Oprichting en karakterisering van drie Afatinib-resistente Long adenocarcinoom PC-9 cellijnen ontwikkeld met toenemende doses van Afatinib

De studie van nieuwe verworven resistentiemechanismen zal bijdragen aan de ontwikkeling van effectievere en veiligere therapeutische strategieën bij patiënten met kankermiddelresistente en resectable kanker. Helaas worden gevallen waarin resistentie tegen geneesmiddelen zich niet ontwikkeld, over het algemeen niet gemeld. Deze stapsgewijze dosisescalatiemethode wordt beschouwd als de meest betrouwbare techniek voor het verkrijgen van verworven resistentiecellen.

Om de juiste afatinib-weerstandsconcentratie te bepalen, kweekt pc-9 cellen in groeimedium in een met cellen gekweekte schaal van 10 centimeter behandelde schotel bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Resuspend de PC-9 cellen op een vier-keer-10-to-the-four cellen per milliliter van de groei medium concentratie, en plaats de cellen op 50 microliter van cel suspensie per put in een 96-well microplate. Behandel de cellen na een nachtelijke incubatie in de incubator van de celkweek de cellen met 50 microliters afatinib-oplossing per put, bij zes replica's van de aangegeven concentraties en na een incubatie van 96 uur in de broedcultuurbrocubator, voeg 15 microliters MTT-kleurstof toe aan elke put.

Na vier uur in de celcultuur incubator, voeg 100 microliter van oplosmiddel / stop oplossing aan elke put, en de plaat terug te keren naar de incubator 's nachts. Meet de volgende ochtend de optische dichtheid op 570 nanometer op een microplatelezer. Voor continue blootstelling aan afatinib, cultuur PC-9 cellen in P-100 schotels met 10 milliliter groeimedium totdat de cellen subconfluency bereiken.

Breng de subconfluent culturen in drie nieuwe P-100 gerechten van negen milliliter groeimedium per initiële cultuur schotel, en de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator. De volgende ochtend voegt u 0,1 nanomolar, of 1/10 van de half-maximale remmende concentratie van afatinib, toe aan elke set van drie kweekgerechten. Wanneer de met afatinib behandelde cellen subconfluent worden, gebruik dan een pipet van één milliliter om de culturen grondig te mengen en één milliliter cellen van elk gerecht over te brengen naar negen milliliter vers groeimedium in nieuwe P-100-gerechten.

Voeg 10% tot 20% hogere concentraties van afatinib toe aan de nieuwe culturen, waardoor de afatinibconcentratie wordt verhoogd door stapsgewijze dosisescalatie telkens wanneer de culturen subconfluency bereiken over een periode van 10 tot 12 maanden. Wanneer een afatinibconcentratie van één micromolar wordt bereikt, voert u de MTT-test uit, zoals aangetoond dat de cellen afatinib-resistentie hebben ontwikkeld. Om de groeicurve voor de cellijnen te bepalen, cultuur ouderlijke PC-9 en de drie afatinib-resistente cellijnen in groeimedium in de celcultuur incubator voor 24 uur.

Resuspend de cellen van elke cultuur op een vijf-keer-10-tot-de-derde cellen per milliliter van de groei medium concentratie, en stoel 12 100-microliter repliceert van elke celpopulatie per goed in een 96-well microplaat. Voer vervolgens de MTT-test uit op dag nul, één, twee, drie, vijf en zeven van de cultuur, zoals aangetoond, en plot de resultaten met behulp van een geschikt statistisch analysesoftwareprogramma. Om veranderingen in epidermale groeifactorreceptor, of EGFR genomic DNA-expressie, te identificeren door omgekeerde transcriptase polymerase ketenanalyse, isoleren genomisch DNA van de celcultuur van belang met behulp van een DNA-zuivering kit volgens de instructies van de fabrikant.

Meet de concentratie van 25 nanogram-microliter concentraties van het geïsoleerde genomische DNA op een spectrofotometer. Versterk vervolgens 50 nanogram genomisch DNA met behulp van een SYBR groene mastermix en analyseer de resultaten met behulp van een op fluorescentie gebaseerd reverse transcriptase polymerase chain reaction detection system. Om veranderingen in EGFR genomic DNA-expressie te identificeren door sequencing, verbouw het genomische DNA met behulp van specifieke primers voor EGFR exons 19 tot 21.

Zuiver vervolgens de versterkte PCR-producten met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant en volg de amplicons. Om veranderingen in epidermale groeifactor receptor eiwitexpressie door westerse vlek analyse te identificeren, behandel de cellen met afatinib gedurende 24 uur. Na 24 uur, was de cel culturen twee keer met vijf milliliter ijskoude PBS per cultuur per wasbeurt.

Lyse de cellen in radio-immuunsypation assay buffer, aangevuld met 1%proteaseremmer cocktail en fosforremmers cocktail twee en drie gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel aan het einde van de incubatie de lysaten door centrifugatie. Gebruik de bicinchoninic zuurtest om de eiwitconcentratie van de lysaatmonsters te bepalen.

Pas de eiwitmonsters aan op 0,5, of één microgram per microliterconcentraties, in 4-X monsterbuffer, en kook de monsters vijf minuten op 96 graden Celsius. Voor westerse vlek analyse van de monsters, monteren ethanol gereinigde glasplaten en afstandhouders, en laad de mal met een 8%polyacrylamide gel met de juiste experimentele supplementen. Terwijl de gel polymeriseert, voeg stapelen gel oplossing om een geschikte mal, voeg de kam, en laat de stapelen gel te polymeriseren voor 20 tot 30 minuten op kamertemperatuur.

Wanneer beide gels gepolymeriseerd zijn, plaatst u ze in het elektroforeseapparaat en vult u de tank met een lopende buffer. Laad vervolgens een volume van 20 tot 30 microliter van elk eiwitmonster in elke put en voer de gel uit op 180 volt. Stop de elektroforese na ongeveer 60 minuten, zodra de kleurstof voorkant stroomt uit de gel, en was de gel met tris-gebufferde zoutoplossing, aangevuld met Tween, gedurende een tot twee minuten.

Breng de eiwitten op een polyvinylidenenfluoridemembraan door semi-droge blotting gedurende een en 1/2 uur bij een constante stroom van 300 milliampère. Blokkeer het membraan met 5%vetvrije droge melk verdund met tris-gebufferde zoutoplossing plus Tween-oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur. Vervolgens sonde het membraan met de juiste antilichamen van belang op vier graden Celsius 's nachts.

De volgende ochtend was je de membranen met drie wasbeurten van 10 minuten verse tris-gebufferde zoutoplossing per wasbeurt voordat je het membraan één tot één en 1/2 uur bij kamertemperatuur blootstelt aan het juiste secundaire antilichaam. Was vervolgens het membraan vijf keer met verse tris-gebufferde zoutoplossing per wasbeurt en stel het membraan bloot aan verbeterde chemiluminescentieoplossing voor signaalvisualisatie met behulp van films. Hier wordt de waargenomen afname in de celproliferatie van ouderlijke PC-9-cellen in reactie op toenemende concentraties van afatinib geïllustreerd, wat bevestigt dat PC-9-cellen gevoelig zijn voor blootstelling aan afatinib.

Geen van de drie afatinib-resistente cellijnen toont echter een onderdrukking van celproliferatie onder blootstelling aan afatinib aan. Afatinib-resistente cellijnen vertonen aanzienlijk tragere groeicurven dan ouderlijke PC-9-cellen. Afatinib-resistente cellen drukken aanzienlijk hogere niveaus van EGFR genomic DNA en EGFR eiwitexpressie uit dan ouderlijke PC-9 cellen.

EGFR-sequencing toont aan dat PC-9-cellen 15 base pair-verwijderingen vertonen in EGFR exon 19 en wild type EGFR in exon 20. Afatinib-resistente een en twee cellijncellen vertonen echter een versterking van het wilde type EGFR exon 19. Afatinib-resistente cellijn drie cellen bevatten dezelfde 15 base pair deleties in EGFR exon 19 als in PC-9 cellen, maar een puntmutatie in T790M wordt waargenomen in EGFR exon 20.

Celgroei kan vrij traag worden wanneer de remmerconcentratie dicht bij IC-50-waarde ligt. Bespreek geen cultuur, omdat de cel zich geleidelijk zal blijven vermenigvuldigen. Deze strategieën werden ontwikkeld om de omstandigheden na te bootsen waaronder kankerpatiënten klinisch relevante resistentie ontwikkelen om verworven resistentiemechanismen te beoordelen en om veilige en effectieve therapeutische strategieën te ontwikkelen.