Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure
23 augustus 2019
We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel. hmpc's verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.
Het isoleren van de menselijke spiervererverzakt cellen die skeletspierregeneratie reguleren stelt ons in staat om processen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan het regeneratieve proces met behoud van donorvariabiliteit. Deze techniek maakt het mogelijk grote opbrengsten van menselijke spier voorloper cellen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel en hun fenotypische analyse met behulp van een klein aantal cellen. Deze methode is speciaal ontworpen om menselijke spiervererver voorloper cellen te isoleren om hun proliferatie en differentiatie mogelijkheden te volgen en om deze gegevens te relateren aan het skelet spier regeneratieve proces.
Het moeilijkste aspect van deze vrij eenvoudige techniek is ervoor te zorgen dat elke stap reproduceerbaar wordt uitgevoerd om de opbrengst en zuiverheid van de cellen te optimaliseren. Er zijn meerdere stappen die moeten worden voltooid voor een succesvolle isolatie van de cellen. Een aantal van de stappen zijn gemakkelijker te begrijpen als ze visueel worden waargenomen.
Om menselijke spiervererver cellen te isoleren van biopsieweefsel, plaats het spierweefsel in een steriele petrischaal onder steriele omstandigheden, en gebruik een steriele scalpel om het weefsel gehakt in een millimeter blokjes. Wanneer al het weefsel is gehakt, breng de stukken in een 15-milliliter buis met 10 milliliter PBS, en laat de weefsels te regelen door de zwaartekracht voordat zorgvuldig aspirating de supernatant zonder verstoring van het weefsel. Na het wassen van de fragmenten een tweede keer zoals net aangetoond, vervang de PBS met 10 milliliter van low-glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium.
Verwijder de supernatant nadat de weefsels zijn geregeld, en resuspend de stukken in drie milliliter van de spijsvertering medium. Plaats de weefsels op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, met trituratie van de spierfragmenten om de 10 minuten met een 1-milliliter serologische pipet. Voeg aan het einde van de incubatie 83 microliters extra verteringsmiddel en 24 microliter Dispase-oplossing toe aan de monsters en trituraat de weefsels om de vijf tot 10 minuten met een brede pipetpunt totdat een uniforme drijfmest is bereikt.
Een uniforme drijfmest is belangrijk voor maximaal herstel van de menselijke spiervererverkercellen. Zet de spijsvertering voort als de drijfmest niet door een standaard 1.000 microliter pipetpunt gaat. Om de Pax7-positieve cellen te isoleren, vlek en poort van de cellen volgens het protocol.
Sorteer de CD56, CD29 dubbele positieve menselijke spier voorloper cellen op een stroom cytometer met een 100-micrometer mondstuk bij een druk van 20 pond per vierkante inch in de collectie buizen met een 300-microliter kussen van fluorescentie geactiveerde cel sorteren buffer. Dan zaad de gesorteerde menselijke spier voorloper cellen in collageen-gecoate 24-well platen met voorverwarmde groeimedium op een 3,5 keer 10 tot de vierde cellen per centimeter kwadraat concentratie. Als u samenvloeiingsscans wilt uitvoeren, laadt u de plaat op een imaging cytometer en selecteert u Nieuwe scan maken en de plaatcategorie, plaatprofiel en plaat-ID.Under Application, selecteert u Samenvloeiing en Samenvloeiing 1 en selecteert u een bron om te bekijken.
Zoek een scherpstelvlak waarin de cellen wit lijken in vergelijking met de achtergrond en selecteer Handleiding registreren. Gebruik de muis om alle putten te markeren die moeten worden gescand en selecteer Scan starten. Het hele putgebied wordt automatisch gescand.
Selecteer de analyse-instellingen die optimaal zijn voor het plaat- en celtype en selecteer Analyse starten. Gebruik de beeldvorming cytometer om samenvloeiing in eerste instantie te meten. Dan om de cellen te tellen op de imaging cytometer, vervang het medium in elke put met 200 microliter kleuroplossing.
Vervang na 15 minuten bij 37 graden Celsius de kleuroplossing door 100 microliter verse Ham's F12. Geef de plaat terug naar de beeldvormingscytometer en selecteer onder Toepassing Cel levensvatbaarheid en Live Dead Total. Het Live-kanaal zal een helder-veld beeld, de Dead kanaal zal de propidium jodide vlekken tonen, en het Totale kanaal zal de Hoechst 33342 vlekken.
Klik onder Focusinstelling op Automatisch registreren. Stel onder het kanaal Totaal het kanaal in op blauw. Gebruik Focus zoeken om de kernen scherp te stellen en klik op Verschuiving instellen om de focus te selecteren.
Stel onder het Dode kanaal het kanaal in op rood en gebruik Focus zoeken om de dode cellen in beeld te brengen. Klik op Verschuiving instellen om de focus te selecteren en selecteer Scannen starten om de scan te starten. Selecteer vervolgens de analyseparameters die geschikt zijn voor het plaat- en celtype en selecteer Analyse starten om de analyse te starten.
Wanneer de analyse is voltooid, controleert u visueel of de analyse de cellen op de juiste wijze heeft geteld. Als de scan en analyse bevredigend zijn, breng de plaat terug naar de couveuse, anders opnieuw scannen of wijzigen van de analyseparameters. Menselijke spier voorloper cellen kunnen worden geïdentificeerd door de eerste gating gebeurtenissen op basis van de zijkant en voorwaartse verstrooiing gebied om dode cellen of puin te elimineren, gevolgd door het selecteren van alleen de cellen die negatief zijn voor 7-AAD en daarom levensvatbaar zijn.
De cellen die positief zijn voor zowel CD56 en CD29 cel oppervlak markers dan vertegenwoordigen de menselijke spier voorloper cel populatie. Menselijke spiervererver voorwaarde cellen kunnen ook worden geïdentificeerd door hun Pax7 expressie. Pax7 is immers verrijkt in de totale populatie na FACS en wordt onderhouden door middel van meerdere passages.
Hier wordt een representatieve samenvloeiingsscan getoond. De groene contouren werden gegenereerd door de imaging cytometer en laten zien hoe de imaging cytometer de samenvloeiing bepaald op basis van de geselecteerde analyse-instellingen. Een heterogeniteit en kern telt is gemeenschappelijk tussen donoren.
Het ontdekken en nauwkeurig karakteriseren van deze heterogeniteit is een belangrijke toepassing van de beeldvormingscytometer. De samenvloeiingsmetingen en kernentellingen van unieke donoren zijn echter sterk gecorreleerd. Menselijke spiervererver cellen gedifferentieerd tot myotubes te vormen kan worden onderscheiden door hun embryonale myosine zware keten expressie.
Het is belangrijk om consistent te zijn bij het selecteren van de gating parameters op de stroom cytometer om dezelfde populatie van cellen te isoleren van elke donor. Eenmaal geïsoleerd, menselijke spier voorloper cellen kunnen worden gebruikt voor meerdere doeleinden, met inbegrip van het identificeren van de unieke metabole eisen van proliferatie en differentiatie van menselijke spier voorloper cellen. De isolatie van menselijke spiervererver voorwaardecellen heeft toegestaan discriminatie van de verschillen in celoppervlak marker expressie op menselijke en muis spier voorloper cellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert technieken voor het isoleren en karakteriseren van humane primaire spierprogenitorcellen (hMPCs) uit skeletspierbiopsieweefsel. Deze methoden stellen onderzoekers in staat om de menselijke myogenese en skeletspierregeneratie te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Menselijke spierprogenitorcellen spelen een cruciale rol bij de regeneratie van skeletspieren.
- Het isoleren van deze cellen maakt het mogelijk om regeneratieve processen te bestuderen, rekening houdend met donorvariabiliteit.
- Technieken voor celisolatie moeten reproduceerbaar zijn om een optimale opbrengst en zuiverheid te garanderen.
- Visuele observatie van de isolatiestappen kan het begrip verbeteren.
Doel van de studie
- Om menselijke spierprogenitorcellen te isoleren voor onderzoek naar spierregeneratie.
- Om de proliferatie- en differentiatievermogens van deze cellen te analyseren.
- Om de bevindingen te relateren aan het algemene regeneratieproces van skeletspieren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van hMPC's uit skeletspierbiopsieweefsel.
- Karakterisering van de geïsoleerde cellen.
- Fenotypische analyse met behulp van kleine celhoeveelheden.
- Het volgen van proliferatie- en differentiatiecapaciteiten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hMPCs uit minimale weefselmonsters.
- Karakterisering van de cellen demonstreert hun potentieel voor onderzoeksapplicaties.
- De reproduceerbaarheid van de methode garandeert betrouwbare resultaten.
- Er wordt inzicht verkregen in het regeneratieve proces van skeletspieren.
Conclusies
- De gepresenteerde technieken zijn effectief voor het isoleren en bestuderen van hMPC's.
- Deze methoden kunnen het inzicht in spierregeneratie vergroten.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische toepassingen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
De isolatie en karakterisering van menselijke spierprogenitorcellen (hMPCs) uit skeletspierbiopten maken mechanistische risicoanalyse mogelijk bij de validatie van targets voor spierregeneratie. Deze aanpak ondersteunt fenotypische screening en assay-ontwikkeling door een ziekterelevante systematiek te bieden met donorheterogeniteit die de klinische variabiliteit weerspiegelt. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door de cellulaire expansiecapaciteit te koppelen aan regeneratieve uitkomsten in de skeletspier.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot regeneratiepaden van skeletspieren te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele validatie van hMPC-proliferatie en -differentiatie.
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door cellulaire fenotypes te koppelen aan regeneratieve processen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar systeem voor het prepareren van gevalideerde biologische monsters voor downstream screening.
- Operationele waarde: Maakt kwantitatieve metingen van confluentie en kernenaantallen mogelijk met behulp van imagingcytometrie voor assay-standaardisatie.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en hergebruik van platforms door consistente isolatie- en uitplaatprotocollen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterellevant systeem om de variabiliteit in expansiecapaciteit tussen donoren te bestuderen, wat bijdraagt aan de afstemming van translationele biomarkers.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de expressie van Pax7 en het differentiepotentieel van myotubes te behouden.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang door mechanismen te identificeren die ten grond liggen aan de heterogeniteit in regeneratief potentieel.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, door kwantificeerbare, donor-gestratificeerde cellulaire fenotypes te verschaffen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden door het mogelijk maken van het volgen van de proliferatie en differentiatie van geïsoleerde hMPC's.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde weefseldigestie, FACS-sortering en plating op met collageen gecoate platen.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve confluentiescans en kerntellingen die vergelijkingen tussen donoren en evaluatie van condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door het behoud van myogene differentiatiecapaciteit en expressie van embryonaal myosin heavy chain in gevormde myotubes.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare workflow voor isolatie en karakterisering die toepasbaar is op meerdere donorstalen en experimentele condities.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij doelwitvalidatie door de koppeling van cellulaire expansie aan regeneratief vermogen.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid van celopbrengst en zuiverheid via geoptimaliseerde digestie- en sorteerstappen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het mogelijk maken van donor-gestrateerde beoordeling van de functionaliteit van spierprogenitorcellen.
- Impact op portfolio: Risicogebaseerde prioritering van regeneratiedoelwitten met behulp van metrieken voor expansiecapaciteit die gebaseerd zijn op heterogeniteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van primair weefsel, flowcytometrie en imaging-cytometrie voor de isolatie en analyse van levensvatbare cellen.
- Afhankelijk van een steriele weefselkweekinfrastructuur, apparatuur voor fluorescence-activated cell sorting en geautomatiseerde imaging-platforms.
- Noodzaak tot standaardisatie van gating-protocollen voor CD56/CD29 en Pax7 tussen teams om een consistente identificatie van hMPC's over verschillende donoren te garanderen.
- Vereist aanpassingen rekening houdend met variaties in de kwaliteit van donorweefsel en de biopsiegrootte om de isolatie-efficiëntie te behouden.
- Praktische beperkingen omvatten donorafhankelijke variabiliteit in celopbrengst en expansiekinetiek, waardoor grotere steekproefgroottes nodig zijn voor statistische power.
