SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation
20 juni 2019
Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.
Veilig en effectief leveren van Cas9 elementen in cellen is van cruciaal belang voor genbewerking gebaseerde therapieën. De protocollen die we hier laten zien, tonen een nieuwe benadering in die richting. Het protocol maakt gebruik van een nieuwe elektroporatie methode genaamd buis elektroporatie.
Dit leidt tot hoge cellulaire overlevingskansen en genbewerkingspercentages. De buis elektroporatie methode is virus, drug, en de verslaggever verrijking gratis. Deze hebben de voorkeur in klinische toepassingen, dus met genbewerking gebaseerde therapieën.
De methode is universeel toepasbaar op veel celtypen. Bijvoorbeeld menselijke hematopoietische cellen, primaire T-cellen en andere cellen kunnen allemaal worden bewerkt met behulp van onze methode. Deze buis elektroporatie methode maakt gebruik van een dunne buis.
Als u een eerste gebruiker bent, u proberen GFP uit te drukken plasmide DNA. Het aantonen van de procedure zal Linyuan Ma zijn, een postdoc uit mijn laboratorium. Om te beginnen met deze procedure verwerven menselijke IPSCs uit de American Type Culture Collection.
Kweek de iPSC's op kunstmatige extracellulaire matrix met feeder-vrije celkweekmedium in een celkweek incubator bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide volgens de instructies van de leverancier. Twee uur voor de transfectie behandelen de iPSCs met 10 micromolar Rho-associated coiled-coil met eiwitkinaseremmer Y-27632. Bij transfecteren, dissociate iPSCs met cellossing oplossing om enkele cellen op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Tel dan het aantal cellen. Om een konijn fibroblast cel cultuur te verkrijgen een oor huid biopsie van het puntje van een konijn oor. Spoel het weefsel twee maal af met DPBS met 5%penicilline-streptomycine.
Breng het gespoelde oorweefsel naar een nieuwe zes centimeter weefselkweekschaal en snijd het weefsel in kleine stukjes, elk ongeveer een voor een millimeter. Voeg een paar druppels FBS toe om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Daarna, verspreid het versnipperde weefsel in een 10 centimeter weefsel cultuur schotel en voeg 10 milliliter van cultuur medium.
Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende drie tot vijf dagen. Drie tot vijf dagen na beplating gebruik Trypsin-EDTA om de cellen te verteren op 37 graden Celsius gedurende twee minuten, dan tellen het aantal cellen. Na het ontwerpen en synthetiseren van de GRNAs en donor oligo's, bereiden de cellen zoals eerder beschreven.
Resuspend 20 tot 30.000 cellen in 20 microliter van elektroporatiebuffer. Pipet voorzichtig op en neer om een enkele celopening te produceren. Voor Cas9 RNP-transfectie, pre-mix twee microgram Cas9 NLS eiwit met 0,67 microgram gRNA bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten.
Meng het gevormde RNP-complex voorzichtig met twee microgram ssODN met cellen. Breng met behulp van universele pipettips van de elektroporatiekit het celmengsel over naar een elektroporatiebuis van 20 microliter. Plaats de elektroporatie buis in de sleuf van de elektroporator en druk op ga naar finish.
Een succesvolle elektroporatiecyclus wordt aangegeven door het pulsrapport op het beeldscherm van de elektroporator. Na de elektroporatie brengen de menselijke iPS cellen aan één milliliter van voorverwarmde Y-27632 die cultuurmiddel bevatten zoals eerder beschreven. Dan plaat de geresuspended cellen in een put van een 12-well cel kweekplaat.
Blijf de plaat kweken en zorg ervoor dat je het cultuurmedium elke dag verandert. Y-27632 wordt 24 uur na elektroporatie uit het menselijke iPSC-kweekmedium verwijderd. 72 uur na elektroporatie, oogst de cellen.
Voor een konijn fibroblast cellen, gebruik Trypsin-EDTA om de cellen te verteren van de cultuurplaat. Voor menselijke iPSC's gebruik maken van celloslating oplossing om de cellen te verteren van de cultuur platen. Vercentrifugeren de monsters kort bij 1000 tpm gedurende vijf minuten en worden de cellen opnieuw opgetrokken met 350 milliliter lysisbuffer.
Incubeer 's nachts bij 55 graden Celsius. De volgende dag extract het genomische DNA met fenol-chloroform met behulp van standaard procedures. Versterk 100 tot 200 basen paren van DNA-fragmenten uit gels met behulp van een gel extractie kit of rechtstreeks uit PCR-producten met behulp van een PCR SV mini kit.
Gebruik een TOPO-TA-kloonkit om de gezuiverde PCR-producten te kruisen in een PCR4-TOPO-vector om de genbewerkingsefficiëntie te bepalen door bacteriële koloniesequentie. Pick-up bacteriële klonen en sequentie van de inserts met behulp van een universele sequencing primer die door de TOPO-TA klonen kit. Om de genbewerkingsefficiëntie te bepalen door diepe sequencing, stuur je de eerder verkregen gezuiverde PCR-producten voor CRISPR amplicon sequencing in een DNA-sequencing-kern.
In deze studie wordt een buiselektroratiemethode effectief gebruikt om CRISPR/Cas9 RNP en ssODN's te leveren aan konijnen- en menselijke cellen, wat leidt tot robuuste, nauwkeurige genbewerking. Ten eerste worden C231Y- en Q235X-mutaties geproduceerd in het IL2RG-gen en wordt de R150G-mutatie geproduceerd in het SPR-gen in konijnenfiblastcellen. De specifieke sgRNA-ontwerpen en de genbewerkingspercentages die worden bepaald door bacteriële TA-klonen worden hier weergegeven.
De IL2RG C231 locus, van de 28 gesequencequenties, draagt men de precieze C231Y mutatie, vier dragen invoeging of schrapping mutaties, en de resterende 23 zijn wild-type. Op de IL2RG Q235 locus, van de 27 gesequencequenties, twee dragen de precieze Q235X mutatie, drie dragen een indel mutatie, en de resterende zijn wild-type. Op de SPG R150 locus, van de 20 gesequenced klonen, vijf dragen de precieze R150 genmutatie, 10 dragen indel mutaties, en de resterende zijn wild-type.
Buiselektroratie wordt vervolgens gebruikt om Cas9 RNP en ssODN's te leveren aan menselijke iPSC's en zich te richten op klinisch relevante loci in EGFR-, Mybpc3- en HBB-genen. Op de EGFR-locus draagt 15,68% van de allelen de precieze puntmutaties, 22,75% indelmutaties en de overige 61,57% is wildtype. Op de Mybpc3 locus, 37,92%dragen de nauwkeurige vier basis paar TGAA verwijdering, 2,24% dragen indel mutaties, en de resterende 59,84%zijn wild type.
Op de HBB locus, 11,5%dragen de precieze E6V mutatie, 35,4% dragen indel mutaties, en de resterende 65%zijn wild-type. Cas9 RNP is de voorkeur vorm van Cas9 vanwege zijn kleinere omvang in vergelijking met plasmide DNA. De buiselektroratie is een effectieve methode om Cas9 RNP te leveren.
We zijn vooral geïnteresseerd in het gebruik van buiselektroratie van Cas9 RNP in primaire T-cellen voor CAR T-toepassingen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïne-gemedieerde genbewerking in zoogdiercellen met behulp van buiselektroporatie. Deze nieuwe methode verbetert de celoverleving en genbewerkingssnelheden en is vrij van virussen en geneesmiddelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genbewerking
- CRISPR/Cas9 technologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Efficiënte levering van Cas9-elementen is cruciaal voor genbewerking.
- Buiselektroporatie is een nieuwe methode die de leveringsefficiëntie verbetert.
- De methode is toepasbaar op verschillende celtypen, inclusief menselijke iPSC's en konijnen fibroblasten.
- Hoge overlevingspercentages en genbewerkingsefficiëntie zijn essentieel voor klinische toepassingen.
Doel van de studie
- Om een nieuwe buiselektroporatiemethode voor genbewerking te demonstreren.
- Om hoge bewerkingssnelheden in zoogdiercellen te bereiken.
- Om een protocol te bieden dat vrij is van virale en medicamenteuze interventies.
Gebruikte methoden
- Bereiding van menselijke iPSC's en konijnen fibroblastencultures.
- Transfectie met behulp van Cas9 RNP en donoroligonucleotiden.
- Electroporatie met behulp van een specifieke buismethode.
- Beoordeling van genbewerkingsefficiëntie door middel van sequencing.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle levering van CRISPR/Cas9 componenten naar verschillende celtypen.
- Hoge snelheden van nauwkeurige genbewerking in doelgebieden.
- Gedemonstreerde mutaties in IL2RG en SPR genen in konijnen fibroblasten.
- Bewerkingsefficiëntie in menselijke iPSC's op klinisch relevante loci.
Conclusies
- Buiselektroporatie is een effectieve methode voor genbewerking.
- De methode zorgt voor hoge celoverleving en bewerkingssnelheden.
- Het is geschikt voor klinische toepassingen vanwege zijn efficiëntie en veiligheid.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient and safe delivery of CRISPR/Cas9 components is a critical bottleneck in therapeutic gene editing development. Tube electroporation enables high-precision editing in clinically relevant human iPSCs and primary cells without viral vectors or drug-based transfection reagents, reducing immunogenicity risks and supporting scalable, GMP-compatible workflows. This approach directly addresses the need for mechanistic de-risking in early-stage genome editing programs by providing quantitative, reproducible editing outcomes across disease-relevant loci.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of disease-associated mutations in IL2RG, SPR, EGFR, Mybpc3, and HBB genes to confirm pathogenic mechanisms.
- Operational Value: Supports rapid generation of isogenic cell lines for target de-risking and pathway interrogation in rabbit fibroblasts and human iPSCs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable precise editing rates (3.57%-37.92%) via bacterial TA cloning and deep sequencing, enabling dose-response and condition comparison.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible editing outcomes across cell types, supporting assay readiness for CRISPR-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates clinically relevant disease models (e.g., HBB E6V for sickle cell, EGFR mutations) for preclinical efficacy and safety testing.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation using the same editing method, reducing variability in translational handoff.
Pipeline & Workflow Integration
Tube electroporation fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling precise genome editing for target validation, assay development, and disease model generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through precise introduction of disease-causing mutations to clarify gene function and pathway involvement.
- Screening: Delivers quantitative editing readouts that allow comparison of gRNA efficacy, donor template design, and electroporation conditions.
- Analytics: Provides measurable outputs (precise mutation rates, indel frequencies) via sequencing to inform go/no-go decisions in target validation.
- Translational Research: Generates isogenic human iPSC models with clinically relevant mutations for preclinical mechanistic and toxicity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, non-viral editing platform applicable across multiple cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High precision editing reduces mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening.
- Operational Value: Virus- and drug-free delivery improves scalability, reduces regulatory burden, and supports consistent manufacturing.
- Strategic Value: Enables data-driven target prioritization by linking editing efficiency to phenotypic outcomes.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement of genome editing programs through validated, reproducible disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, iPSC handling, and electroporation optimization.
- Dependent on access to tube electroporation systems and compatible buffers.
- Necessitates standardized gRNA and ssODN design and validation protocols.
- Requires sequencing capacity (clonal or deep sequencing) for editing efficiency assessment.
- Performance may vary across primary cell types, necessitating pilot optimization.
