Name: Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor extractie van waterige metabolieten uit gekweekte kankercellen voor metaboloomanalyse met capillaire elektroforese-massaspectrometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken alle leden van het Shonai Regional Industry Promotion Center voor hun hulp. Dit werk werd deels ondersteund door onderzoekfondsen van Yamagata Prefecture en Tsuruoka City, door het National Cancer Center onderzoek en ontwikkeling Fonds [Grant Number 28-A-9], en door de Japan Society voor de bevordering van de wetenschap (JSPS) KAKENHI [Grant Number 17K07189] aan HM.

1. Cell cultuur op dag 1
Opmerking: elk monster voor metaboliet extractie moet worden bereid uit een enkele 100 mm weefselkweek schaal die is matig maar niet volledig Confluent (met ongeveer 2 tot 5 miljoen cellen). Bereken het aantal gerechten die nodig zijn voor de assay en bereid ze dienovereenkomstig.
<ol><li>Cultuur HCC827 en PC-9 cellen in 5% CO2 bij 37 °C in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetale boviene serum (FBS).</li>
	<li>Aspireren de cel cultuurmedia van de 100 mm cultuur gerechten.</li>
	<li>Was de cellen op elke schotel met behulp van 2 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), zonder calcium en magnesium. Zachtjes rots elke schotel, zodat de PBS-oplossing volledig dekt het oppervlak van de schotel.</li>
	<li>Aspireren de Wash buffer van de cultuur gerechten.</li>
	<li>Warme 0,25% trypsine-EDTA-oplossing voor 37 °C en voeg 2 mL trypsine-EDTA-oplossing toe met een serologische Pipet van 5 mL. Zachtjes rots elke schotel, zodat de trypsine volledig dekt het oppervlak van de schotel.</li>
	<li>Incubeer de cultuur gerechten bij 37 °C voor ongeveer 5 minuten.</li>
	<li>Voeg 4 mL van de voorverwarmde volledige groeimedium per schotel toe. De cellen in het midden opnieuw onderbreken door meerdere malen voorzichtig te pipetteren.</li>
	<li>Breng elke cel schorsing om een aparte 15 mL kegelvormige buis en centrifuge op 800 × g voor 5 min.</li>
	<li>Opnieuw op te schorten elke cel pellet in 2 mL van de voorverwarmde volledige groeimedium.</li>
	<li>Bepaal het totale aantal en de percenten levensvatbaarheid van de cellen gebruikend de geautomatiseerde teller van de cel en 0,4% trypaanblauw blauwe oplossing.<ol>
<li>Meng 10 l van de cel schorsing en 10 l van 0,4% trypaanblauw blauwe oplossing.</li>
		<li>Laad 10 l steekproef in de cel tellende kamer glijden door middel van capillaire werking.</li>
		<li>Plaats de kamer Schuif in de automatische teller. Het doorgegeven licht wordt automatisch verlicht en het instrument auto richt zich op de cel.</li>
		<li>Druk op de Capture knop om het beeld vast te leggen en de resultaten weer te geven.</li>
		<li>Voeg indien nodig verder groeimedium toe om de gewenste cel concentratie te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zaad ongeveer 1 tot 2,5 miljoen cellen per 100 mm cel kweek schotel. Opmerking: metaboliet concentraties bepaald door de CE-MS analyse zal worden genormaliseerd op basis van het aantal levensvatbare cellen. Voor het doel van het tellen van cellen, is het noodzakelijk om ten minste een extra gezaaid cultuur gerecht voor elke groep voor te bereiden.</li>
	<li>Incubeer de kweek gerechten in 5% CO2 bij 37 °c voor 18 uur.</li>
</ol>2. bereiding van reagentia
<ol><li>Verdun een commerciële interne standaardoplossing met inbegrip van L-methionine sulfon en d-kamfer-10-sulfonic acid 1000-voudige in ultrapuur water. Let op: voor minder dan 80 monsters mengt u eenvoudigweg 50 l van de interne standaardoplossing 1 en 45 mL ultrapuur water in een maatkolf van 50 mL en brengt u de oplossing tot 50 mL met ultrapuur water.</li>
	<li>Bereid een 0,05 g/mL mannitol oplossing in ultrapuur water als was buffer. Let op: voor minder dan 30 monsters lost u eenvoudigweg 25 g mannitol op in 500 mL ultrapuur water. Ongeveer 15 mL van het wassen buffer is vereist per 100 mm kweekschaal, dus een voldoende volume van de Wash buffer te bereiden op basis van het aantal monsters.</li>
</ol>3. pre-wassen centrifugaal filtereenheden
<ol><li>Pipetteer 250 l van ultrapuur water in de filterbeker van elke centrifugale filtereenheid (Zie de tabel met materialen). Opmerking: er zijn twee filtereenheden per monster vereist.</li>
	<li>GLB de filtereenheden stevig en centrifuge bij 9.100 × g bij 4 °c voor 5 min.</li>
	<li>Controleer het volume van elk filtraat — als significant filtraat is opgebouwd tijdens de eerste korte rotatie, kan de filtereenheid defect zijn. In dat geval verwijdert u de filtereenheid en gebruikt u in plaats daarvan een nieuwe filtereenheid.</li>
	<li>Sluit de deksels van de filter units stevig af en centrifugeer opnieuw bij 9.100 × g bij 4 °c gedurende 30 min.</li>
	<li>Zorg ervoor dat geen ultrapuur water in om het even welke filter koppen blijft; Verwijder de gefilterde ultrapuur water in elke collectie buis met een pipet en gooi. Opmerking: Probeer niet om restwater te verwijderen in een filterbeker met een pipet als het kan het filter beschadigen.</li>
	<li>Vervang de filter cups in hun collectie buizen. Opmerking: gebruik de centrifugale filtereenheden binnen een uur, omdat de filters kunnen beschadigd raken bij het drogen.</li>
</ol>4. Cell cultuur op dag 2
<ol><li>
Haal de 100 mm kweek gerechten uit de incubator. Nota: de geadviseerde cultuur duur van de cel is 18 h.</li>
	<li>Aspireren de cel cultuurmedium van elke 100 mm kweek schotel.</li>
	<li>Voeg 10 mL van de cel cultuurmedium dat de juiste concentraties van verbindingen of drugs omvat aan elk gerecht, waarbij zorg niet verstoren de cel laag. Opmerking: voor demonstratiedoeleinden hebben we in dit experiment 10 l van 250 mM diamide opgelost in PBS (eindconcentratie van 250 μM) toegevoegd.</li>
	<li>Incubeer de cultuur gerechten bij 37 °C voor 30 min in aanwezigheid van diamide of PBS als controle.</li>
	<li>Aspireren de cel cultuurmedium van elke 100 mm kweek schotel.</li>
	<li>Cellen wassen door zachtjes toe te voegen 2 mL van 5% mannitol oplossing aan de rand van elk gerecht, zorg ervoor dat niet te verstoren de cel laag, dan lichtjes kantelen van de schotel. Opmerking: PBS of zoutoplossing interfereert met CE-MS-based metabolomic analyse en nadelige invloed op de meetresultaten, en dus mag niet worden gebruikt als was buffer.</li>
	<li>Aspireren de Wash buffer van elke cultuur schotel, dan was de cellen weer door zachtjes toe te voegen 10 mL wassen buffer per schotel en iets kantelen van de schotel.</li>
	<li>Volledig aspireren de Wash buffer van de rand van elke kweek schotel. Nota: aspireren zo veel was buffer mogelijk, terwijl het letten op niet aspireren de cellen. Residuele mannitol kunnen interfereren met de CE-MS analyse; aspiratie van cellen zal het aantal cellen verminderen en zo een bron van fout in gegevens normalisatie worden.</li>
</ol>5. extractie van metabolieten uit gekweekte cellen
<ol><li>Voeg 800 l van 99,7% methanol per kweek schotel toe. Zachtjes rots elke cultuur schotel heen en weer om het gehele oppervlak te dekken. Laat de gerechten bij kamertemperatuur voor 30 s.</li>
	<li>Voeg langzaam 550 l van de verdunde interne standaardoplossing per schaal toe door het uiteinde van de pipet in de methanol te dompelen en meerdere keren voorzichtig op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Zachtjes rots elke cultuur schotel heen en weer om het gehele oppervlak te dekken.</li>
	<li>Laat de gerechten bij kamertemperatuur voor 30 s.</li>
</ol>6. filtratie van de cel extracten
<ol><li>Breng de geëxtraheerde oplossing van elke kweek schotel over naar een aparte 1,5 mL micro centrifuge Tube.</li>
	<li>Centrifugeer de tubes bij 2.300 × g bij 4 °c gedurende 5 min.</li>
	<li>Breng 350 l van elke bovendrijvende over in twee centrifugale filtereenheden per monster. Opmerking: van elke kweekschaal wordt een totaal van 700 l van de geëxtraheerde oplossing in twee filter buizen (350 l/Tube) overgebracht.</li>
	<li>Centrifugeer de filter buizen bij 9.100 × g bij 4 °c voor ongeveer 2 h tot geen vloeistof in de filter koppen blijft.</li>
	<li>Verwijder de filter cups en sluit de deksels van de inzamelings buizen stevig af.</li>
</ol>7. sample verdamping
<ol><li>Bereid een centrifugale verdamper-typisch, dit bestaat uit een verdamper, een koude val, en een vacuümpomp.</li>
	<li>Plaats de inzamelings buizen in de centrifugale verdamper. Opmerking: laat de deksels van de buizen open.</li>
	<li>Verdampen de geëxtraheerde monster oplossingen onder vacuümomstandigheden bij kamertemperatuur. Nota: de typische configuraties voor het aantal omwentelingen en de druk zijn 1.500 t/min en 1.000 PA, respectievelijk, en het vergt gewoonlijk ongeveer 3 h om de steekproeven volledig te verdampen.</li>
	<li>Bevestig dat er geen vloeistof in een van de inzamelings buizen blijft en sluit de deksels van de buizen stevig af.</li>
	<li>Bewaar de collectie buizen in een ultra-lage temperatuur (− 80 °C) diepvriezer tot metabolomic analyse.</li>
</ol>8. Metabolomic analyse door CE-MS
<ol><li>Het filtraat in 50 l van ultrapuur water onmiddellijk vóór de analyse van CE-MS opnieuw op te schorten.</li>
	<li>Voer CE-MS analyse door methoden beschreven eerder12,13 met behulp van capillaire elektroforese systeem en time-of-Flight massaspectrometer systeem uitgerust met een isocratic pomp, een CE-MS adapter, en een CE-ESI-MS sproeier. Opmerking: beide systemen kunnen worden gecontroleerd door de software van het systeemleveranciers en zijn verbonden door een gesmolten silica capillaire (50 μm interne diameter × 80 cm totale lengte).<ol>
<li>Stel instrumenten en monster flacons, de voorbereiding van de capillaire met een capillaire cassette, vullen schede vloeistoffen en passende elektroforese buffers afhankelijk van anion of kationen analyse modus, en vervolgens van toepassing voltages. Opmerking: instrumentatie en analytische voorwaarden worden in detail beschreven elders12,13.</li>
		<li>Open de software en bereid een composities met data-acquisitie methoden en sample informatie.</li>
		<li>Start een test run en controleer de gegevens, zoals de signaalintensiteit en de piek vorm van de interne normen en de piek resolutie van andere standaardverbindingen.</li>
		<li>Verfijnen indien nodig de analytische condities.</li>
		<li>Injecteer de sample oplossingen op 50 mbar voor 3 s en een spanning van 30 kV. Opmerking: CE-MS werd uitgevoerd, hetzij in de positieve of negatieve Ion-modus. Stel de spectrometer in om het massa bereik m/z 50 – 1000 te scannen. De capillaire spanning werd vastgesteld op 4 kV; het debiet van stikstof gas (verwarmingstemperatuur 300 °C). Voor de positieve modus, de fragmentatie, skimmer en OCT RFV voltage werden vastgesteld op 75, 50 en 125 V, respectievelijk. Voor de negatieve Ion-modus, de fragmentatie, skimmer, en OCT RFV voltage werd ingesteld op 100, 50, en 200 V, respectievelijk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseer spectrum gegevens.<ol>
<li>Haal pieken uit de massa spectrale gegevens met behulp van automatische integratie software om piek informatie, waaronder m/z, Peak Area, en de migratietijd (MT) te verkrijgen. Opmerking: de methode wordt in detail elders beschreven14.</li>
		<li>Sluit signaalpieken uit die overeenkomen met isotopomers, adduct ionen en andere product ionen van bekende metabolieten.</li>
		<li>Aantekeningen resterende pieken met informatie uit de HMT metaboliet database volgens m/z waarden en MTs.</li>
		<li>Normaliseren gebieden van de geannoteerde pieken aan interne standaard niveaus en aantallen cellen per monster.</li>
		<li>Evalueer de concentratie van elke metaboliet in de gekweekte cellen (pmol/106 cellen) met behulp van standaard bochten voorbereid voor elke metaboliet.</li>
		<li>Gebruik de gekwantificeerde metaboliet concentraties voor latere statistische analyses en biologische interpretaties14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis%3A+meeting+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism%3A+key+players+in+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming.</a> Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).</li>
<li>Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Cancer.</a> Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).</li>
<li>Fukuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+for+cancer+diagnosis+with+positron-labeled+fluorinated+glucose+analogs%3A+%5B18F%5D-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose%3A+a+new+tracer+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Meddicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection.</a> European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).</li>
<li>Miles, K. A., Williams, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+revisited%3A+imaging+tumour+blood+flow+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Imaging%22%5BJournal%5D)">Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism.</a> Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+the+metabolic+switch+in+cancers+by+oncogenes+and+tumor+suppressor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes.</a> Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+signaling+regulates+global+metabolic+pathways+in+EGFR-mutated+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+the+Phosphatidylinositol+3-Kinase+%28PI3K%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+%28mTOR%29+Axis+Is+Responsible+for+Aerobic+Glycolysis+mediated+by+Glucose+Transporter+in+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29-mutated+Lung+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Determinants+of+Sensitivity+to+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathway+Inhibitor+in+Small-Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma.</a> Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Characterization+of+Antifolate+Responsiveness+and+Non-responsiveness+in+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1129(2018).</li>
<li>Ohashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depiction+of+metabolome+changes+in+histidine-starved+Escherichia+coli+by+CE-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS.</a> Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).</li>
<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
<li>Patra, K. C., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pentose+phosphate+pathway+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pentose phosphate pathway and cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie voor de voorbereiding van metabolieten van gekweekte kankercellen voor de CE-MS-based metabolomic analyse. Een van de meest kritieke punten in dit protocol is de juiste voorbereiding van kankercellen, omdat gemeten metaboliet concentraties zijn genormaliseerd tot het aantal levensvatbare cellen. Voor een nauwkeurige schatting van het aantal cellen is het noodzakelijk om ten minste één extra kweek schotel per experimentele groep voor te bereiden om het aantal levensvatbare cellen gelijktijdig te tellen met de extractie van metabolieten voor metabolomic analyse. Bovendien moet hetzelfde aantal cellen worden gezaaid in elk gerecht voor de herhalingen en in de schotel voor het tellen; in de toekomst zou dit worden geholpen door een snelle en stressor-vrij (bijv. trypsine-vrij) cel tellen protocol dat het mogelijk maakt dezelfde schotel te worden gebruikt voor zowel het tellen van levensvatbare cellen en het uitpakken van metabolieten. Zorg moet worden genomen tijdens de wasbeurten, zodat cellen niet los van het oppervlak van de gerechten. Ernstige chemo tests en andere experimenten die de hechting van cellen verminderen, kunnen niet geschikt zijn voor dit extractie protocol als gevolg van mogelijk verlies van cellen tijdens de wassen procedure.
Het is belangrijk om een 5% mannitol oplossing te gebruiken als de Wash buffer voor het uitpakken van metabolieten uit gekweekte cellen voor de CE-MS-based metabolomic analyse, omdat zout-gebaseerde buffers, zoals PBS, interfereren met metabolomic analyse en negatieve invloed op de meting.
Twee of drie gerechten kunnen worden gecombineerd als een enkel monster door individueel extractie van metabolieten van elk gerecht en vervolgens poolen monsters; echter, het combineren van meerdere gerechten vaak verhoogt residuele mannitol in de geëxtraheerde metaboliet oplossing. Dit kan ook interfereren met metabolomic analyse door CE-MS. Vandaar, is het raadzaam om geen gebruik maken van meerdere gerechten of putten als een enkel monster.
Deze metabolomic analysemethode met behulp van CE-MS is ontwikkeld voor een uitgebreide meting van geladen moleculen met molecuulgewichten tussen 50 en 1000 da; zo is dit protocol geoptimaliseerd voor extractie van waterige, lage molecuulgewicht verbindingen. Daarom is dit protocol niet geschikt voor het uitpakken van hydrofobe metabolieten zoals lipiden of macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren. Aangezien er een stijgende vraag naar uitgebreide lipide analyses of lipidomics van gekweekte cel steekproeven is, is de ontwikkeling van een gemakkelijk en efficiënt protocol voor gelijktijdige extractie van zowel hydrofiele als hydrofobe metabolieten nodig.
De eerste stap van de metaboliet extractie-opzuigen medium en wassen cellen met mannitol-moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om veranderingen in het metabolische Profiel van de cellen te minimaliseren. De behandeling van cellen met methanol na het wassen met mannitol wordt verondersteld om proteïnen te denatureren en daardoor enzymen te verhinderen verdere metabolische reacties te katalyseren. Echter, zelfs na methanol behandeling, niet-enzymatische chemische reacties-zoals redox reacties, sommige decarboxylatie processen, en thiol verbanden-kan plaatsvinden. Als zodanig moeten alle concentraties van metabolieten die bij deze reacties worden gemeten, met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. In tegenstelling tot het genoom of transcriptoom, bestaat de Metaboloom uit moleculen met een grote variëteit aan chemische eigenschappen; Daarom kan geen enkel protocol extract alle metabolieten zonder verlies of verstoring. Voor nauwkeurigere metingen van dergelijke zeer reactieve metabolieten moet een protocol worden geraadpleegd dat specifiek is ontworpen voor het uitpakken van bepaalde groepen metabolieten, waarvoor fractionering en derivatizations vereist zijn. Het protocol hier gepresenteerd, echter, beschrijft een eenvoudige en snelle extractie van waterige metabolieten uit gekweekte cel monsters voor metabolomic analyse door CE-MS. In deze paper konden we niet beschrijven hoe het opzetten van CE-MS in detail, omdat de focus van het huidige manuscript is anders, echter, het beschrijven van gedetailleerde stappen om het opzetten van CE-MS kan een aparte dedicated artikel vereisen.

Otto Warburg merkte op dat de kankercellen de ongebruikelijke capaciteit verwerven om glucose op te nemen en het te vergisten om lactaat in aanwezigheid van adequate zuurstof te produceren-een fenomeen dat als Warburg effect wordt genoemd of aërobe glycolyse1,2. Mitochondriale Ademhalings tekorten worden gespeculeerd als onderliggende basis voor aërobe glycolyse in kankercellen3. Inderdaad, de Warburg effect is de basis voor tumor Imaging door fluorodeoxyglucose (FDG)-positron emissie tomografie (PET), die op grote schaal wordt gebruikt in de klinische praktijk4,5. Een hoge mate van aërobe glycolyse wordt beschouwd als een belangrijk kenmerk van kanker en is onlangs aangenomen als een van de bekende "kenmerken van kanker," zoals beschreven door D. Hanahan en B. Weinberg6. Somatische mutaties in oncogenen en tumor suppressor genen — zoals HRAS/kras/nri's, EGFR, BRAF, Myc, TP53, isocitrate dehydrogenase () enfumaraat hydratase (FH )-zijn gekoppeld aan specifieke metabole veranderingen in kankercellen, vermoedelijk een gevolg van de Warburg effect7.
Metabolomic analyse is een veelbelovende aanpak niet alleen om metabole regulatie in kankercellen te begrijpen, maar ook om vroegtijdig stadium kanker biomarkers en chemotherapie respons voorspelling te identificeren. Na behandeling van gevoelige of resistente kankercellen met antikanker verbindingen, het bijhouden van hun metabole reacties vergemakkelijkt de identificatie van metabole biomarkers om de werkzaamheid van specifieke kankertherapieën te voorspellen bij kankerpatiënten8 ,9,10,11. In dit artikel, kanker cel lijnen afgeleid van een Long adenocarcinoom met een EGFR mutatie behandeld met diamide-die oxidatieve stress veroorzaakt-werden gebruikt als modellen voor metabolomic analyse. Het voordeel van deze analytische methode met behulp van capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS) is de uitgebreide meting van de geladen metabolieten met de massa bereik m/z 50-100012,13. Het doel van dit artikel is om novicen een gedetailleerd stapsgewijze visueel protocol voor de voorbereiding van waterige metabolieten van gekweekte kankercellen en de daaropvolgende metabolomic analyse, met name door CE-MS.

<table><tbody><tr><td>Automated cell counter</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Countess II automated cell counter</td></tr><tr><td>Automatic integration software</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>version B.02.00</td></tr><tr><td>CE system</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 7100 CE system</td><td></td></tr><tr><td>CE/MS adapter kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Sprayer kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Countess cell counting chamber slides</td></tr><tr><td>Centrifugal filter device, 5 kDa</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>Conical sterile polypropylene tube, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>Conical sterile polypropylene tube, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis buffer</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3301-1001</td><td>for cation analysis</td></tr><tr><td>Electrophoresis buffer</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3302-1021</td><td>for anion analysis</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>Filter tip, 1000 &mu;l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Filter tip, 20 &mu;l</td><td>Watson</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>Filter tip, 200 &mu;l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>Fused silica capillary</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu;m i.d. &times; 80 cm total length</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>Internal standard solution</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>Isocratic pump</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 1100 Series Isocratic Pump</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 L, LC/MS grade</td></tr><tr><td>Microtube, 1.5 ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>Operating Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>version B.03.01 for CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sterile tissue culture dish, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Time-of-flight mass spectrometer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Merck</td><td>Milli-Q water</td><td>18.2 M&Omega;&#183;cm pure water</td></tr><tr><td>Volumetric flask, 50 ml</td><td>Iwaki</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analyse is een veelbelovende omics aanpak om niet alleen de specifieke metabole regulatie in kankercellen te begrijpen in vergelijking met normale cellen, maar ook om biomarkers te identificeren voor vroegtijdig stadium kanker detectie en voorspelling van chemotherapie respons in Kankerpatiënten. Voorbereiding van uniforme monsters voor metabolomic analyse is een kritisch probleem dat nog moet worden aangepakt. Hier presenteren we een eenvoudig en betrouwbaar protocol voor de extractie van waterige metabolieten uit gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse met behulp van capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS). Waterige metabolieten van gekweekte cellen worden geanalyseerd door kweken en wassen van cellen, de behandeling van cellen met methanol, extractie van metabolieten, en het verwijderen van eiwitten en macromoleculen met spin kolommen voor CE-MS analyse. Representatieve resultaten met behulp van longkanker cel lijnen behandeld met diamide, een oxidatieve reagens, illustreren de duidelijk waarneembare metabole verschuiving van cellen onder oxidatieve stress. Dit artikel zou vooral waardevol zijn voor studenten en onderzoekers die betrokken zijn bij metabolomics onderzoek, die nieuw zijn voor het oogsten van metabolieten uit de cel lijnen voor analyse door CE-MS.

Aangezien de metaboliet concentraties in kankercellen (pmol/106 cellen) worden genormaliseerd tot het aantal levensvatbare cellen, moeten experimentele voorwaarden met zorg worden opgezet om de variatie in het aantal levensvatbare cellen tussen de omstandigheden te minimaliseren. Bijvoorbeeld, diamide behandeling was op een relatief hoge concentratie (250 μm), maar voor een korte tijd om alle cellen te laten groeien zo even mogelijk, waardoor egaliseren van het aantal levensvatbare cellen geanalyseerd. Onder deze experimentele omstandigheden, HCC827 en PC-9 cellen groeide even voor 3 h (Figuur 1). CE-MS analyse van diamide-behandelde cellen in vergelijking met PBS-behandeld (controle) cellen bleek 175 en 150 differentiële metabolieten in HCC827 en PC-9 cellen, respectievelijk. Onder deze, verschillende tussenproducten in de pentose fosfaat pad (PPP) en in de bovenste glycolyse waren significant hoger in de diamide-behandelde omstandigheden in beide cellen, terwijl een paar tricarbonzuur acid (TCA) cyclus tussenproducten lager waren in de behandelde voorwaarden (Figuur 2 en Figuur 3).
De PPP genereert vermindering van equivalenten in de vorm van verminderde Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH), die wordt gebruikt voor redox homeostase onderhoud en vetzuur biosynthese15. Na diamide behandeling, het niveau van gluconzuur zuur-een geoxideerde glucose-verhoogde 12-voudige in HCC827 cellen en 10-voudige in PC-9 cellen; Evenzo, na diamide behandeling, het niveau van glucose 6-fosfaat (G6P)-een phosphorylated glucose en de eerste hexokinase-gekatalyseren glycolyse product-ook toegenomen 6,3-en 3,5-voudige in HCC827 en PC-9 cellen, respectievelijk (Figuur 4). Bovendien, na diamide behandeling, de niveaus van 6-phosphogluconate (6PG)-de eerste intermediair in PPP-drastisch toegenomen 89-voudige in HCC827 cellen en 231-voudige in PC-9 cellen ten opzichte van de niveaus gezien in de PBS controles (Figuur 4). De niveaus van andere glycolytic tussenproducten, zoals fructose 6-fosfaat (F6P) en fructose 1,6-difosfaat (F1, 6P), zijn daarentegen niet veranderd in de diamide experimentele toestand (Figuur 4). Total Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP+) niveaus waren bijna gelijk tussen diamide behandeling en PBS controle voorwaarden (Figuur 4), wat suggereert dat glucose was voornamelijk catabolized via de PPP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> Figuur 1. Onveranderde cel nummers bij diamide behandeling. Celgroei reacties op 250 μm van diamide werden gemeten met behulp van trypaanblauw blauwe kleuring. De aantallen van de cel van (a) HCC827 en (B) PC-9 cellen die met PBS (blauw) worden behandeld of diamide (rood; 250 μm) voor 1 of 3 h worden getoond. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> Figuur 2. Representatieve MS pieken van metabolieten. Electropherograms geannoteerd als (a) gluconzuur zuur, (B) GLUCOSE 6-fosfaat (G6P), (C) 6-Phosphogluconate (6PG), en (D) Nicotinamide ADENINE dinucleotide fosfaat (NADP+) verkregen door CE-MS analyse. Elke lijn wijst op de cel lijn (vast lichaam, HCC827; gestippeld, PC-9) en behandeling (blauw, PBS; rood, diamide) gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> Figuur 3. Metaboloom profielen van intracellulaire metabolieten. Vouwen veranderingen van metabolieten in (a) HCC827 en (B) PC-9 cellen behandeld met diamide worden weergegeven als log2(diamide/PBS). In totaal, 175 en 150 metabolieten werden geannoteerde in HCC827 en PC-9 cellen, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> Figuur 4. Up-regulering van PPP bij diamide behandeling. Intracellulaire concentraties (pmol/106 cellen) van de belangrijkste metabolieten die betrokken zijn bij glycolyse en de pentose fosfaat pathway (PPP) na behandeling met diamide worden getoond. Metabolieten werden geëxtraheerd uit HCC827 en PC-9 cellen behandeld met PBS (blauw) of diamide (rood, 250 μm) voor 30 min. representatieve metabolieten zoals gluconzuur zuur, glucose 6-fosfaat (G6P), fructose 6-fosfaat (F6P), 6 -phosphogluconate (6PG), en nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP+) worden getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Het doel van dit artikel is een protocol voor extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor metabolomic analyse, in het bijzonder, capillaire elektroforese-massaspectrometrie te beschrijven.

Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Het doel van dit artikel is om een gedetailleerd, stapsgewijs visueel protocol te bieden voor het extraheren van waterige metabolieten uit gekweekte kankercellen voor latere metabokoomanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud en betrouwbaarheid voor het extraheren van metabolieten uit aanhangende cellen. Maar bovenal is het goed geoptimaliseerd voor metabolome-analyse met capillaire elektroforese-massaspectrometrie of CEMS.Metabolomics is een krachtige techniek om biomarkers te identificeren of het detecteren van kanker in een vroeg stadium en het voorspellen van de respons op kankerpatiënten. We gebruiken kankercellen in deze demonstratie. Deze techniek kan echter ook worden toegepast om metabolieten te oogsten uit andere aanhangende cellen, zoals fibroblasten in iPS-cellen.Metabolietconcentraties worden genormaliseerd op basis van het aantal levensvatbare cellen. Dus zorgvuldige voorbereiding van de cultuur, dit is de sleutel voor het verkrijgen van goede reproduceerbare gegevens. Het aantonen van de procedure zal Ami Maruyama zijn, een technicus van mijn laboratorium.Om te beginnen, plaat HCC827 en PC-9 cellen in 100-millimeter schotels met 10 milliliter RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum. Plaats de gerechten in een couveuse op 5% kooldioxide en 37 graden Celsius gedurende 24 uur naar cultuur. Na incubatie, voorzichtig kantelen de 100-millimeter cultuur gerechten om de cel cultuur media aan te sporen.Was cellen op elke schotel met behulp van twee milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium. Wieg elk gerecht voorzichtig zodat de PBS-oplossing het oppervlak van de schotel volledig bedekt en kantel vervolgens de afwasbuffer. Warme 0,25% trypsin-EDTA oplossing tot 37 graden Celsius.Voeg met een serologische pipet van vijf milliliter twee milliliter van de opgewarmde trypsine-EDTA-oplossing toe aan elke schotel. Wieg elk gerecht voorzichtig zodat de trypsine het oppervlak van de schotel volledig bedekt. Broed de cultuurgerechten op 37 graden Celsius gedurende ongeveer vijf minuten.Voeg vervolgens vier milliliter van het voorverwarmde complete groeimedium toe aan elk gerecht. En voorzichtig pipette meerdere malen om opnieuw op te schorten de cellen in medium. Breng elke celsuspensie over naar een aparte conische buis van 15 milliliter.Centrifuge op 800 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang elke celpellet opnieuw op in twee milliliter van het voorverwarmde volledige groeimedium. Meng 10 microliter van de celsuspensie met 10 microliter van 0,4%trypan blauwe oplossing, in een 1,5-milliliter microtube.Laad 10 microliter van het mengsel in een celtelkamer die door capillaire werking wordt geschutijd. Plaats de dia van de kamer in de geautomatiseerde celteller en druk op de opnameknop om de afbeelding vast te leggen en de resultaten van het totale aantal en de levensvatbaarheid van de cellen weer te geven. Als het totale celaantal meer dan 0,5 miljoen cellen per milliliter is, voeg dan verder groeimedium toe aan de 15-milliliter conische buis om de gewenste celconcentratie te verkrijgen.Nu, voeg twee tot vijf milliliter van de cultuur toe aan elke 100-millimeter celkweekschotel om ongeveer één tot 2 1/2 miljoen cellen per schotel te zaaien. Incubeer de cultuurgerechten in 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius gedurende 18 uur. Verdun eerst in een maatkolf van 15 milliliter een commerciële interne standaardoplossing met L-Methionine sulfone en D-Camphor-10-sulfonic acid 1,000-voudig in ultrazuiver water.Los mannitol op in ultrazuiver water om een 0,05 gram per milliliter mannitoloplossing in ultrazuiver water als wasbuffer voor te bereiden. Vervolgens, in de filter beker van elke centrifugaal filter eenheid, pipet 250 microliters van ultrazuiver water. Dop de filtereenheden stevig vast en vercentrifuge vijf minuten op 9, 100 keer g bij vier graden Celsius.Controleer het volume van elk filtraat. Als er tijdens de eerste korte spin een aanzienlijk filtraat is opgelopen, kan de filterunit defect zijn. Gooi de filtereenheid weg en gebruik in plaats daarvan een nieuwe filtereenheid.Sluit de deksels van de filterunits stevig en centrifuge opnieuw bij 9, 100 keer g bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Zorg ervoor dat er geen ultrazuiver water in een van de filterbekers achterblijft en verwijder het gefilterde ultrazuivere water in elke opvangbuis met een pipet. Plaats de filterbekers terug in hun opvangbuizen en gebruik de centrifugaalfilterunits binnen een uur om schade bij het drogen te voorkomen.Haal de 100-millimeter cultuurgerechten uit de couveuse en aspirate de cel cultuur medium uit elk gerecht. Voeg 10 milliliter PBS-kweekmedium toe met of zonder 250 micromolardiamide aan elk gerecht, waarbij u ervoor zorgt dat de cellaag niet wordt verstoord. Broed de cultuurgerechten op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Na incubatie, aspirate de cel cultuur medium van elke 100-millimeter cultuur schotel. Lichtjes kantelen van de schotel, en voeg voorzichtig twee milliliter van 5% mannitol wassen buffer aan de rand van elke schotel om de cellen te wassen, oppassen niet aan de cellaag verstoren. Aspirate de wasbuffer van elke cultuur schotel, en was de cellen weer door iets kantelen van de schotel en voorzichtig toe te voegen 10 milliliter wasbuffer per schotel.Dan, volledig aspirate de wasbuffer van de rand van elke cultuurschotel. Voeg nu 800 microliters van 99,7% methanol per kweekgerecht toe en rock elk kweekgerecht zachtjes heen en weer, om het hele oppervlak te bedekken. Laat de gerechten 30 seconden op kamertemperatuur.Voeg langzaam 550 microliter van de verdunde interne standaardoplossing per schotel toe door de punt van de pipet in de methanol onder te dompelen en voorzichtig op en neer te pipetten, meerdere malen. Wieg zachtjes elk kweekgerecht heen en weer om het hele oppervlak te bedekken en laat de gerechten 30 seconden op kamertemperatuur. Breng vervolgens de geëxtraheerde oplossing uit elke kweekschaal over naar een aparte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Centrifugeren de buizen op 2, 300 keer g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Breng 700 microliter van elk supernatant over in twee centrifugale filtereenheden, met 350 microliter per eenheid. Centrifugeren de filterbuizen op 9, 100 keer g bij vier graden Celsius gedurende ongeveer twee uur, totdat er geen vloeistof in de filterbekers blijft.Verwijder de filterbekers en sluit de deksels van de opvangbuizen stevig dicht. In deze studie groeiden HCC827- en PC-9 cellen gedurende drie uur gelijk. CEMS-analyse geeft het verschil aan tussen met diamide behandelde cellen en met PBS behandelde cellen voor beide cellijnen.Onder deze, verschillende tussenproducten in de pentose fosfaat route en in de bovenste glycolyse waren aanzienlijk hoger in de diamide-behandelde omstandigheden, terwijl een paar tricarboxylische cyclus tussenproducten lager waren in de behandelde omstandigheden. Metabolome profielen van intracellulaire metabolieten bleek 175 en 150 differentiële metabolieten in HCC827 en PC-9 cellen, respectievelijk. Na diamide behandeling, het niveau van gluconisch zuur en geoxideerde glucose steeg 12-voudig in HCC827 cellen en 10-voudig in PC-9 cellen.Ook het glucosegehalte van 6-fosfaat, een fosforyleerde glucose in het eerste hexokinase-gekatalyseerde glycolyseproduct, steeg eveneens met respectievelijk 6,3 en 3,5 keer in HCC827- en PC-9-cellen. Bovendien zijn de niveaus van 6-fosfosfroetaat, de eerste tussenpersoon in de pentose fosfaatroute, drastisch toegenomen 89-voudig in HCC827 cellen en 231-voudig in PC-9 cellen. Daarentegen veranderden de niveaus van andere glycolytische tussenproducten zoals fructose 6-fosfaat niet in de experimentele toestand van diamide.De totale fosfaatgehalten van adenine dinucleotidegehalten van nicotinamide adenine waren bijna gelijkwaardig tussen diamidebehandeling en PBS-controleomstandigheden. Het gebruik van 5%mannitol oplossing, andere dan PBS, als wasbuffer voor wascellen is zeer belangrijk voor CEMS-analyse, omdat zoutgebaseerde buffers interfereren met de analyse en de meting negatief beïnvloeden. Dit protocol is ongeschikt voor het extraheren van hydrofobe metabolieten zoals lipiden, dus we moeten een protocol ontwikkelen voor het gemakkelijk extraheren van zowel hydrofiele als hydrofobe metabolieten voor een uitgebreidere metabokoomanalyse.Deze techniek realiseert een gemakkelijke extractie van metabolieten uit bijna elke aanhangende cellen, en is dus van toepassing op een verscheidenheid aan onderzoek, zoals kanker, stamcellen, farmacologie, voeding en cosmetische wetenschap.

extraction-aqueous-metabolites-from-cultured-adherent-cells-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

De betrouwbaarheid van de resultaten in metabolomics experimenten afhankelijk van de effectiviteit en de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding. Beschreven is een strenge en diepgaande methode die extractie van metabolieten van biologische vloeistoffen maakt met de mogelijkheid om later te analyseren tot duizenden verbindingen, of gewoon de verbinding klassen van belang.

Multi-step Voorbereiding Techniek om meerdere Metabolite Compound Klassen voor In-diepte en Informatieve Metabolomic Analyse Recover

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van cellulair metabolisme in complexe gemeenschappen van meerdere celtypen, met behulp van een combinatie van stabiel isotooptracering, celsortering om specifieke celtypen te isoleren en massaspectrometrie.

Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing

Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

We worden stappen beschreven waarmee snel in situ bemonstering van een klein gedeelte van een afzonderlijke cel met hoge precisie en minimale invasie met behulp van capillaire gebaseerde micro-sampling, ter vergemakkelijking van chemische karakterisering van een momentopname van de metabole activiteit in levende embryo's met behulp van een custom-built eencellige capillaire elektroforese en massaspectrometrie platform.

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Dit protocol heeft tot doel celmetabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometrie (SCMS) door het wassen van vluchtige zoutoplossingen, het snel afschrikken van vloeibare stikstof, vriesdrogen en opslag van -8 °C te combineren. Het toont aan dat het afschrikken van vloeibare stikstof essentieel is voor het behoud van metabolietprofielen, terwijl langdurige koude opslag tot een minimum moet worden beperkt om metabole veranderingen te voorkomen.

Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

Leer een betrouwbare methode voor extractie van waterige metabolieten uit gekweekte kankercellen voor metaboloomanalyse met capillaire elektroforese-massaspectrometrie.

Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal

Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

Meer video's verkennen