Name: Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Leer een nieuwe methode voor het modelleren van borstkanker via intraductale injectie van Cre-expresserend adenovirus in muizen. Deze techniek maakt celtype-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen mogelijk zonder uitgebreide fokprogramma's.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) Grant R01 CA222560 en door Department of Defense baanbrekende Award W81XWH-18-1-0037.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Brigham en het vrouwen ziekenhuis.
1. opwekking en onderhoud van floxed muizen
<ol><li>Borstkanker-relevante floxed voorwaardelijke Knockout verkrijgen (bijv. Trp53tm1Brn [aangeduid als Trp53L/l], Brca1tm1Aash [Brca1l/l]) of voorwaardelijke muis lijnen (bijv. Gt (Rosa) 26SorTm1 (PIK3CA * H1047R) Egan) uit het Jackson Laboratory (JAX) of de NCI Mouse-modellen van de repository van Human Cancer Consortium (MMHCC). Ter vergemakkelijking van het achtervolgen van MECs die CRE-gemedieerde recombinatie ondergaan, kan ook een voorwaardelijke CRE-reporter lijn worden verkregen van JAX (bijv. gt (Rosa) 26SorTM1 (Eyfp) cos [genoemd R26Y]).</li>
	<li>RAS Trp53L/l homozygoot muizen met R26Y homozygoot reporter muizen of met homozygoot muizen die de R26Y reporter allelen dragen en eventuele extra floxed voorwaardelijke knock-out of knock-in allelen voor verschillende Muismodellen, om heterozygoot F1 mannelijke en vrouwelijke nakomelingen te verkrijgen.</li>
	<li>Intercross heterozygoot F1 mannelijke en vrouwelijke muizen om F2 samengestelde vrouwelijke muizen te verkrijgen die homozygoot zijn voor elk allel (als experimentele muizen), evenals R26Y-alleen homozygoot vrouwtjes (als controle muizen). Genotype F2-muizen op basis van de hieronder vermelde PCR-primers en-fiets condities, door twee standaard PCR-reacties van 20 μL (met gebruik van Taq 5X Master Mix) in twee verschillende PCR-buizen, één met de R26Y primers en de andere met de Trp53L primers. Gebruik volwassen muizen (meestal ongeveer 2 – 4 maanden oud) voor alle kweek.<ol>
<li>Voer voor R26YPCR bij 94 °c gedurende 3 minuten, daarna bij 94 °c gedurende 30 sec., 60 °c gedurende 30 sec. en 72 °c gedurende 1 minuut voor 35 cycli, gevolgd door 72 °c gedurende 3 minuten en bij 14 °c. Gebruik primers (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG. Opmerking: een enkele PCR-band van 250 BP duidt op een R26Y homozygote, een enkele PCR-band van 500 BP duidt op een wild type (WT) en twee PCR-bands (R26Y: 250 bp, WT: 500 BP) duiden op een R26Y heterozygote (Figuur 1a). Voer voor Trp53LPCR bij 94 °c gedurende 3 minuten, daarna bij 94 °c gedurende 30 sec., 60 °c gedurende 30 sec. en 72 °c gedurende 1 minuut voor 35 cycli, gevolgd door 72 °c gedurende 3 minuten en bij 14 °c. Gebruik primers (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (II) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC. Opmerking: een enkele PCR-band van 370 BP duidt op een Trp53L/l homozygote, een enkele PCR-band van 288 bp duidt op een Trp53+/+ WT, en twee PCR-banden (WT: 288 BP, Trp53L: 370 BP) duiden op een Trp53L /+ heterozygote (Figuur 1b).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preoperatieve voorbereiding
<ol><li>Autoclaaf alle chirurgische hulpmiddelen 1 dag voor de operatie.</li>
	<li>Bereid 0,1% broomfenolblauw in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar het op 4 °c. Verdun de AD-CRE die zal worden gebruikt voor de intraductale injectie in DMEM medium met 0,01 M CACL2 en broomfenolblauw in een verhouding van 1:10 (d.w.z. het injectie mengsel). Opmerking: de AD-CRE hier gebruikt werd verkregen van de Universiteit van Iowa virale vector kern, met een voorraad virale titer van ~ 1010– 1011 Pfu/ml.</li>
	<li>Anesthetiseer de vrouwelijke muis (F2-generatie zoals beschreven in stap 1,2, leeftijd variërend van 3 – 4 weken leeftijd tot volwassen) met behulp van een Isofluraan kamer en breng oogzalf. Tijdens de procedure, anesthetiseer de muis continu door ervoor te zorgen dat het inhaleert 1% – 2.5% Isofluraan in zuurstof. Controleer de diepte van de anesthesie ten minste elke 15 min door het uitvoeren van een teen knijpen. Bewaak de muis zorgvuldig voor elke verandering in de ademhalingsfrequentie, waarbij het niveau van Isofluraan dienovereenkomstig wordt aangepast, indien nodig.</li>
	<li>Injecteer Meloxicam als analgesie subcutaan in een dosis van 5 mg/kg, voorafgaand aan de chirurgische ingreep.</li>
	<li>Bloot de tepel operatie site door het toepassen van verschillende druppels ontharing crème; Verwijder overmatige room en losse haren met zachte papieren handdoeken. Opmerking: Voer deze stap uit in een gebied dat losstaat van de plaats waar de operatie moet worden uitgevoerd. Scheren wordt niet aanbevolen om beschadiging van de tepels te voorkomen. Wees voorzichtig met het verwijderen van chemische ontharings agent op een tijdige manier. Als u de agent te lang laat staan, kan dit leiden tot chemische verbranding op de huid</li>
	<li>Desinfecteer de operatieplaats met iodophors eerst, gevolgd door 70% alcohol, en eindig met een definitieve toepassing van scrubiodophors. Doe dit in een cirkelvormige beweging vanuit het midden van het werkgebied naar de omtrek met behulp van een gaas spons of met katoen getipt applicator. Herhaal de cyclus 3x – 4x.</li>
</ol>3. intraductale injectie
<ol><li>Gebruik aseptische technieken gedurende de chirurgische ingreep.</li>
	<li>Maak een incisieplaats op de huid met een lengte van ~ 1 cm tussen de twee vierde inguinale MGs (Figuur 2). Scheid voorzichtig de huid flap (met de MG) van het pariëtale peritoneum om de borst boom te visualiseren.</li>
	<li>Houd de tepel voorzichtig vast met de Tang van de horlogemaker en verwijder de uitwendige tepel zonder de huid in de buurt te snijden, met behulp van een micro-dissectie schaar.</li>
	<li>Laad ~ 3 – 5 μL AD-CRE injectie mengsel in een 25 μL Hamilton spuit met een 33 G metalen naaf naald aangebracht. Bereken het volume van het injectie mengsel in de spuit op basis van de blauwe kleurstof die in het mengsel is opgenomen. Opmerking: gebruik een kleiner volume (bijv. 3 μL) bij het injecteren in Mg's van 3 – 4 weken oude vrouwtjes en een groter volume (bijv. 10 μL) bij het injecteren in MGs van zogende vrouwtjes.</li>
	<li>Houd voorzichtig de rand van de huid flap met een fijn gebogen pincet en Injecteer het mengsel van AD-CRE injectie langzaam in de tepel, ondertussen het monitoren van de verspreiding van blauwe kleurstof in de borst ductaal boom. Houd de injectiesnelheid zo laag mogelijk om beschadiging van het ductale lumen te voorkomen. Opmerking: geïnjecteerde vloeistof (zoals geïllustreerd door de meegeleverde Broom fenol blauwe kleurstof) die zich verspreidt over de gehele ductale boom zonder in het stromale compartiment te lekken, duidt op een geslaagde intraductale injectie.</li>
	<li>Trek de naald voorzichtig uit de tepel om lekkage van de geïnjecteerde vloeistof te voorkomen.</li>
	<li>Onderzoek de distale zijde (d.w.z., weg van de tepel) van de MG of het omringende gebied van de geïnjecteerde tepel. Merk op dat zwelling blauwe kleurstof (dat wil zeggen, kleurstof verspreiden in de nabijgelegen stroma) duidt op een injectie van borstkanker vet pad in plaats van een succesvolle intraductale injectie.</li>
	<li>Sluit de chirurgische wonden (vanaf stap 3,2) in de huid met wond klemmen.</li>
</ol>4. postoperatieve zorg
<ol><li>Verwijder de muis van de anesthesie en plaats deze op een verwarmingskussen in een schone kooi voor herstel.</li>
	<li>Dien Meloxicam subcutaan toe bij 5 mg/kg, 24 uur na de operatie.</li>
	<li>Controleer de algemene omstandigheden van het dier en kijk naar tekenen van infectie op de incisie site gedurende 5 dagen.</li>
	<li>Wond clips worden verwijderd ~ 7-10 dagen na de operatie.</li>
</ol>5. monitoring van de ontwikkeling van de borsttumor
<ol><li>Bewaak de geïnjecteerde muizen tweemaal per week door palpatie voor elk teken van borstkanker ontwikkeling.</li>
	<li>Zodra de tumor voelbaar is, controleert u de muis dagelijks en meet u de grootte van de tumor totdat deze het experimentele eindpunt bereikt, zoals bepaald door de grootte (bijv. het bereiken van 10% – 15% van het lichaamsgewicht van de muis) of conditie (bijv., zweren of necrotic) van de tumor, of door de algemene gezondheidstoestand van de muis (bijv. Comatose, moribund).</li>
	<li>Euthanaseren de muis door koolzuurgas verstikking, gevolgd door een secundaire methode (bijv., cervicale dislocatie).</li>
	<li>Isoleer de borstkanker weefsels en analyseer ze door Flowcytometrie, immunofluorescentie of expressie profilering (bijv. door RNA-sequencing [RNAseq] of Microarray), zoals eerder beschreven12.</li>
	<li>Voer Flow cytometrische analyse door gating voor Lineage-negatieve cellen (Lin-: negatief voor Lineage markers CD45 [leukocyten marker], CD31 [endotheliale celmarker] en TER119 [erytrocyten marker]) en analyseer de cellen in de tumor op basis van hun expressie van YFP, CD24 en CD29.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li>
<li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li>
<li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX1%2C+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer%2C+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881(2014).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li>
<li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431(2017).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+21+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li>
<li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het succes van deze aanpak voor het induceren van borsttumoren van verschillende subpopulaties van MECs berust niet alleen op het kiezen van geschikte Cell-Type-specifieke promoters (om CRE-expressie te stimuleren), maar ook op de intraductale injectieprocedure zelf. Het idee achter deze aanpak is dat de geïnjecteerde AD-CRE virussen worden bewaard in de ductale boom, die een verborgen structuur met lumen, en daarom, alleen MECs worden blootgesteld aan de virussen en zijn geïnfecteerd door AD-CRE. Vanwege de geringe lume...

Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een nieuwe borstkanker Modeling aanpak op basis van een intraductale injectie van AD-CRE in de muis MG. De CRE/loxP recombinatie-gebaseerde genetische benadering is op grote schaal gebruikt voor het modelleren van menselijke borstkanker bij muizen. De eerste generatie van CRE/loxP-gebaseerde borstkanker Muismodellen worden gegenereerd door het gebruik van CRE-uitdrukken transgene muizen onder controle van MEC-specifieke promoters (bijv. Mmtv-CRE voor Luminale MECS en een deel van de basale Mecs, WAP-CRE en Blg-CRE voor Luminale voor ouders en alveolaire Luminale Mecs, K14-CRE voor basaal en een deel van luminal MECS1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Hoewel deze CRE-transgene lijnen ruimtelijke controle van CRE-expressie mogelijk maken (d.w.z. in verschillende deelverzamelingen van MECS), staan zij de temporele controle van CRE-expressie en CRE/loxp-gemedieerde genetische manipulatie echter niet toe. De tweede generatie van CRE/loxp-gebaseerde borstkanker Muismodellen maken gebruik van induceerbare cytochromen CRE activiteit/expressie benaderingen (bijvoorbeeld, gebruik van CRE-oestrogeen receptor fusie [creer], die kan alleen induceren CRE/loxp recombinatie bij toediening van Tamoxifen), en Als gevolg hiervan maken deze genetische hulpmiddelen zowel ruimtelijke als temporele controles mogelijk van de activering van oncogene gebeurtenissen in MECS (bijv. K8-creer-en K5-creer-gebaseerde modellen) 10,11,12 . In beide generaties borstkanker muizen modellen, als promotors gebruikt om CRE of CreER uitdrukking (bijvoorbeeld, Krt8, Krt5) ook actief in epitheelcellen van andere organen (dat wil zeggen, ze zijn cel-type-specifieke maar niet orgaan-specifieke) of een ledende uitdrukking hebben in andere celtypen dan epitheelcellen (bijv. Mmtv, die ledende activiteit heeft in beenmerg hematopoietische cellen), kunnen deze benaderingen leiden tot de ontwikkeling van ongewenste kanker (s) in ander orgaan (en). Als deze onverwachte kankers veroorzaken letaliteit in de aangetaste muizen, het oorspronkelijke doel van het modelleren van borstkanker in deze muizen kan worden verboden (bv, Mmtv-CRE-driven oncogene gebeurtenissen kunnen leiden tot hematopoietische maligniteiten en vroegtijdige dood van de muizen , als gevolg van lektigheid van de promotor Mmtv in hematopoietische cellen)4.
Hier rapporteren we een borstkanker modellerings benadering bij muizen die zowel celtype-als orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een temporeel gecontroleerde manier mogelijk maakt. Deze aanpak is gebaseerd op een intraductale injectie van AD-CRE in MGs voor muizen (en is dus orgaan-specifiek). CRE-expressie kan worden bestuurd door gebruik te maken van verschillende MEC subpopulation-specifieke promoters die zijn ingebed in de adenovirale vector (bijv. Krt8 voor Luminale Mecs, Krt5 voor basale Mecs, waardoor de specificiteit van het celtype wordt bereikt). Kanker inductie in MGs kan tijdelijk worden gecontroleerd door een injectie van AD-CRE in muizen op verschillende leeftijden, beginnend vanaf 3-4 weken leeftijd (puberale) tot het volwassen stadium.

<table><tbody><tr><td>33-gauge naald</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>point style 3 blunt</td></tr><tr><td>7mm Reflex Clip</td><td>Braintree Scientific</td><td>RF7 CS</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, Ad-K5-Cre</td><td>University of Iowa Viral Vector Core</td><td>Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, Ad-K8-Cre</td><td>University of Iowa Viral Vector Core</td><td>Ad5mK8-nlsCre</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Fisher</td><td>HC800-1GAL</td><td>Bereid tot 70% in gebruik</td></tr><tr><td>gebiotinyleerd CD31</td><td>eBiosciences</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>gebiotinyleerd CD45</td><td>eBiosciences</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>gebiotinyleerd TER119</td><td>eBiosciences</td><td>13-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CD24-AF-700</td><td>BD Pharmingen</td><td>564237</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0242-83</td><td></td></tr><tr><td>CD29-APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>Haarverwijderingslotion</td><td>Nair</td><td></td><td>9 Oz</td></tr><tr><td>Hamilton-spuit</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>0,025 mL</td></tr><tr><td>Jodoforen</td><td>Betadine</td><td></td><td>10% Povidone-jodium</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>1-2,5%</td></tr><tr><td>Loxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Smeersel voor ogen</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Micro-dissectie schaar</td><td>Pentair</td><td>9M</td><td>Uurwerkerstangen</td></tr><tr><td>Micro-dissectie pincet</td><td>Dumont</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Taq 5X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0285L</td><td></td></tr></tbody></table>

het modelleren van borstkanker via een intraductale injectie van cre-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Borstkanker is een heterogene ziekte, mogelijk als gevolg van complexe interacties tussen verschillende cellen van oorsprong en oncogene gebeurtenissen. Muismodellen zijn instrumentaal in het verkrijgen van inzicht in deze complexe processen. Hoewel er veel Muismodellen zijn ontwikkeld om bijdragen te bestuderen van verschillende oncogene voorvallen en cellen van oorsprong aan borst tumorigenese, zijn deze modellen vaak geen celtype of orgaan specifiek of kunnen ze de initiatie van borsttumor vorming niet induceren in een op een tijdelijk gecontroleerde manier. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een nieuw type borstkanker Muismodellen op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus (AD-CRE) in muis borstklieren (MGs). Als gevolg van de directe injectie van AD-CRE in de melk kanalen, deze aanpak is MG specifiek, zonder ongewenste kanker inductie in andere organen. De intraductale injectieprocedure kan worden uitgevoerd bij muizen in verschillende stadia van hun ontwikkeling van MG (dus, het maakt temporele controle van de inductie van kanker, vanaf ~ 3-4 weken leeftijd). De specificiteit van het celtype kan worden bereikt door verschillende cel-type-specifieke promoters te gebruiken om CRE-expressie in de adenovirale vector te stimuleren. We tonen aan dat luminal en basale borst cellen epitheel (MECs) nauw kunnen worden gericht op CRE/loxP-gebaseerde genetische manipulatie via een intraductale injectie van AD-CRE onder de controle van de keratine 8 of Keratin 5 promotor, respectievelijk. Door het opnemen van een voorwaardelijke CRE Reporter (bv, CRE/loxP-inducible Rosa26-YFP Reporter), laten we zien dat MECS gericht door AD-CRE, en tumorcellen afgeleid van hen, kan worden getraceerd door het volgen van de reporter-positieve cellen na intraductale injectie.

Representatieve PCR-genotype resultaten voor de R26Y en Trp53L allelen worden weergegeven in Figuur 1.
Hoewel, in principe, alle 10 MGs kunnen worden onderworpen aan de intraductale injectieprocedure, praktisch, de twee vierde inguinale MGs zijn meestal geselecteerd voor injectie, als gevolg van hun gemakkelijkere toegankelijkheid en grotere MG maten (<strong class="xfi...

Het doel van dit protocol is om een nieuwe borstkanker modellerings aanpak te beschrijven op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in muizen borstklieren. Deze aanpak maakt zowel cel-type-en orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een tijdelijk gecontroleerde manier mogelijk.

Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Dit protocol zal onderzoekers helpen bij het genereren van een nieuw type muismodel om de ontwikkeling van menselijke borstkanker te recapituleren uit verschillende subsets van borstepitheelcellen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om borstkanker muis modellen te genereren in ontwikkelingsfase weefsel op een cel type specifieke manier en zonder een uitgebreide muis fokken. Om deze procedure te starten, genereren, onderhouden en verdoven floxed muizen zoals beschreven in het tekstprotocol.Breng de muis naar een gebied dat gescheiden is van waar de operatie moet worden uitgevoerd. Na het bevestigen van anesthesie door het uitvoeren van een teen snufje, injecteren Meloxicam als analgesia onderhuids bij een dosis van vijf milligram per kilogram voor te bereiden op de chirurgische ingreep. Bloot de tepel chirurgische site door het toepassen van een aantal druppels ontharing crème.Verwijder overmatige crème en los haar met zachte papieren handdoeken. Scheren wordt niet aanbevolen om schade aan de tepels te voorkomen. Desinfecteer de chirurgische plaats met iodophors eerst gevolgd door 70% alcohol en eindig met een definitieve toepassing van scrub iodophors.Doe dit in een cirkelvo

modeling-breast-cancer-via-an-intraductal-injection-cre-expressing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In dit artikel bespreken we hoe we een borstkankermodel bij vrouwelijke muizen kunnen vaststellen door borstkankercellen in het borstvetkussen te injecteren. Het voorbeeldprotocol demonstreert de orthotopische injectie.

Orthotopische injectie in het borstvetkussen: borstkanker bij muizen vaststellen

Deze video beschrijft een intraductale injectietechniek waarbij we injectiemix leveren in de kanalen van de borstklieren van muizen.

Intraductale injectie: het leveren van injectie mix in de kanalen van de muis borstklier

Een protocol voor de niet-invasieve intraductale afgifte van waterige reagentia voor de muis borstklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van gelokaliseerde injectie in de tepels van melkklieren targeting mamma-kanalen specifiek. Deze techniek kan worden aangepast voor verschillende verbindingen waaronder siRNA, chemotherapeutische middelen en kleine moleculen.

Intraductale Injectie voor Gelokaliseerde Drug Delivery naar de muis borstklier

Activering van latente mutaties met adenovirus-Cre in de borstklier ductale systeem een ​​klinisch relevante metastatische borstkanker. Opneming van een YFP promotor maakt het volgen van distale metastatische tumorcellen. Dit model is nuttig om latente metastase, anti-tumor immuniteit, en voor het ontwerpen van nieuwe immunotherapieën behandeling van borstkanker bestuderen.

Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer

Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

We beschrijven een xenograft muismodel van borstkanker hersenmetastase gegenereerd via staart-ader injectie van een endogene HER2-versterkte inflammatoire borstkankercellijn.

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Een methode van intraductale injectie van reagentia voor een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing in de mamma-ductale boom van muizen voor in vivo beeldvorming en preventie van borstkanker wordt beschreven. Injectie direct in de tepelopening maakt het mogelijk om borstepitheelcellen te richten met minimale collaterale weefselschade.

Intraductale toediening en röntgenvisualisatie van op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing voor preventie en lokale behandeling van borstkanker in muismodellen

Een procedure voor de levering van een chemische ablatieve oplossing aan de borstkanaalboom van de rat voor beeldgeleide preventieve behandeling van borstkanker wordt beschreven. Borstepitheelcellen kunnen worden gericht met minimale collaterale weefselschade door cannulatie rechtstreeks in de tepelopening en intraductale infusie van een 70% op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing.

Röntgenvisualisatie van intraductale op ethanol gebaseerde ablatieve behandeling voor de preventie van borstkanker in rattenmodellen

Het huidige protocol beschrijft intraductale injectie van virale vectoren via de speen om genen van belang af te leveren in de borstepitheelcellen.

In Vivo Genafgifte in muisepitheelcellen via intraductale injectie van zmammas

Leer een nieuwe methode voor het modelleren van borstkanker via intraductale injectie van Cre-expresserend adenovirus in muizen. Deze techniek maakt celtype-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen mogelijk zonder uitgebreide fokprogramma's.

Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier

Meer video's verkennen