Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese

Deze methode zal helpen begrijpen en uitvoeren lab technieken die nodig zijn om de activiteit van twee microRNA in longkankercellen in vitro te identificeren. Longkanker is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen. Hier presenteren we technieken die zich uitstrekken van basislabmethoden tot complexere protocollen, zoals genexpressieanalyse en antilichaameiwitmicroRNA, specifiek gebruikt voor het identificeren van het effect van de acties van microRNA.

De volgende methoden zullen ons helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over het effect van twee microRNAs, microRNA 143 en microRNA 506, op het reguleren van de celcyclus in longkankercellen. We presenteren verschillende laboratoriumtechnieken, zoals celtransfectie, RNA-extractie, kwantitatieve real-time PCR- en microRNA-analyse. We hopen dat onze presentatie zal bijdragen aan het succesvol afronden van deze analyses.

Plaats eerst de gekweekte cellen in een geschikte kolf die voldoende is voor RNA- en eiwitextractie, om genexpressie uit te voeren met behulp van qPCR- of micro-arrayanalyse. Dan incubeer 's nachts met media aangevuld met 10 procent FBS en 1 procent penicilline streptomycine. Bereid het microRNA-monster de volgende dag voor op transfectie door microRNA 143 en microRNA 506 in media te verdunnen met een concentratie van elk 100 nanomolar.

Haal de kolf uit de couveuse en verwijder de media. Was met 1x PBS. Alle onbehandelde besturingselementen bevatten alleen onvolledige media met cellen.

Incubeer de cellen met transfectiemedia gedurende zes uur in een couveuse. Na zes uur, verwijder de media en vervangen door vier milliliter verse, complete media. Oogst de cellen na 24 uur en 48 uur door trypsinisatie.

Was vervolgens twee keer met 1x PBS in elke buis en verwijder supernatant. Om RNA-extractie op een later tijdstip uit te voeren, bevriest u de cellen bij min 80 graden Celsius. RNA extractie werd uitgevoerd met behulp van een RNA kit, volgens de instructies van de fabrikant.

Verwijder eerst de buizen van min 80 graden Celsius en laat ontdooien. Voeg 300 microliters lysebuffer en pipet op en neer toe om het celmembraan te breken. Voeg gelijk volume van 100 procent ultra-pure ethanol toe.

Meng vervolgens goed en plaats in gescheiden kolom. Centrifugeren en verwijder de flow-through. Voeg 400 microliter was- en bufferbuffers toe en centrifuge om de buffer te verwijderen.

Voeg 5 microliter DNAse 1 met 75 microliters VNA spijsvertering buffer in elk monster, en incubeer gedurende 15 minuten. Was vervolgens het monster met 400 microliter RNA prep buffer. Was vervolgens twee keer met RNA wasbuffer.

Voeg nu nuclease-vrij water toe aan de kolom, centrifuge en verzamel vervolgens het RNA. Meet de RNA-concentratie. In deze fase kunnen twee microgram RNA-monster worden verzonden voor de RNA-sequencing.

Bereid de cDNA volgens het protocol beschreven in de tekst sectie, met behulp van thermocycler. Bereid voorwaartse en omgekeerde primeroplossingen voor met DNAse RNAse-vrij water tot een concentratie van 10 micromolar. Bereid een mastermix voor voor elk gen dat moet worden gedetecteerd op basis van het aantal monsters.

Voor elk cDNA-monster is de reactiehoeveelheid volgens de tabel beschreven in de tekst. Plaats elk monster in hun respectievelijke putten. Voor qPCR is het altijd goed om een Excel-document met 96 putplaatindeling voor te bereiden, om de monsters bij te houden.

Voor elk monster en geanalyseerd gen, voer hun reactie in drievouden, of op zijn minst duplicaten. Sluit de kunststof plaat af met transparante, optisch heldere plastic sealer. Vermijd het aanraken van de dunne, plastic laag met de vingers, omdat dit kan leiden tot vals signaal.

Draai snel de plaat om alle reagentia te mengen tot de bodem van hun putten. Voer vervolgens de monsterplaat uit met behulp van een kwantitatieve, real-time PCR-machine. Download de CT-waarden die door de qPCR-machine worden gegenereerd en analyseer voor relatieve genexpressie.

Transfecteer de cellen zoals beschreven in het eerdere gedeelte van deze video. Oogst cellen van elk monster in aparte, 15 milliliter steriele buizen voor trypsinisatie. Vervolgens was de cellen twee keer met 1x PBS, door centrifugatie op 751G gedurende vijf minuten, en verwijder vervolgens de supernatant.

Het palet opnieuw ophangen en breken door 200 microliter ijskoude 1x PBS toe te voegen via een pipet. Voeg twee milliliter van 70 procent ijskoude ethanol, drop-wise aan de buis, terwijl vortexing de buis zachtjes om de cellen vast te stellen. Incubeerbuizen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en leg ze in vier graden Celsius gedurende een uur.

Haal de buizen van vier graden Celsius en centrifuge. Voeg 2ml ijskoude PBS en vortex toe en verwijder vervolgens de supernatant door centrifugatie. Voeg 500 microliter 1x PBS toe met propidiumjodide en ribonuclease A met respectievelijk concentratie 50 en 200 microgram per milliliter in elk monster en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Breng monsters in de juiste buizen, bescherming tegen licht, en lopen op stroom cytometer. Dit experiment is het identificeren van alle cel cyclus route eiwitten expressie veranderd door de microRNA behandeling. Verzamel eiwitmonsters volgens de procedure beschreven in de transfectie sectie, en kwantificeren met BCA test.

Verwijder de dia's van min vier graden Celsius een uur voor het experiment om op kamertemperatuur te brengen en vocht te verwijderen. Neem 70 microgram eiwitmonsters en bereid voorbeelddia's volgens de instructies van de fabrikant, die ook stap voor stap in de tekstsectie wordt beschreven. Hier op te merken, een goede wassen van glijbanen met ultra-zuivere gedeïniseerde water is een andere belangrijke stap, omdat dit zal helpen om de achtergrond van de dia's te verminderen.

Bovendien is het in dit experiment zeer kritisch om de voorbeelddia's niet op te drogen tot de laatste stap. Scan ten slotte de dia met behulp van een micro-arraymachine en analyseer de gegevens. De qPCR-analyse van de met microRNA behandelde monsters vond plaats om de genexpressie van CDK1, CDK4 en CDK6 te bepalen.

Deze genen reguleren de celcyclus van normale en kankercellen, en zijn gericht als een middel voor het remmen van tumorprogressie. De gegevens toonden het downregulatory effect van deze genen aan als gevolg van de behandeling met microRNA 143 en 506. Celcyclusdistributiegegevens van stroomcytometrie toonden een bevolkingstoename in de G0- en G1-fase en een bevolkingsdaling in de S-fase als gevolg van het effect van combinatorische behandeling van microRNA 143 en 506.

De specifieke micro-array analyse van de celcyclus ontdekte veranderingen in de eiwitexpressie van ongeveer 60 genen. De vertegenwoordigde warmtekaart wees op downregulatie op het eiwitniveau van meerdere genen die nodig zijn voor de progressie van de celcyclus en proliferatie, zoals CDK2, Helen 1 en 3, RE2F1. In tegenstelling, eiwitten vaak erkend door hun gekweekte remmende werking werden upregulated.

Hoewel de resultaten semi-kwantitatief zijn en verdere analyse vereist is, biedt de micro-arrayanalyse een snel overzicht van de activiteit van het traject. Wij geloven, na het bekijken van deze video, zult u in staat zijn om fundamentele, evenals complexe, lab experimenten die u zullen helpen bij de identificatie van microRNA activiteit in cellen uit te voeren.