Name: Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Leer een colorimetrische assay om citraat synthase activiteit te meten in Drosophila melanogaster weefselhomogenaat. Deze methode kwantificeert intacte mitochondriële massa zonder mitochondriën te isoleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31401013 en 31471010), de Science and Technology Commission van Shanghai Municipality, Shanghai Pujiang programma (14PJ1405900), en Natural Science Foundation van Shanghai (19ZR1446400).

1. colorimetrische citraat synthase-Activiteitstest voor D. melanogaster16
<ol><li>Verzamel tien volwassen vliegen voor elk monster. Verzamel ten minste drie monsters voor elk genotype.</li>
	<li>Bereid 500 μL ijskoude extractiebuffer met 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA en 0,1% Triton X-100 in een test buis van 1,5 mL voor elk monster.</li>
	<li>Anesthetize volwassen vliegt met CO2 op een verdoving pad en isoleren van de gewenste weefsels. Om de volwassen vlieg thoraxes te isoleren, bijvoorbeeld, Fixeer je de vlieg thoraxes met een paar tang en Isoleer je vervolgens de vlieg buikjes door langs de rand van de thorax en de buik te snijden met behulp van een schaar. Verzamel de vlieg thoraxes voor de spier citraat synthase activity assay. Opmerking: Bepaal het verse gewicht van het weefsel bij deze stap als u het gebruikt om citraat synthase-activiteit te normaliseren.</li>
	<li>Breng 10 volwassen vliegthoraxes over naar 100 μL ijskoude extractiebuffer en homogeniseren met een stamper op ijs. Om de monsters ijskoud te houden, homogeniseren de monsters voor 5-10 s op ijs, dan hebben de monsters zitten op ijs voor 5 s, en herhaal totdat alle weefsels in de buis zijn volledig gehomogeniseerd. Opmerking: plak de buis, Controleer de homogenaten om ervoor te zorgen dat er geen stolsels in de homogenaten zijn en dat de weefsels in de buis volledig worden gehomogeniseerd. Alle monster behandelingen moeten op ijs worden uitgevoerd.</li>
	<li>Neem 10 μL van elk gehomogeniseerd monster in een nieuwe buis voor meting van de eiwit inhoud. Houd de monsters voor de eiwit meting op ijs. Opmerking: de proteïne monsters kunnen worden bevroren en opgeslagen bij-80 °C voor latere analyse. De eiwit concentraties dienen als een interne parameter voor het normaliseren van citraatsynthase-activiteiten.</li>
	<li>Voeg 400 μL ijskoude extractiebuffer toe aan elk resterend monster om een totaal volume van 500 μL te maken. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren ten minste 5x, waardoor de ballonvorming wordt vermeden. Voeg voor elke reactie 1 μL verdund cellysaat toe aan 150 μL van de vers bereide reactie oplossing (20 mM tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetyl CoA, 1 mM oxaloazijnzuur). Meng grondig en onmiddellijk door het zachtjes pipetteren, het vermijden van Bubble vorming. Meet de extinctie bij 412 nm elke 10-30 s gedurende 4 minuten bij 25 °C met behulp van een plaat lezer die bij een minimum interval van 10 sec. de extinctie kan meten bij 412 nm. Opmerking: Wijzig de punt voordat u een ander reagens Pipetteer en Vermijd het vormen van bubbels in de putjes. Onvolledige menging van de reagentia kan variaties in de metingen veroorzaken. De Citraatsynthase-activiteit test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur onmiddellijk nadat de monsters zijn verzameld, omdat deze test wordt gebruikt om de intacte mitochondriale massa te kwantificeren. De reactiebuffer moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid en mag niet worden opgeslagen.</li>
	<li>Plot gegevens als optische dichtheid (OD) extinctie (ABS) (Y-as) versus tijd (in minuten) (X-as). Bereken vervolgens de helling voor het lineaire gedeelte van de curve, waarbij de reactiesnelheid <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq1.jpg"> Verdeel de waarde door de eiwitconcentratie van het monster om de citraat synthase-activiteit te normaliseren. De citraat synthase-activiteit wordt berekend als <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq2.jpg"> Opmerking: de eiwitconcentratie van het monster kan worden gemeten met een eiwit concentratiekit.</li>
</ol>

<ol><li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells%3A+The+Discerning+Killers%21%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!</a> Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).</li>
<li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals%3A+Untangling+the+knot%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li>
<li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction%2C+oxidative+stress%2C+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death & Disease. 5, e984(2014).</li>
<li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li>
<li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate+synthase%3A+structure%2C+control%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li>
<li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
<li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel%2FdPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).</li>
<li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spargel%2FdPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li>
<li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster%3A+oxidative+stress%2C+mitochondrial+activity%2C+and+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Metabole studies met Drosophila als model moeten rekening houden met de genetische achtergrond, voeding en voorraad onderhoud van de vliegen18. Om de effecten van verschillende genetische achtergronden op de meting van citraat synthase activiteit te voorkomen, moeten verschillende stammen van Drosophila gedurende 10 generaties worden teruggestoken naar de controlestam. De genetische achtergrond van alle Drosophila stammen gebruikt in onze experimenten is w1118</...

Mitochondriën zijn het best bekend als de Power-producerende organellen in de meeste eukaryotische organismen, die de energie valuta produceren, ATP, door middel van de tricarboxylzuur cyclus (dat wil zeggen, Krebs cyclus) en oxidatieve fosforylering. Mitochondriën zijn ook gevonden om te spelen belangrijke rollen in een heleboel andere fysiologische processen, zoals regulering van apoptosis1, CA2 + homeostase2,3, reactieve oxidatie soorten (Ros) generatie4, en endoplasmatisch reticulum (er)-stress response5. Mitochondriale dysfunctie kan elk orgaan in het lichaam op elke leeftijd beïnvloeden en is een primaire oorzaak van metabole, veroudering-gerelateerde6, en neurodegeneratieve ziekten7. Intact mitochondriën zijn mechanistisch gerelateerd aan mitochondriale functie. Dus, juiste kwantificering van intacte mitochondriale massa is zeer belangrijk voor de evaluatie van de mitochondriale functie8. Citraat synthase, een snelheidsbegrenzer enzym in de eerste stap van de tricarboxylzuurcyclus9, is gelokaliseerd in de mitochondriale matrix binnen eukaryotische cellen, en kan dus worden gebruikt als een kwantitatieve marker voor de aanwezigheid van intacte mitochondriale massa9,10. Citraat synthase activiteit kan ook worden gebruikt als een normalisatie factor voor intacte mitochondriale eiwitten11,12.
De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van de mitochondriale functie, omdat veel moleculen en trajecten die cruciale rollen in mitochondriën spelen, evolutionair worden bewaard van Drosophila naar mensen13,14,15. Hier presenteren we een protocol voor een snelle en eenvoudige methode voor het meten van citraat synthase activiteit door een colorimetrische assay in Drosophila weefsel homogeniteert16 in een 96 goed plaat formaat. In de Citraatsynthase-activiteit test de citraat synthase in het weefsel van Drosophila een katalyseert de reactie van Oxaloacetaat met acetyl coenzym A (acetyl CoA) om de citraat COA-sh en H+te vormen. CoA-SH reageert vervolgens met 5,5 '-dithiobis-(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) voor het genereren van een gekleurd product, 2-Nitro-5-thiobenzoaat (TNB), die gemakkelijk spectrofotometrisch kan worden gemeten bij 412 nm. Citraatsynthase-activiteit kan worden weerspiegeld door de snelheid van de kleur productie.

<table><tbody><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900483</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl-CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>Pellet pestle</td><td>Sangon</td><td>F619072</td><td></td></tr><tr><td>Pellet pestle motor</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y10</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BioTek</td><td>Eon</td><td></td></tr><tr><td>Protein BCA Assay kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>WPI</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon</td><td>A110694-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in drosophila melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondriën spelen de meest prominente rollen in cellulaire metabolisme door het produceren van ATP door middel van oxidatieve fosforylering en regulering van een verscheidenheid van fysiologische processen. Mitochondriale dysfunctie is een primaire oorzaak van een aantal metabole en neurodegeneratieve ziekten. Intact mitochondriën zijn van cruciaal belang voor hun goede werking. De enzym citraat synthase is gelokaliseerd in de mitochondriale matrix en kan dus worden gebruikt als een kwantitatieve enzym marker van intacte mitochondriale massa. Gezien het feit dat veel moleculen en trajecten die belangrijke functies in de mitochondriën hebben zeer worden bewaard tussen mensen en Drosophila, en dat een scala aan krachtige genetische hulpmiddelen zijn beschikbaar in Drosophila, Drosophila fungeert als een goed modelsysteem voor het bestuderen van de mitochondriale functie. Hier presenteren we een protocol voor snelle en eenvoudige meting van citraatsynthase-activiteit in weefsel homogenaat van volwassen vliegen zonder de mitochondriën te isoleren. Dit protocol is ook geschikt voor het meten van citraat synthase-activiteit in larven, gekweekte cellen en zoogdier weefsels.

Figuur 1 geeft een voorbeeld van de kinetische curven voor de OD-extinctie bij 412 nm na verloop van tijd verkregen met behulp van de Citraatsynthase-activiteit colorimetrische assay om het Drosophila thorax-weefsel te meten homogeneert van verschillende genotypes. Het is bekend dat PGC-1α een Master regulator is van de mitochondriale biogenese. PGC-1α is functioneel bewaard tussen Drosophila en mensen. Drosophila RNF34 (dRNF34) is ...

We presenteren een protocol voor een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit voor de kwantificering van intacte mitochondriale massa in Drosophila weefsel homogenates.

Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Drosophila dient als goed modelsysteem voor het bestuderen van mitochondriale functie. Hier presenteren we een protocol voor het meten van citraatsyndering in weefselhomogenate van volwassen vliegen. Dit protocol vereist geen isolatie van mitochondriën.Het is snel en eenvoudig en het is geschikt voor het meten van citraatsyntheseactiviteit in larven, gekweekte cellen en weefsels van zoogdieren. Begin met het verzamelen van volwassen vliegen voor elk monster, ervoor te zorgen dat ten minste drievoud monsters te verzamelen voor elk genotype. Bereid 500 microliter ijskoude extractiebuffer met 20 millimolar HEPES, een millimolar EDTA en 0,1% triton X-100 in een reageerbuis van 1,5 milliliter voor elk monster.Verdoven de volwassen vliegen met kooldioxide op een anesthesie pad. Om de thoraxen te isoleren, bevestig ze met een paar tangen en isoleer de vliegbuiken door langs de rand van de thorax en buik te snijden met een schaar. Verzamel de vlieg thoraxes voor de citrate synthase activiteit test.Breng 10 volwassen vliegtracaxen onmiddellijk over naar 100 microliters ijskoude extractiebuffer en homogeniseer ze met een stamper op ijs. Houd de monsters koud door homogeniseren voor vijf tot 10 seconden op ijs, laat ze zitten op ijs voor vijf seconden, dan herhalen totdat alle weefsels volledig zijn gehomogeniseerd. Aliquot 10 microliters van elk gehomogeniseerd monster in een nieuwe buis voor eiwitgehalte meting, waardoor deze buizen op ijs ook.Voeg 400 microliter ijskoude extractiebuffer toe aan elk overgebleven monster voor een totaal volume van 500 microliters en pipet op en neer zachtjes om te mengen. Voeg voor elke reactie één microliter verdund cellysaat toe aan 150 microliter van de vers bereide reactieoplossing. Meng grondig door voorzichtig pipetten, zorg ervoor dat bubble vorming te voorkomen, gebruik dan een plaatlezer om de absorptie op 412 nanometer elke 10 tot 30 seconden te meten gedurende vier minuten bij 25 graden Celsius.Plot de gegevens als absorptie na verloop van tijd en bereken vervolgens de helling voor het lineaire gedeelte van de curve. Ten slotte, verdeel de reactiesnelheid of helling door de monster eiwitconcentratie om de citraat synthase activiteit te normaliseren. Het was verondersteld dat knockdown van dRNF34 in Drosophila spier zou mitochondriale citraat activiteit te verhogen, terwijl knockdown van dPGC-1 zou deze toename te keren.Voor elke test werd een eerste lineaire enzymatische snelheid vastgesteld;de hellingen van de trendlijnen vertegenwoordigen de maximale reactiepercentages die gelijkwaardig zijn aan de maximale citraatsynaseactiviteiten van de verschillende genotypes. De maximale citraat synthase activiteiten werden berekend op basis van de kinetische rondingen en genormaliseerd door eiwitconcentratie. De resultaten toonden aan dat de synthase activiteit van vlieg thoraxes inderdaad toegenomen met spier-specifieke dRNF34 knockdown en de stijging werd omgekeerd door spier-specifieke dPGC-1 knockdown.Bij het homogeniseren van het monster is het belangrijk om de buis te kantelen en het homogenaat te controleren om ervoor te zorgen dat er geen stolsels zijn en dat de weefsels in de buis volledig gehomogeniseerd zijn. Na het verzamelen van monsters moeten alle monsterbehandelingen op ijs worden uitgevoerd. De citraat synthase activiteit test wordt gebruikt om intacte mitochondriale massa te kwantificeren.Een goede kwantificering van intacte mitochondriale massa is zeer belangrijk voor de evaluatie van de mitochondriale functie.

a-colorimetric-assay-citrate-synthase-activity-drosophila

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Drosophila melanogaster is een genetisch en gedragsmatig soepel model systeem dat is gebruikt om de moleculaire en cellulaire basis van een groot aantal belangrijke biologische processen meer dan een eeuw een begrip. Drosophila goed is benut om inzicht te krijgen in de genetische basis van vlieg gedrag.

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

This video describes a colorimetric assay to measure the mitochondrial citrate synthase activity assay present in the tissue homogenate of Drosophila.

Citrate Synthase Activity Assay: A Colorimetric Assay to Measure Mitochondrial Citrate Synthase Activity in Drosophila Tissue Homogenate

Introductie van kleine moleculen de ontwikkeling Drosophila embryo grote mogelijkheden voor het karakteriseren van biologische activiteit van nieuwe verbindingen, geneesmiddelen en toxinen en het tasten fundamentele ontwikkelingspaden. Werkwijzen hierin beschreven schetsen stappen natuurlijke barrières deze benadering overwonnen, het uitbreiden van de bruikbaarheid van de Drosophila embryo model.

Een methode van permeabilisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s voor Testen van Small Molecule Activiteit

Dit artikel beschrijft een methode voor de meting van brandstofoxidatie in Drosophila melanogaster waarbij sporenhoeveelheden van specifieke radioactief gelabelde metabole substraten aan vliegen worden gevoerd. Het uitgeademde radioactief gelabelde CO2 dat wordt geproduceerd uit brandstofoxidatie wordt verzameld en gemeten.

Meting van de productie van koolstofdioxide uit Radioactief gemerkt Substrates in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

De CApillary FEeder (CAFE) test is een eenvoudige, budgetvriendelijke en zeer betrouwbare methode voor het onderzoeken van mechanismen die ten grondslag liggen aan voedselinname. Gebruikt met het zeer veelzijdige genetische modelorganisme Drosophila melanogaster, biedt het een krachtig middel om nieuwe inzichten te verkrijgen in de regulerende mechanismen van voedselinname.

De capillaire Feeder test meet voedselinname bij<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Cellulaire ion vervoer kan vaak worden geëvalueerd door het toezicht van de intracellulaire pH (pHik). Genetisch een Encoded pH-indicatoren (GEpHIs) optische kwantificering van intracellulaire pH in onbeschadigde cellen. Dit protocol gegevens de kwantificering van de intracellulaire pH via cellulaire ex vivo wonen-imaging van Malpighian tubuli van Drosophila melanogaster met pHerry, een pseudo-ratiometric genetisch gecodeerd pH-indicator.

Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator

Het protocol beschrijft een eenvoudige test om te identificeren van Drosophila melanogaster larven die hypoxie onder normale atmosferische zuurstofniveaus ondervindt. Dit protocol staat hypoxische larven te onderscheiden van andere mutanten die aantonen dat overlappende fenotypen zoals traagheid of trage groei.

Een gravende/Tunneling Assay voor het opsporen van hypoxie in Drosophila melanogaster larven

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster.  Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.

Meting van O2-verbruik in Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie

Leer een colorimetrische assay om citraat synthase activiteit te meten in Drosophila melanogaster weefselhomogenaat. Deze methode kwantificeert intacte mitochondriële massa zonder mitochondriën te isoleren.

Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen