietool. Klik in het menu op de laadknop en kies een vooraf ingestelde instelling met een geschikt golflengtebereik voor spectrale acquisitie. Zodra de acquisitie-instellingen zijn bevestigd, gaat u naar een leeg gebied van het voorbeeld en klikt u op acquire om een spectrale afbeeldingsstapel te verzamelen die achtergrond en ruis bevat die later voor aftrekking kunnen worden gebruikt.

Ga vervolgens over het voorbeeld om de helderste gebieden te vinden. Monsters zijn waarschijnlijk meer intense fluorescentie uit de buurt van de rand van het monster. Zodra de helderste regio zich bevindt, neemt u één afbeeldingsstapel.

Laad de overgenomen afbeelding in Image J en gebruik de meetfunctie van Image J om te bevestigen dat er geen golflengten overbelichte pixels bevatten. Als een verminderde belichtingstijd nodig is als gevolg van overbelichting, moet het achtergrondbeeld ook worden heroverd met een nieuwe belichtingstijd. Als een van de beelden de opwaartse detectielimiet van de camera bevat, past u de belichtingstijd van de spectrale scan aan om ervoor te zorgen dat het maximale signaal in het gehele spectrale bereik het dynamische bereik van de camera niet overschrijdt.

Met een geschikte belichtingstijd die nu wordt bepaald, plaatst u een niet-gelabeld monster op het podium. Verwerf spectrale afbeeldingsgegevens uit het niet-gelabelde voorbeeld om te bepalen of er onderliggende autofluoresence is. Plaats vervolgens een enkelgelabeld monster op het podium.

Verwerf spectrale afbeeldingsgegevens van elk van de voorbeelden met één label om te gebruiken als spectrale besturingselementen om een spectrale bibliotheek te bouwen. Voer de scan uit voor elk besturingselementmonster met behulp van een identieke belichtingstijd van het golflengtebereik en camera-instellingen. Plaats vervolgens een dia met het experimentele monster op de microscoop.

Selecteer een gezichtsveld dat cellen op de juiste manier heeft gelabeld en verwerf de spectrale afbeeldingsgegevens uit het voorbeeld met behulp van de bepaalde acquisitie-instellingen. Corrigeer afbeeldingen tot een vlakke spectrale respons door het achtergrondspectrum van de voorbeeldafbeelding af te trekken en de afbeelding te vermenigvuldigen met de correctiecoëfficiënt. Hier wordt een MATLAB script gebruikt om de beelden snel te verwerken.

Vervolgens genereert u de spectrale bibliotheek. Voor de beste resultaten normaliseert u elk eindlid tot de golflengteband van de grootste intensiteit door te bepalen welke golflengteband de meest intense waarde heeft en de meting bij elke golflengteband te delen door die maximale waarde. Sla vervolgens de spectrale gegevens op als een datbestand.

Wanneer voltooid, ontmengen de spectrale afbeeldingsgegevens. De unmixing stap zal genereren een overvloed beeld voor elk fluorescerend label, waar overvloed is de hoeveelheid relatieve fluorescerend signaal in het beeld van de prospectieve label. Open vervolgens elk ongemengd beeld om de verdeling van zuivere componenten visueel te inspecteren.

Vergelijk de omvang van het foutbeeld met die van de niet-gemengde afbeeldingen. Als de omvang van het foutbeeld vergelijkbaar is met de niet-gemengde overvloedafbeeldingen, kunnen signalen in de spectrale beeldgegevens niet nauwkeurig worden verantwoord. Controleer ten slotte of er geen niet-geïdentificeerde reststructuren zijn door het foutbeeld te vergelijken met de ongemengde afbeeldingen.

Wanneer correct uitgevoerd, maakt het spectrale niet-mengende proces scheiding van een spectrale beeldstapel in respectieve bijdragen van elk fluorescentieetiket mogelijk. Hier, een ongemengde spectrale beeld set met individuele beelden markeren luchtwegen gladde spiercel autofluorescentie, een GCaMP sonde en een mitochondriaal label. Er is een grote fout in verband met de nucleaire en perinucleaire gebieden van de cellen waaruit blijkt dat de gemeten spectra van deze regio's niet goed worden verantwoord door de spectra in de spectra bibliotheek.

Pure spectra verzameld uit gelabelde cellen die ook autofluorescenten zal waarschijnlijk vervuilen het spectrale profiel voor de zuivere component. Hier kan men het verschil zien van het onvermengen met pure spectra besmet met autofluorescentie, versus de gecorrigeerde zuivere spectra na geschaalde aftrekking. Een goede gegevensverwerving is essentieel bij het beeldvorming van gevoelige monsters, omdat ze slechts één beeldvormingssessie kunnen overleven in tegenstelling tot de achtergrond en besturingselementen die opnieuw kunnen worden uitgebeeld.

Zorg ervoor dat de juiste hardware- en acquisitie-instellingen zoveel mogelijk vooraf worden bepaald. Als volgende stap kunnen video's die zijn gemaakt van time-lapse-gegevens die met dit systeem zijn verkregen, worden gebruikt om fluorescerende bronnen in de loop van de tijd op discrete locaties bij te houden, zoals tweede messenger-signaallokalisatie. Let op bij het gebruik van krachtige lichtbronnen om blootstelling aan de ogen te voorkomen.

Zorg er ook voor dat u de juiste handschoenen draagt bij het hanteren van biologische etiketten.