Technisch aspect van de geautomatiseerde synthese en real-time kinetische evaluatie van [¹¹C] SNAP-7941

Met carbon-11 radiolabeling kunnen kleine verbindingen worden gebruikt voor positronemissietomografie of PET zonder het molecuul te veranderen. Dit is essentieel voor het onderzoeken van receptorexpressieniveaus. Het voordeel van carbon-11 radiolabeling is dat we PET kunnen gebruiken om snap's bindingen kinetiek direct te evalueren naar de melanine-concentraerende hormoonreceptor in real time.

SNAP als melanine-concentrating hormoon receptor antagonist zal bijdragen aan een beter begrip van deze receptor en de associatie met metabole aandoeningen zoals obesitas en diabetes. Efflux transporters uitgedrukt op de bloed-hersenbarrière kan het gebruik van radiofarmaceutica voor centrale receptor expressie beeldvorming aanzienlijk belemmeren. Daarom is het belangrijk om sporen in vitro te evalueren.

De geautomatiseerde radiosynthese van SNAP is in grote lijnen toepasbaar op radioactief gelabelde verbindingen met een laag moleculair gewicht met een gemakkelijk te beoordelen methylgroep. Eenmaal vastgesteld kan deze procedure worden aangepast voor andere verbindingen. Assisteren bij de demonstratie zijn senior promovendi Sarah Pfaff en Theresa Balber.

Om te beginnen koolstof-11 SNAP synthese het opzetten van een schone koolstof-11 geautomatiseerde synthese module met de juiste reagentia en materialen. Start het SNAP syntheseproces op de modulecomputer die begint met systeemcontroles en conditionering. Ongeveer 30 tot 40 minuten voordat de module klaar is voor C-11 levering, selecteer de C-11 kooldioxide doel op de cyclotron en start de bundel op 65 microamperes.

Zodra de module klaar is voor levering sluit het binnenraam en de buitendeur. Bevestig dat de CO2-val is afgekoeld tot ten minste 40 graden Celsius en dat de methaanval is begonnen af te koelen. Zodra de cyclotron heeft geproduceerd ongeveer 120 gigabecquerels van C-11 CO2 klik OK in de module software om het pad te openen van het doel door de CO2-val.

Op de cyclotron computer beginnen met het leveren van C-11 CO2 aan de module. Controleer de activiteitsoverdracht op de modulecomputer en zorg ervoor dat deze na drie minuten overgaat tot de reductie van CO2 tot methaan. Controleer het proces als het resulterende methaan wordt gespoeld naar de methaanval en omgezet in methyljodide door circulatie door de jodiumoven.

Aan het einde van de conversiesequentie wachten als bijproducten worden gespoeld van de methyleodidetrap naar uitlaat en bevestig dan dat de reactor klaar is om activiteit te ontvangen door op OK te klikken. Controleer het systeem als de methyleodide wordt vrijgegeven uit de val, gespoeld door de methylbentriflate oven en gevangen in de reactor. Wanneer de activiteit in de reactorplateaus bevestigt dat het vangen voltooid is. Wacht terwijl het reactiemengsel drie minuten bij 75 graden Celsius reageert.

Controleer vervolgens het systeem als het reactiemengsel wordt gekoeld tot minder dan 35 graden Celsius en geblust met 1,5 milliliter water. Controleer het systeem als het reactiemengsel in de HPLC-injectielus wordt geladen en in de semi-voorbereidende HPLC-kolom wordt geïnjecteerd. Bekijk de sporen van de UV- en gammadetector terwijl de chromatografie vordert.

Wanneer de productpiek handmatig begint te verschijnen, begint u met het verzamelen van het product in de ronde bodemcollectiekolf in de module. Handmatig beëindigen collectie wanneer het gammasignaal valt onder ongeveer 400 telt per seconde. Let op het vloeistofniveau in de ronde bodemkolf terwijl het product onder heliumdruk op een vaste faseextractiecartridge wordt geladen.

Zodra de kolf leeg is en de vloeistof door de SPE-cartridge is gegaan, klikt u op OK om te beginnen met het wassen van de producten die op de cartridge zijn gevangen. Controleer vervolgens de activiteit in de products collection flacon als het product eerst wordt ontkoejel uit de cartridge in de flacon en vervolgens verdund met 0,9% zoutoplossing. Let op hoe de productoplossing via steriele filter onder heliumdruk naar de flacon wordt overgebracht.

Wanneer de overdracht is voltooid sluit de product uitgangsklep. Wanneer de radiotracer in de product flacon aankomt, meet de absolute radioactieve opbrengst. Gebruik vervolgens een lood afgeschermde spuit om 100 microliters van de tracer over te brengen naar een klein flesje voor kwaliteitscontrole.

Breng het kwaliteitscontrolemonster naar een afgeschermd werkgebied voor kwaliteitscontrole. Stel 40 microliter van het QC-monster op in een gasdichte spuit, laad het in een voorbereid HPLC-instrument uitgerust met een analytische kolom en injecteer het product. Voer andere kwaliteitscontrolemetingen uit tijdens de HPLC-run.

Zodra de HPLC run klaar is integreren alle pieken in het chromatogram van de radioactiviteit detector om te bepalen of de SNAP radio chemische zuiverheid groter is dan 95%Integreer de pieken in het UV chromatogram om de chemische zuiverheid van het product te bepalen. Gebruik het gebied onder de UV-productpiek om de specifieke activiteit te berekenen. Zodra het product is bevestigd om te voldoen aan de eisen voor gebruik laat de radio tracer naar de real-time kinetische experiment lab.

Ten minste 30 minuten voor het experiment was het bereide wilde type of getransfecteerde cellen met DPBS en voeg twee milliliter serumvrij groeimedium toe. Om transfected cellen te blokkeren voeg 0,98 microliter van een 20,4 millimolar oplossing van racemische verapamil hydrochloride in dimethylsulfoxide. Broed de cellen op een schuin vlak gedurende 30 minuten.

Schakel vervolgens het real-time testinstrument en de bijbehorende computer in. Open de besturingssoftware en kies één doel. Stel het aantal posities in op twee, de detectietijd op drie seconden, de vertragingstijd van de detectie op twee seconden en de naam van de eerste fase op de basislijn.

Plaats de celkweekschotel in de hellende steun van het apparaat met de celpool aan de onderkant. Zorg ervoor dat de celpool is bedekt met celkweekmedium. Start een achtergrondmeting van 10 minuten en stel de bestandsnaam en het pad in.

Stel de tijdschaal in op minuten en de nuclide-collectie op carbon-11. Configureer de grafiek om de achtergrond-, doel- en achtergrondondergetrokken doelgegevens weer te geven. Zodra de radiotracer is geleverd en goedgekeurd voor gebruik, neem een klein monster voor de test.

Bereken het benodigde volume van de radiotraceroplossing en bereid een pipet voor. In het instrument software pauzeren de run en wacht tot de schotel rotatie te stoppen. Open het deksel van het apparaat, draai de steun 90 graden naar links, voeg de radiotracer toe met de voorbereide pipet en breng het apparaat terug naar de oorspronkelijke positie.

Sluit het deksel van het apparaat en hervat het experiment onmiddellijk. Laat het experiment 20 minuten duren voordat u het beëindigt. De gegevens verwerken en analyseren om de opname van SNAP in de cellen te evalueren.

Nu kan de procedure worden herhaald voor de DMSO-behandelde controlecelkweekschotel en wilde typecellijn. Real-time kinetische tests werden uitgevoerd met niet-PGP uitdrukken wilde type cellen, PGP-uitdrukken cellen vooraf geblokkeerd met verapamil als een PGP-remmer, en gedeblokkeerde PGP-cellen. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen niet-behandelde cellen en met voertuigen behandelde cellen.

Carbon-11 SNAP snel opgehoopt in wilde type cellen, terwijl er geen accumulatie werd waargenomen in PGP-uitdrukkende cellen. Het vooraf blokkeren van de PGP-effluxtransporter met verapamil resulteerde in SNAP-accumulatie in de PGP-cellen die vergelijkbaar zijn met die van wilde typecellen. In combinatie met real-time kinetische metingen maakt deze opzet een breed begrip mogelijk van de farmacokinetiek van verbindingen met een laag moleculair gewicht en is daarom van groot belang voor de preklinische ontwikkeling van radiofarmaceutica.

Timing en organisatie zijn de belangrijkste ingrediënten voor een succesvolle koolstof-11 radiosynthese met de daaropvolgende real-time kinetische experimenten als de halflevenstijd van koolstof-11 is slechts 20 minuten. Door een korte halflevenstijd van koolstof-11 worden veel delen van deze procedure gelijktijdig uitgevoerd. Het is belangrijk voor alle betrokkenen om de reikwijdte en timing van hun rol te begrijpen.

Zowel productveiligheid als stralingsbescherming zijn essentieel voor de bereiding van radiofarmaceutica. Alle experimenten moeten het zo laag als redelijkerwijs haalbare of ALARA-principe volgen om de blootstelling aan straling van de exploitant te beperken.