Name: Meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar Ammonium op basis van 14NH4+/15NH4+ Analyses via sequentiële conversie naar N2O (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer DNRA-snelheden meten in kust- en mariene ecosystemen via N15-labeling en gaschromatografie-massaspectrometrie. Dit protocol verbetert het begrip van stikstofkringlopen in aquatische omgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Naoto Tanaka voor het helpen verzamelen van gegevens en het ontwikkelen van het protocol. De verzameling monsters werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

1. Bereiding van een PTFE-enveloppe voor het kwantitatief vastleggen van gasvormige NH3
<ol><li>Plaats een stuk polytetrafluorethyleen (PTFE) van 60 mm (25 mm breed) op een klein vel aluminiumfolie (ongeveer 300 mm x 450 mm groot, afgeveegd met ethanol).</li>
	<li>As een glasvezelfilter (10 mm in diameter met een poriegrootte van 2,7 μm) bij 450 °C gedurende 4 uur in een dempoven. Plaats het glasvezelfilter iets boven het middelpunt van de langere as van de tape(figuur 1a).</li>
	<li>Spot 20 μL van 0,9-mol/L H2SO4 in het midden van een GF/D-filter en vouw de PTFE-tape onmiddellijk met twee pincetten: een platte stempelcet en een enkelvoudig pincet. De volgende stappen, de stappen 1.4–1.7, worden weergegeven in figuur 1 en moeten snel worden uitgevoerd.</li>
	<li>Draai de PTFE-tape over het GF/D-filter op de stippellijn in figuur 1a om de vorm in figuur 1bte vormen .</li>
	<li>Verzegel beide zijden door te vouwen en druk vervolgens stevig op de rand met de pincet(figuur 1c). Druk niet te hard en krab de PTFE-tape niet.</li>
	<li>Vouw het open uiteinde met de pincet en druk vervolgens op de rand met de pincet (Figuur 1d).</li>
	<li>Sluit het open uiteinde af door de rand stevig te drukken met de pincet(figuur 1e). Het GF/D-filter mag tijdens deze procedure niet worden ingedrukt.</li>
</ol>2. Het voorbereiden van de biomassa van een lachgasreductase deficiënt denitrifier, Pseudomonas chlororaphis ondersp. aureofaciens ATCC13985, voor de denitrifiermethode
<ol><li>Streep een 20% glycerol voorraad Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 op 1/4 sterkte tryptone sojabouillon (TSB) agar platen. Incubeer de platen 25 °C gedurende 2-3 dagen.</li>
	<li>Breng een alleenstaande kolonie P. chlororaphis over naar een kleine reageerbuis met 5 mL autoclaved TSB medium en cultuur aërobe (zonder te schudden) gedurende een dag bij 25 °C in het donker tot het verkrijgen van maximale groei; dit zal worden gebruikt als de precultuur.</li>
	<li>Breng 3 mL van de precultuur over op een 1-L fles met een siliconen rubberen stop met 1 L vers bereide autogeklaveerde gemodificeerde TSB aangevuld met 10 mmol/L KNO323. Broed de fles tijdens het roeren met behulp van een roerder onder donkere omstandigheden bij 25 °C. Na het kweken voor 8 uur, vervang de silicium rubberen stop met een schroefdop en sluit goed. Zet de teelt in anoxie 's nachts voort.</li>
	<li>Centrifuge de cultuur op 18.800 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om biomassapellets te verkrijgen.</li>
	<li>Was de verpakte biomassa drie maal met 30 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing van Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), om de NO3−volledig te elimineren. De voorwaarden van de centrifugatie zijn hetzelfde als in stap 2.3.</li>
	<li>Na het wassen de verpakte biomassa opnieuw ophangen met 30 mL D-PBS(-). Gebruik 1 mL van de suspensie om de celdichtheid te bepalen door OD600te meten. Pipette 1 mL aliquots van de resterende suspensie in steriele cryovials met 0,8 mL van 45% glycerol. Bewaar de bereide glycerolvoorraden bij −80 °C tot gebruik (zie punt 6).</li>
</ol>3. Eliminatie van zuurstof, nitriet en nitraat uit het monstersediment
<ol><li>Weeg 3,0 g (nat gewicht) sediment af in een glazen flacon van 20 mL en voeg 9,0 mL oppervlaktewater toe om het op te schorten (25% w/w drijfmest).</li>
	<li>Sluit de flacon af met een zwarte butylrubberstopper (gewassen met ionengerend water en gesteriliseerd via autoclaving) en een aluminium dop.</li>
	<li>Zuiver de vering en vervang de hoofdruimtelucht door Ar (>99,99%) op 0,6 L/min gedurende 20 minuten met behulp van een spruitstuk.</li>
	<li>Vervang het Ar headspace gas door ultra-pure (>99.99995%) Hij door te stofzuigen voor 90 s en opladen Hij voor 30 s. Herhaal deze procedure vier keer. Stel de gasdruk in de hoofdruimte in op 1,5 atm.</li>
	<li>Broed de flesjes bij 20 °C 's nachts met schudden bij 150 rpm onder donkere omstandigheden met behulp van een constante temperatuur shaker om de resterende zuurstof, nitraat en nitriet in het sediment suspensie en headspace gas te elimineren.</li>
</ol>4. Tijdscursusexperiment voor het bepalen van het DNRA-tarief
<ol><li>Vervang de headspace gas door verse ultra-pure Hij met behulp van dezelfde procedure als in stap 3.5, maar zonder de vier herhalingen.</li>
	<li>Voeg gelabelde en niet-gelabelde substraten toe aan elke flacon volgens tabel 1 via de butylrubberstopper met behulp van een gastachtige spuit. Zuiver de eerder voorbereide substraatoplossingen in voldoende grote glazen flacons met ultrazuiver Hij met de druk van de hoofdruimte ingesteld op 1,5 atm om luchtverontreiniging te voorkomen. Vermijd de onbedoelde injectie van een hoeveelheid lucht tijdens de injectieprocedures.</li>
	<li>Incubeer flacons bij 20 °C met schudden bij 150 tpm. Voeg de substraten toe aan elke flacon volgens tabel 1 en broed gedurende 1 uur, 3 uur en 5 uur uit. Nadat incubatie is gestopt, onderwerpt u de sedimentsuspensie in de flacons aan de volgende procedures: stappen 4.4–4.9.</li>
	<li>Verwijder de aluminium dop en butyl rubberstopper uit elke flacon. Voeg vervolgens KCl (ingeasd bij 450 °C gedurende 4 uur) toe aan de sedimentsusopening tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 2 mol/L om het herstel van NH4+ uit het sediment te garanderen. Sluit de flesjes met een butyl rubberen stop en een aluminium sluiting.</li>
	<li>Schud het sediment bij 150 tpm gedurende 1 uur bij 4 °C onder donkere omstandigheden om de NH4+te extraheren.</li>
	<li>Breng de gehele sedimentsuspensie in de flacon over op een plastic centrifugebuis van 50 mL en vercent u 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Spoel de binnenwand van een vers geopende wegwerpspuit van 10 mL af en bevestig deze aan een vers geopend wegwerpceacetaat van wegwerpcellulose (poriegrootte 0,22 μm, 25 mm in diameter). Spoel vervolgens het membraanfilter af met 1 mL supernatant. Plaats de gespoelde spuitfilterunit op een 20 mL wide-mouth polypropyleen (PP) fles.</li>
	<li>Filtreer de resterende supernatant door een acetaatmembraanfilter in de 20 mL PP-fles. Bewaar de uittreksels op −20 °C tot nader onderzoek.</li>
</ol>5. Het vastleggen van diffuus NH4+ in 2M H2SO4 geabsorbeerd naar het GF/D-filter in de PTFE-envelop en de persulfaatoxidatie van NH4+ tot NR3−
<ol><li>Bereid standaardoplossingen voor van 14NH4Cl met concentratiegradiënten van 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L en 500 μ/L. Voor de analyse van de 15N-verhouding de totale concentratie van NH4+ tot 200 μmol/L vast te stellen en isotopenratio's van 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 en 10:90 voor te bereiden met pure 14NH4Cl en 15NH4CL standaardoplossingen.</li>
	<li>Breng 30 mg MgO (ingeasd bij 450 °C gedurende 4 uur) over in een glazen flacon van 20 mL en plaats de PTFE-envelop in het flesje.</li>
	<li>Breng 5 mL van een monster of standaard over in het flacon met de MgO en de PTFE-envelop, en sluit onmiddellijk met een grijze butylrubberstopper. Verzegel met een aluminium dop. Als de concentratie nh4+ naar verwachting meer dan 500 μmol/L zal bedragen, verdunt u het monster tot minder dan 500 μmol/L.</li>
	<li>Schud de flacons bij 150 tpm voor 3 uur bij 4 °C onder donkere omstandigheden.</li>
	<li>Verwijder de aluminium dop en de butylrubberstopper. Haal de PTFE-envelop uit het flacon met punt-ended pincet, spoel de envelop en de pincet grondig af met ion-geruild water, veeg ze af met een afvegend papier en leg de envelop op een vers afveegpapier.</li>
	<li>Open de PTFE-envelop met een paar pincet (gebruik van zowel de flat-ended en punt-ended pincet wordt aanbevolen) in de exacte omgekeerde volgorde van het vouwen uitgevoerd in stappen 1.4–1.7.</li>
	<li>Houd het perifere gebied van de GF / D-filter, waar de H2SO4 wordt verondersteld te worden unabsorbed, met de flat-ended pincet, en breng het in een 11-mL schroefdop reageerbuis met een PTFE-gevoerde dop. Spoel de pincet met ion-geruild water, en veeg ze met veegpapier.</li>
	<li>Herhaal stap 5.5–5.7 voor de resterende enveloppen.</li>
	<li>Voeg 1 mL ion-geruild water toe aan elk van de reageerbuizen, sluit de schroefdop en onderhoud deze zonder minstens 30 minuten te schudden bij kamertemperatuur om de NH4+ volledig uit het GF/D-filter te halen. Voer tijdens deze stap parallel de volgende stap (stap 5.10) uit.</li>
	<li>Bereid het persulfaat-oxiderende oplossing (POR) reagens25,26.<ol>
<li>Omdat het niet kan worden opgeslagen, bereid de exacte hoeveelheid POR die nodig is voor de behandeling van een enkele dag van monsters.</li>
		<li>Om POR voor te bereiden om 50 monsters te behandelen, giet 100 mL ion-geruild water in een 200 mL schroefdop fles en voeg 1,52 g NaOH (stikstof samengestelde analyse grade), 3 g boorzuur, en 5 g van K2S2O8 (stikstof en fosfor analyse kwaliteit) in die volgorde. Onmiddellijk na het toevoegen van elk reagens, schud de oplossing totdat deze volledig is opgelost.</li>
		<li>Indien nodig, week de fles in warm water om de ontbinding van de chemicaliën te helpen; er moet echter aandacht worden besteed aan de verontreiniging van NO3− omdat kraanwater normaal gesproken GEEN3−bevat .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Open na stap 5.8 de schroefdop, voeg 2 mL van het POR-reagens toe aan de reageerbuis en sluit de buis stevig met een schroefdop om verlies of verontreiniging tijdens de volgende stappen te voorkomen.</li>
	<li>Leg de reageerbuizen op een rek, wikkel ze in dubbelgelaagde aluminiumfolie en maak ze 1 uur bij 121 °C. Houd de buizen rechtop tijdens deze stap en vermijd snelle temperatuurveranderingen na het beëindigen van het autoclaven.</li>
</ol>6. Het bepalen van de NO3− omgezet van NH4+ door de denitrifier methode met behulp van quadrupole GC /MS
<ol><li>Meng 100 mL steriele fosfaatbuffer van 40 mmol/L (pH 7.2) en 100 mL steriele 30 mmol/L glucose aseptisch (20 mmol/L fosfaat en 15 mmol/L glucose; definitief).</li>
	<li>Voeg een 1/7,2 volume glycerolvoorraad P. chlororaphis toe aan 200 mL van de fosfaatgebufferde glucoseoplossing in een Erlenmeyer-kolf van 300 mL en zuiver met een ultrazuivere Hij (>99,995%) stream voor 1 uur.</li>
	<li>Doe 2,0 mL van de denitrifier-ophanging in elke 5 mL flacon. Dop de flesjes met een grijze butyl rubberen stop en een aluminium sluiting.</li>
	<li>Vervang de headspace air met ultra-pure Hij door stofzuigen voor 3 min en het opladen van de He voor 1 min. Stel de positieve druk van het headspace gas in op 1,3 atm om onbedoelde luchtverontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Injecteer 1 mL van een monster of standaard via de butyl rubberstopper met behulp van een wegwerpspuit van 1 mL. Let op de exacte hoeveelheid van het daadwerkelijk geïnjecteerde monster.</li>
	<li>Broed de flesjes 's nachts bij 25 °C onder donkere omstandigheden.</li>
	<li>Injecteer 0,3 mL 6-mol/LL NaOH om de denitrificatie te stoppen en de headspace CO2op te nemen, wat anders de N2O-analyse door GC/MS ernstig zal verstoren omdat CO2 en N2O hetzelfde molecuulgewicht hebben.</li>
	<li>Bepaal de bedragen van 44N2O, 45N2O en 46N2O in het headspace gas met behulp van quadrupole GC/MS met een aangepaste injectiepoort25. De bedrijfsomstandigheden die voor de GC/MS-analyse worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 2.</li>
</ol>7. Gegevensanalyse
<ol><li>Ontlenen de kalibratiecurve voor de NH4+ concentratie aan de lineaire relatie tussen de bekende concentratie van 14NH4+ en de gemeten signaalintensiteiten van het totaal geproduceerde 44N2O + 45N2O + 46N2O. Ontlenen de kalibratiecurve voor het 15N-gehalte aan de lineaire relatie tussen het bekende atoom%(d.w.z.. , 15N/14N+15N) en het berekende atoom% met behulp van een eerder verstrekte vergelijking27. Bereken de concentratie van 15NH4+ door de totale NH4+ te vermenigvuldigen met de 15N verhouding van NH4+.</li>
	<li>Bereken de potentiële DNRA-snelheid aan de hand van vergelijkingen die elders28,29,30 wordenaangeboden .</li>
</ol>

<ol><li>Gruber, N., Galloway, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Earth-system+perspective+of+the+global+nitrogen+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle.</a> Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nitrogen+Cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">The Nitrogen Cascade.</a> Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).</li>
<li>Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRysgaard%2C+S+%22Coastal+Lagoon+Eutrophication+and+Anaerobic+Processes+%28C.L.E.AN.%29.+Developments+in+Hydrobiology%22">Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology</a>. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).</li>
<li>Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sediment+mineralization%2C+nutrient+fluxes%2C+denitrification+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+in+an+estuarine+fjord+with+sea+cage+trout+farms%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).</li>
<li>Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycling+through+a+fringing+marsh-aquifer+ecotone%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone.</a> Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).</li>
<li>An, S. M., Gardner, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+%28DNRA%29+as+a+nitrogen+link%2C+versus+denitrification+as+a+sink+in+a+shallow+estuary+%28Laguna+Madre%2FBaffin+Bay%2C+Texas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas).</a> Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).</li>
<li>Gardner, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+fixation+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+%28DNRA%29+support+nitrogen+dynamics+in+Texas+estuaries%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries.</a> Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).</li>
<li>Preisler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+chemical+sulfide+oxidation+in+a+Beggiatoa+inhabited+marine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment.</a> The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).</li>
<li>Gardner, W. S., McCarthy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+dynamics+at+the+sediment-water+interface+in+shallow%2C+sub-tropical+Florida+Bay%3A+why+denitrification+efficiency+may+decrease+with+increased+eutrophication%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication.</a> Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).</li>
<li>Dong, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+benthic+denitrification%2C+nitrate+ammonification%2C+and+anammox+process+rates+and+nitrate+and+nitrite+reductase+gene+abundances+along+an+estuarine+nutrient+gradient+%28the+Colne+estuary%2C+United+Kingdom%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom).</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).</li>
<li>Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+increased+nitrate+loading+on+nitrate+reduction+via+denitrification+and+DNRA+in+salt+marsh+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments.</a> Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).</li>
<li>Dong, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+reduction+of+nitrate+to+ammonium%2C+not+denitrification+or+anammox%2C+dominates+benthic+nitrate+reduction+in+tropical+estuaries%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries.</a> Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).</li>
<li>Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen-limited+mangrove+ecosystems+conserve+N+through+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium.</a> Scientific Reports. 2, 419(2012).</li>
<li>Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+activity+distribution+of+dissimilatory+nitrate+reduction+in+coastal+marine+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments.</a> Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).</li>
<li>Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anammox+denitrification+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+in+the+East+China+Sea+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment.</a> Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).</li>
<li>Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+membrane+inlet+mass+spectrometer+method+to+measure+15NH4%2B15%2B+for+isotope-enrichment+experiments+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems.</a> Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tidal+pumping+facilitates+dissimilatory+nitrate+reduction+in+intertidal+marshes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes.</a> Scientific Reports. 6, 21338(2016).</li>
<li>Bu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+Nitrate+Reduction+to+Ammonium+in+the+Yellow+River+Estuary%3A+Rates%2C+Abundance%2C+and+Community+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity.</a> Scientific Reports. 7, 6830(2017).</li>
<li>Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denitrification%2C+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium%2C+and+nitrogen+fixation+along+a+nitrate+concentration+gradient+in+a+created+freshwater+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland.</a> Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).</li>
<li>Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+Nitrate+Reduction+Processes+in+Typical+Chinese+Paddy+Soils%3A+Rates%2C+Relative+Contributions%2C+and+Influencing+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors.</a> Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).</li>
<li>Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+in+upland+tropical+forest+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils.</a> Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).</li>
<li>Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+15N%E2%80%93NH4%2B+in+marine%2C+estuarine+and+fresh+waters%3A+An+adaption+of+the+ammonia+diffusion+method+for+samples+with+low+ammonium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations.</a> Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).</li>
<li>Sigman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+method+for+the+nitrogen+isotopic+analysis+of+nitrate+in+seawater+and+freshwater%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater.</a> Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).</li>
<li>Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updates+to+instrumentation+and+protocols+for+isotopic+analysis+of+nitrate+by+the+denitrifier+method%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).</li>
<li>Isobe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+techniques+for+quantifying+15N%2F14N+of+nitrate%2C+nitrite%2C+total+dissolved+nitrogen+and+ammonium+in+environmental+samples+using+a+gas+chromatograph+equipped+with+a+quadrupole+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Environments%22%5BJournal%5D)">Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer.</a> Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).</li>
<li>Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+15N+enrichment+of+dissolved+organic+nitrogen+in+environmental+waters+by+gas+chromatography%2Fnegative-ion+chemical+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry.</a> Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).</li>
<li>Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+contributions+of+nitrification+and+denitrification+to+the+flux+of+nitrous+oxide+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).</li>
<li>Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-replete+benthic+microalgae+as+a+source+of+dissolved+organic+carbon+to+coastal+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Estuaries+and+Coasts%22%5BJournal%5D)">Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters.</a> Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).</li>
<li>Huygens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+retention+of+bioavailable+nitrogen+in+volcanic+rainforest+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Geoscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils.</a> Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).</li>
<li>Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+importance+of+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+for+the+terrestrial+nitrogen+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle.</a> Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).</li>
<li>Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNRA+community+structure+and+activity+in+a+shallow+lagoonal+estuarine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 460(2014).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+nitrate+reduction+processes+in+sediments+of+urban+river+networks%3A+Spatiotemporal+variations+and+environmental+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications.</a> Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).</li>
<li>Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+biogeochemical+investigation+of+sedimentary+nitrogen+cycling+communities+responding+to+tidal+and+seasonal+dynamics+in+Cape+Fear+River+Estuary%5BTitle%5D)+AND+%22Estuarine%2C+Coastal+and+Shelf+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary.</a> Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).</li>
<li>Deng, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissimilatory+nitrate+reduction+processes+and+associated+contribution+to+nitrogen+removal+in+sediments+of+the+Yangtze+Estuary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Geophysical+Research%3A+Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary.</a> Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).</li>
<li>Tiedje, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTiedje%2C+JM+%22Biology+of+Anaerobic+Microorganisms%22">Biology of Anaerobic Microorganisms</a>. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).</li>
<li>Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denitrification%3A+ecological+niches%2C+competition+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Denitrification: ecological niches, competition and survival.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).</li>
<li>Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+organic+carbon+and+nitrate+loading+on+partitioning+between+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonium+%28DNRA%29+and+N2+production%5BTitle%5D)+AND+%22Geochimica+et+Cosmochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164(2015).</li>
<li>Sigman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+abundance-level+measurement+of+the+nitrogen+isotopic+composition+of+oceanic+nitrate%3A+an+adaptation+of+the+ammonia+diffusion+method%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method.</a> Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).</li>
<li>Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+microdiffusion-hypobromite+oxidation+method+for+determining+nitrogen-15+isotope+in+ammonium%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Science+Society+of+America+Journal%22%5BJournal%5D)">Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium.</a> Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).</li>
<li>Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+chromatographic+analysis+of+15N%3A14N+ratios+in+ammonium+or+nitrate+for+isotope+addition+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments.</a> Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De concentratie- en isotopenverhouding van NH4+ voor de DNRA-analyse werd met behulp van verschillende methoden gekwantificeerd. De concentraties en isotopenverhoudingen van NH4+ worden over het algemeen afzonderlijk gemeten. De NH4+ concentratie wordt meestal gemeten met behulp van colorimetrische methoden, waaronder een autoanalyzer4,10,15,<sup class=...

De kunstmatige synthese van stikstofmest en de wijdverbreide toepassing ervan hebben de wereldwijde stikstofcyclus sterk verstoord. Geschat wordt dat de overdracht van reactieve stikstof van terrestrische naar kustsystemen is verdubbeld sinds pre-industriële tijden1. Een aanzienlijk deel van de meststoffen die op een bepaald veld worden aangebracht, wordt weggespoeld van de bodem naar rivieren of grondwater, voornamelijk als NR3− 2. Dit kan leiden tot milieuproblemen zoals drinkwatervervuiling, eutrofiëring en de vorming van hypoxie. NO3− in wateromgevingen wordt verwijderd uit of vastgehouden in het ecosysteem via biologische assimilatie en verschillende microbiële dissimilerende processen. Denitrificatie en anammox staan bekend als belangrijke microbiële verwijderingsprocessen voor NO3−. Denitrificatie is de microbiële reductie van NO3− tot gasvormige N-producten (NO, N2O en N2) in combinatie met de oxidatie van een elektronendonor, zoals organische stoffen, waardoor het risico op bovengenoemde problemen wordt verminderd. Anammox produceert ook N2 van NO2− en NH4+; daarom verwijdert het anorganische N uit een ecosysteem. Omgekeerd werkt DNRA aan het behoud van N in een ecosysteem; algemeen wordt aangenomen dat DNRA voornamelijk wordt uitgevoerd door fermenterende bacteriën of chemolithoautotrofe bacteriën en dat ze dessimilerende NO3− tot biologisch beschikbare en minder mobiele NH4+verminderen.
Studies over DNRA zijn voornamelijk uitgevoerd in mariene of estuariene ecosystemen, zoals oceanische of estuariene sedimenten en water, zout of brak moerasgrond, en mangrovegrond. Kust- of mariene ecosystemen zijn belangrijk als reservoirs voor het verwijderen van NO3− uit terrestrische ecosystemen, en in eerdere studies is aangetoond dat DNRA een bijdrage levert over een zeer breed scala van3− verwijdering (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Verder is het bestaan van DNRA aangetoond in een breed scala van omgevingen, waaronder zoetwateromgevingen19, rijstpadiebodems20en bosbodems21. Hoewel deze studies hebben aangetoond dat DNRA potentieel vergelijkbaar is met denitrificatie voor NO3− verwijdering, zijn studies die de DNRA-activiteit meten nog steeds zeer beperkt in vergelijking met studies die denitrificatie meten.
De DNRA-snelheid is geëvalueerd aan de hand van 15N-labelingtechnieken in combinatie met data-analyse via analytische of numerieke modellen. Een analytische oplossing voor het berekenen van het DNRA-tarief is gebaseerd op de toename van de 15N verrijking van de NH4+ pool na de toevoeging van 15NO3− als tracer. 15. N-label NO3− wordt toegevoegd aan een monster en geïncubeerd, en de DNRA-snelheid kan vervolgens worden berekend op basis van de veranderingen in de concentratie en isotopenverhouding in NH4+ voor en na een bepaalde periode. In dit document wordt een methode beschreven om de NH4+ concentratie en de isotopenverhouding te kwantificeren, die nodig zijn om de DNRA-snelheid te berekenen, in detail beschreven. Kortom, de hier gerapporteerde methode is een combinatie van verschillende eerder gerapporteerde technieken22,23,24,25,26 met wijzigingen toegevoegd aan een aantal procedures. De methode bestaat uit een reeks van vijf componentprocedures: (1) incubatie van een milieumonster met de wijziging van een stabiele isotopentracer, 15NR3−(2) extractie en nuttige toepassing van NH4+ met behulp van een "diffusieprocedure" met wijzigingen, (3) persulfaatoxidatie van NH4+ in het monster; bestaande uit inheemse NH4+ en 15NH4+ afgeleid van 15NR3− via DNRA-activiteit, in NO3− en 15NO3−(4) latere microbiële transformatie van NO 3− en 3 − en15 15GEEN3− tot N2O-isotopen via de gemodificeerde denitrifiermethode en (5) kwantificering van de N2O-isotopen met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC/MS). In het volgende deel wordt eerst de voorbereiding van de procedures (2) en (4) beschreven en vervolgens worden alle vijf de componentprocedures in detail beschreven.

<table><tbody><tr><td>15N-KNO3</td><td>SHOKO SCIENCE</td><td>N15-0197</td><td></td></tr><tr><td>15N-NH4Cl</td><td>SHOKO SCIENCE</td><td>N15-0034</td><td></td></tr><tr><td>20 mL PP fles</td><td>SANPLATEC</td><td>61-3210-18</td><td>Met brede hals</td></tr><tr><td>Aluminium dop</td><td>Maruemu</td><td>1307-13</td><td>Nr. 20, met gat</td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Wako</td><td>021-02195</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>HITACHI</td><td>Himac CR21G II</td><td></td></tr><tr><td>Deoxygenized Gas Pressure &amp; Replace Injector</td><td>SANSIN INDUSTRIAL</td><td>IP-12</td><td></td></tr><tr><td>Weggeefcellulose acetaatmembraanfilter</td><td>ADVANTEC</td><td>25CS020AS</td><td>Poriegrootte 0,22 &micro;m, 25 mm in diameter</td></tr><tr><td>Weggeefspuit</td><td>Termo</td><td>SS-10SZ</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Weggeefspuit</td><td>Termo</td><td>SS-01T</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline (-)</td><td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td><td>5913</td><td></td></tr><tr><td>Gastight spuit</td><td>VICI Valco Instruments</td><td>4075-15010</td><td>Serie A-2, 100 &micro;L</td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>shimadzu</td><td>GCMS-QP2010ultra</td><td></td></tr><tr><td>GF/D</td><td>Whatman</td><td>1823-010</td><td>10 mm in diameter</td></tr><tr><td>Glazen flacon</td><td>Maruemu</td><td>0501-06</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Grijze butyrubber stop</td><td>Maruemu</td><td>1306-03</td><td>Nr.20-S</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Wako</td><td>192-04696</td><td>Gegarandeerd Reagens</td></tr><tr><td>K2S2O8</td><td>Wako</td><td>169-11891</td><td>Stofanalyse kwaliteit</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td>Gegarandeerd Reagens</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Wako</td><td>160-04035</td><td>Gegarandeerd Reagens</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>191-08625</td><td>Stofanalyse kwaliteit</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>017-02995</td><td>Gegarandeerd Reagens</td></tr><tr><td>Kunststof centrifugebuis</td><td>ASONE</td><td>1-3500-22</td><td>50 mL, VIO-50BN</td></tr><tr><td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC 13985</td><td>Gevroren gedroogd, de typestam van Pseudomonas aureofaciens</td></tr><tr><td>PTFE afdichtingstape</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z221880</td><td>25 mm in breedte</td></tr><tr><td>Reciproke schudder</td><td>TAITEC</td><td>0000207-000</td><td>NR-10</td></tr><tr><td>Schroefdop testbuis</td><td>IWAKI</td><td>84-0252</td><td>11 mL</td></tr><tr><td>PTFE-beklede dop voor testbuis</td><td>IWAKI</td><td>84-0262</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Difco Laboratories</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar ammonium op basis van 14nh4+/15nh4+ analyses via sequentiële conversie naar n2o

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Het belang van het begrijpen van het lot van nitraat (NR3−), de dominante N-soort die van terrestrische naar aquatische ecosystemen wordt overgebracht, is toegenomen omdat de wereldwijde stikstofbelastingen na de industrialisatie drastisch zijn toegenomen. Dissimilatorische nitraatreductie tot ammonium (DNRA) en denitrificatie zijn beide microbiële processen die NO3− gebruiken voor ademhaling. In vergelijking met denitrificatie zijn de kwantitatieve bepalingen van de DNRA-activiteit slechts in beperkte mate uitgevoerd. Dit heeft geleid tot onvoldoende inzicht in het belang van DNRA in NO3− transformaties en de regulerende factoren van dit proces. Het doel van dit document is een gedetailleerde procedure te bieden voor de meting van het potentiële DNRA-tarief in milieumonsters. Kortom, het potentiële DNRA-tarief kan worden berekend op basis van de 15N-gelabelde ammonium (15NH4+) accumulatiesnelheid in 15NR3− toegevoegde incubatie. De bepaling van de 14NH4+ en 15NH4+ concentraties beschreven in dit document bestaat uit de volgende stappen. Ten eerste wordt de NH4+ in het monster geëxtraheerd en gevangen op een verzuurd glasfilter als ammoniumzout. Ten tweede wordt het gevangen ammonium via persulfaatoxidatie geëuterd en geoxideerd tot NO3− Ten derde wordt de NO3− omgezet in N2O via een N2O reductase denitreifier. Ten slotte wordt de omgebouwde N2O geanalyseerd met behulp van een eerder ontwikkeld quadrupole gaschromatografie-massaspectrometriesysteem. We pasten deze methode toe op kweldersedimenten en berekenden hun potentiële DNRA-percentages, waaruit bleek dat de voorgestelde procedures een eenvoudige en snellere bepaling mogelijk maken in vergelijking met eerder beschreven methoden.

De representatieve resultaten in dit document zijn afgeleid van 15N-tracing experimenten van kweldersedimenten. De bemonsterde kwelder werd nieuw gemaakt in de nasleep van de 2011 Great East Japan Aardbeving in het Moune gebied van Kesen-numa stad in miyagi prefectuur, Japan. In september 2017 werden oppervlaktesedimenten (0-3 cm) verzameld op twee locaties in de subgetijden- en intergetijdenzones. Eerst, onmiddellijk na het verzamelen, werd het sediment gezeefd door een 4 mm g...

Een reeks methoden om de potentiële DNRA-snelheid te bepalen op basis van 14NH4+/15NH4+ analyses wordt in detail verstrekt. NH4+ wordt omgezet in N2O via verschillende stappen en geanalyseerd met behulp van quadrupole gaschromatografie-massaspectrometrie.

Meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar Ammonium op basis van 14NH4+/15NH4+ Analyses via sequentiële conversie naar N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Kust- en mariene ecosystemen zijn belangrijk als reservoirs, voor het verwijderen van nitraat uit terrestrische ecosystemen. Nitraat in het aquatisch milieu kan door meerdere processen tegelijk worden geconsumeerd. Zoals denitrification, anammox en DNRA.Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat DNRA mogelijk schuldig is aan denitrificatie, studies meten DNRA activiteit als nog steeds zeer beperkt in vergelijking met die meten denitrificatie. In ons protocol bieden we een gedetailleerde procedure voor het meten van de potentiële DNRA-snelheid in milieumonsters. Wij zijn van mening dat potentiële DNRA-snelheid kan worden berekend op basis van N15-gelabelde Ammoniumaccumulatie met N15-labelNitraattoevoeling.Het voordeel van onze methode ten opzichte van andere methoden is dat Ammonium uiteindelijk wordt omgezet in lachgas, dat een lage atmosferische achtergrond heeft. Ook is het niet verstandig dat we lachgas gemeten via quadrupole gaschromatografie massaspectrometer. Dat is minder duur en gemakkelijk te beheren dan een isotopenverhouding massaspectrometer.Plaats eerst een stuk PTFE-tape van 60 millimeter op een klein vel aluminiumfolie. As een glasvezelfilter op 450 graden Celsius gedurende vier uur in een dempoven. Plaats vervolgens de glasvezelfilter iets boven het middelpunt van de langere as van de tape.Spot vervolgens 20 microliters van 0,9 mol per liter zwavelzuur in het midden van het glasvezelfilter en vouw onmiddellijk de PTFE-tape met platte stempel en een rechte pincet. Draai de PTFE tape over het glasvezelfilter, sluit vervolgens beide zijden van de PTFE-tape af door te vouwen en druk vervolgens stevig op de rand met de pincet. Vouw met de pincet het open uiteinde van de PTFE-tape en druk op de rand.Verzegel het open uiteinde van de PTFE-tape door de rand met de pincet stevig te drukken, waarbij u ervoor zorgt dat u het glasvezelfilter niet drukt. Breng 30 milligram ashed Magnesiumoxide, naar een 20 milliliter glazen flacon, en plaats de PTFE envelop in de flacon. Breng vijf milliliter van een eerder bereid monster of standaard over in het flesje met de magnesiumoxide en de PTFE-enveloppe.En sluit onmiddellijk de flacon met een grijze butyl rubberstopper. Sluit vervolgens de flacon af met een aluminium dop. Schud de flesjes bij 150 RPM gedurende drie uur bij vier graden Celsius onder donkere omstandigheden.Verwijder hierna de aluminium dop en de butylrubberstopper uit elke flacon. Verwijder de PTFE-envelop uit elke flacon met behulp van punt eindigde pincet, en grondig spoelen van de envelop en de pincet met ionen uitgewisseld water. Veeg vervolgens de envelop en de pincet met afvegend papier en leg de envelop op vers veegpapier.Open de PTFE envelop met platte einde en puntige eindigde pincet in omgekeerde volgorde van de vouwen stappen. Met behulp van platte pincet, houd het perifere gebied van de glasvezel filter, waar het zwavelzuur wordt verondersteld te worden unabsorbed. En breng het over in een 11 millimeter schroefdop reageerbuis.Spoel de pincet met ionenuitgewisseld water en veeg ze af met afvegend papier. Voeg een milliliter ionenuitgewisseld water toe aan elke reageerbuis. Sluit de reageerbuizen met PTFE gevoerde schroefdoppen en laat ze minstens 30 minuten op kamertemperatuur staan, om de ammoniumcation volledig te ontwijken aan het glasvezelfilter.Open hierna de schroefdop, voeg twee milliliter van een eerder voorbereid persulfaat oxiderende oplossing reagens aan de reageerbuis, en sluit de buis stevig met een schroefdop, om verlies of verontreiniging tijdens de volgende stappen te voorkomen. Zet de reageerbuizen op een rek, wikkel ze in dubbelgelaagde aluminiumfolie en maak ze een uur rechtop bij 121 graden Celsius. Meng 100 milliliter steriele 40 millimol per liter fosfaatbuffer, en 100 milliliter steriele 30 millimol per liter glucose aseptisch.Voeg een glycerolvoorraad P.chlororaphis toe aan 200 milliliter van de fosfaatgebufferde glucoseoplossing, in een Erlenmeyer-kolf van 300 milliliter. En zuiveren met een ultra pure helium stroom voor een uur. Vervolgens, afzien van twee milliliter van een eerder bereide denitrifier suspensie in vijf milliliter flesjes.Dop elke flacon met een grijze butyl rubberen stop, en een aluminium sluiting. Vervang de Headspace-lucht door ultrazuiver helium, door drie minuten te stofzuigen en het helium één minuut op te laden. Stel de headspace gas positieve druk in op 1,3 atmosferen, om onbedoelde luchtverontreiniging te voorkomen.Injecteer een milliliter van een monster of standaard door de butyl rubberstopper, met behulp van een wegwerpspuit van één milliliter. Dan, incubeer de flesjes 's nachts op 25 graden Celsius, onder donkere omstandigheden. Injecteer de volgende dag 0,3 milliliter zes moedervlekken per liter natriumhydroxide om de denitrificatie te stoppen en de Headspace-kooldioxide op te nemen, wat anders de analyse van lachgas zal verstoren.Omdat kooldioxide en lachgas hetzelfde molecuulgewicht hebben. Bepaal de hoeveelheden lachgas met een moleculair gewicht van 44, 45 en 46, in het Headspace gas met behulp van quadrupole GC/MS met een aangepaste injectiepoort. De representatieve resultaten werden afgeleid van 15 stikstoftracering experimenten van kwelder sedimenten gemaakt van de 2011 Great East Japan Aardbeving in het maangebied van Kesennuma stad en Miyagi prefectuur, Japan.Voor alle sedimenten die in de subgetijden- en intergetijdenzones werden verzameld, werd een toename van de gelabelde ammoniumconcentratie gedurende de incubatieperiode waargenomen. De DNRA-tarieven lagen binnen het bereik van 24,8 tot 177. En zijn vergelijkbaar met waarden die in eerdere studies worden gerapporteerd, maar hoger dan waarden die zijn afgeleid van vergelijkbare omgevingen.De hoge DNRA tarief, kan worden verklaard door de kwelder wordt gebruikt als een teeltveld voor de aardbeving. In overeenstemming met de speculatie, de DNRA tarief in de intergetijdenzone, die rijk is en organische verbindingen in vergelijking met de subtidal zone, was hoger. Ons protocol is breed toepasbaar op de analyse van metabole trajecten, waarbij ammoniumvorming en N15-sporentoevoelingen betrokken zijn.

measurement-potential-rates-dissimilatory-nitrate-reduction-to

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

We demonstreren de extractie van ammonium uit een ammonium-rijke stroom met behulp van een elektrochemisch en een bio-elektrochemisch systeem. De reactoropstelling, werking en gegevensanalyse worden besproken.

Elektrochemisch en Bioelectrochemically Induced Ammonium Recovery

Ammoniakemissie zijn een grote bedreiging voor het milieu door vermesting, verzuring van de bodem en fijne deeltjesvorming en vloeien voornamelijk voort uit agrarische bronnen. Deze methode maakt het mogelijk ammoniak verlies metingen in gerepliceerd veldproeven op statistische analyse van de emissies en van de relaties tussen ontwikkeling en emissies gewas.

Geijkte Passive Sampling - Multi-plot Field Metingen van NH<sub&gt; 3</sub&gt; Emissies met een combinatie van Dynamic Tube Methode en passieve samplers

Hier presenteren we kleine kernincubaties voor de meting van gas- en opgeloste stofuitwisseling tussen sediment en water. Deze zullen betrouwbare metingen van de uitwisseling tussen sediment en water opleveren die de rol van sediment bij het beïnvloeden van biologische en biogeochemische processen in aquatische ecosystemen beoordelen.

De Benthische Uitwisseling van O<sub&gt; 2</sub&gt;, N<sub&gt; 2</sub&gt; En opgeloste voedingsstoffen Met behulp van kleine kern Incubaties

Stikstofmonoxide (NO) is een belangrijk signaalmolecuul bij vasculaire homeostase. NO-productie in vivo is te laag voor directe meting. Chemiluminescentie biedt nuttige inzichten in de NO-cyclus via het meten van zijn precursoren en oxidatieproducten, nitriet en nitraat. De bepaling van nitriet/nitraat in lichaamsweefsels en -vloeistoffen wordt uitgelegd.

Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode

Vorige werk suggereert dat de stikstofisotopische samenstelling van atmosferische stikstofoxiden de invloed van verschillende bronnen in het milieu zou kunnen onderscheiden. We rapporteren over een geautomatiseerde, mobiele, veldgebaseerde methode voor de hoge verzamelingsefficiëntie van atmosferisch NOx voor N-isotopische analyse met een uurlijkse tijdresolutie.

Geautomatiseerd, hoge-resolutie Mobile opvangsysteem voor de Stikstof isotopenanalyse van NO<sub&gt; x</sub

Ammoniak kan gesynthetiseerd worden bij lage druk met behulp van een conventionele katalysator en een selectieve absorberende van ammoniak.

Synthese van ammoniak bij lage druk

Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.

Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Deze methode maakt een schatting van sediment denitrificatie tarieven in sediment kernen met behulp van de acetyleen remming techniek en microsensor metingen van de geaccumuleerde N2O. Het protocol beschrijft procedures voor het verzamelen van de kernen, kalibreren van de sensoren, uitvoeren van de remming van acetyleen, meten de N2O accumulatie en berekening denitrificatie.

Schatten van Sediment denitrificatie tarieven met behulp van Cores en N2O Microsensors

Een microplot ontwerp voor 15N tracer onderzoek wordt beschreven om meerdere in-season plant en bodem bemonstering gebeurtenissen tegemoet te komen. Voor de analyse van 15 N worden bodem- en verwerkingsprocedures voor monsters, met inbegrip van slijp- en weegprotocollen, voor 15N-analyse naar voren gebracht.

Microplot Ontwerp en Plant en Bodem Monster Voorbereiding voor 15Stikstof Analyse

Hier presenteren we protocollen voor het detecteren van stikstofmonoxide en zijn biologisch relevante derivaten met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde assays met een hoge gevoeligheid.

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Leer DNRA-snelheden meten in kust- en mariene ecosystemen via N15-labeling en gaschromatografie-massaspectrometrie. Dit protocol verbetert het begrip van stikstofkringlopen in aquatische omgevingen.

Meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar Ammonium op basis van 14NH4+/15NH4+ Analyses via sequentiële conversie naar N2O (Video) | JoVE Journal

Meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar Ammonium op basis van ¹⁴NH₄⁺/¹⁵NH₄⁺ Analyses via sequentiële conversie naar N₂O

Meer video's verkennen