Een niet-willekeurig muis model voor farmacologische reactivering van Mecp2 op het inactieve X-chromosoom

Dit protocol kan worden gebruikt om een niet-willekeurig muismodel te genereren voor het testen en kwantificeren van de reactivering van het inactieve X-gekoppelde Mecp2-chromosoom in de hersenen van een levende muis. Dit model kan eenvoudig worden aangepast om Xi-reactivering te bestuderen in andere X-gekoppelde ziektemodellen zoals het DDX3X-syndroom. Ik ben een post doc in sanchita Bhatnagar's laboratorium en ik zal de procedure met Zeming Zheng demonstreren.

Begin met het positioneren van de verdoofde muis in een stereotactisch platform met de snijtanden in de bijtbalk van de snuit restrainer. Draai de neusklem vast terwijl de muis het hoofd op een vlak vlak houdt. Pas de hoogte van de oorbalken aan om het staartgedeelte van de gehoorgang te bereiken om het hoofd geïmmobiliseerd te houden.

Desinfecteer vervolgens de kop met afwisselende doekjes van een actueel antiseptisch en 70% ethanol. Wanneer de muis klaar is, gebruik dan een steriele scalpel om een horizontale incisie van 0,75 centimeter in de middenscals te maken. Gebruik een 0,45 millimeter braam om twee symmetrische gaten boven de rechter en linker corticale hemisferen twee millimeter van de sagittale hechting en de lambdoïde hechting in het benaderende midden van het pariëtale bot boren.

Bevestig stevig een 10 microliter spuit aan het stereotactische platform en laad 10 microliter vers bereide chemische remmer in de spuit. Ga de naald in het eerste braamgat terwijl de naald loodrecht op de schedel blijft staan. Wanneer de naald de schedel doorkruist, nul uit de coördinaten op de stereotactische digitale display en vooraf de punt van de naald totdat het een diepte van 2,5 millimeter bereikt.

Trek de naald 0,5 millimeter naar een diepte van twee millimeter en injecteer langzaam het volledige volume van 10 microliter van de oplossing over een periode van één minuut. Nadat alle remmer is geleverd, laat de naald nog een minuut in de hersenen voordat u de naald intrekt. Herhaal de injectie in het tweede braamgat met behulp van het voertuig alleen als een controle en sluit de huid over de incisie.

Breng de muis vervolgens van het stereotactische apparaat over op een 37 graden Celsius verwarmingskussen met bewaking tot volledig herstel. Aan het einde van het dosisregime beveiligt u de muis op een ontleedpad. Gebruik schaar en tangen om een laterale incisie te maken door het integument en de buikwand net onder de ribbenkast.

Scheid de lever voorzichtig van het middenrif en snijd door het middenrif langs de gehele lengte van de ribbenkast om de pleuraholte bloot te leggen. Gebruik de schaar om een incisie te maken aan het achterste uiteinde van de linker ventrikel en onmiddellijk injecteren van de rechter hartkamer met ongeveer 15 milliliter PBS over een periode van twee minuten. Een succesvolle perfusie zal resulteren in een lever kleur verandering van rood naar lichtroze.

Wanneer alle PBS is geleverd, doorsneed het hart met ongeveer 10 milliliter van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende twee minuten. Na het oogsten van het hoofd, gebruik een schaar om een middellijn incisie in de hoofdhuid te maken om de schedel bloot te leggen. Plaats een puntje van de schaar in de foramen magnum om de creatie van een laterale incisie in de schedel naar het oog te vergemakkelijken.

Maak een soortgelijke incisie aan de andere kant van de schedel houden van het einde van de schaar zo oppervlakkig mogelijk en snijd het gebied van de schedel tussen de ogen en boven de neus van de muis. Gebruik tangen om voorzichtig schil de schedelbeenderen van de hersenhelften en gebruik een spatel om de hersenen te verheffen. Ontleden zorgvuldig de schedelzenuwvezels die de hersenen aan de schedel bevestigen en de hersenen in een plastic schotel plaatsen.

Dan accijnzen de cerebellum en reukbollen. Om delen van het hersenweefsel te verkrijgen, eerst de hersenen vast te stellen in een 15 milliliter buis gevuld met 4% paraformaldehyde in PBS op vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, spoel het hersenweefsel ten minste drie keer gedurende vijf minuten op vier graden Celsius in verse PBS per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt, verwijder de voorkant van elke hemisfeer met een schaar en tangen en plaats de monsters in gelabelde cryo-mallen voorkant naar beneden. Dompel elk weefsel onder in een optimaal snijtemperatuurmedium voordat de monsters in vloeibare stikstof worden ingevroren in een 10 millimeter plastic petrischaal voor min 80 graden Celsius opslag. Om xi reactivering te bepalen, dompel vijf tot zes micrometer hersenweefselsecties in antigeen retrieval oplossing gedurende vijf minuten op een 100 graden Celsius warmteblok.

Aan het einde van de incubatie was je de glijbanen met vier wasbeurten van vijf minuten op kamertemperatuur met verse PBS per wasbeurt voordat je de glijbanen onderdompelt in een blokkeeroplossing. Na 20 minuten op kamertemperatuur, was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in verse wasbuffer per wasbeurt. Bevlek de weefselmonsters met de juiste primaire antilichamen bij vier graden Celsius 's nachts.

Beeld de dia's op een fluorescentiemicroscoop die het contrast en de helderheid aanpast om kwantificering van het aantal GFP positieve cellen voor zowel drug als voertuig behandelde muishersenhelften toe te staan. Om de haalbaarheid van het niet-willekeurige X-chromosoom inactivatie muismodel voor inactieve X-chromosoomreactivatiestudies aan te tonen, werden de genotypen van vrouwelijke transgene muisembryonal fibroblast bevestigd door genotyping PCR en flow cytometrie. Zoals beoordeeld door PCR, werd de uitdrukking van het GFP-gelabelde methyleen CPG-bindingeiwit twee gen of MECP2 gereactiveerd door drugs, maar niet door de behandeling van voertuigen.

Niet-willekeurige X-chromosoom inactivatie muis model embryonale fibroblasten ook uitgedrukt nucleaire GFP na drug, maar niet voertuig behandeling waaruit blijkt dat de X-chromosoom inactivatie factor remmers reactiveren geïnactiveerd X chromosoom gekoppeld MECP2 in de muis embryonale fibroblasten. Medicamenteuze behandeling reactiveert geïnactiveerde X-chromosoom MECP2-GFP in ongeveer 30% van de cellen in drug geïnfundeerde hersenhelften, terwijl er geen reactivering wordt gedetecteerd in het voertuig geïnfundeerd hemisferen. Microtubuli-geassocieerde eiwit twee positieve neuronen zijn ook GFP positief in behandelde hemisfeer indicatief voor geïnactiveerde X chromosoom MECP2-GFP expressie.

Het medicijnregime zal afhankelijk zijn van het doel en de werkzaamheid van de kleine molecuulremmers, zodat de dosis en behandeling in vitro worden geoptimaliseerd voordat ze in vivo worden getest. De niet-willekeurige muis model kan worden gebruikt om verschillende geneesmiddelen te testen, hetzij individueel of in combinatie. In feite hebben wij en anderen verschillende druggable X-chromosoom inactivatiefactoren geïdentificeerd.