Name: Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer flowcytometrische analyse van mitochondriale ROS in muizen hematopoëtische stam- en voorlopercellen en MLL-AF9 leukemie. Deze methode meet reactieve zuurstofsoorten en evalueert genetische manipulatie-effecten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Fox Chase Cancer Center Raad van bestuur (DDM), de American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) en het Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).

Alle in dit protocol beschreven dier procedures zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) bij Fox Chase Cancer Center.
Opmerking: De protocol-workflow is verdeeld in 4 delen zoals weergegeven in Figuur 1 en de vereiste reagentia worden vermeld in de Inhoudsopgave.
1. scheiding van beenmerg (BM)
Opmerking: MLL-AF9 leukemie muizen werden gegenereerd zoals eerder beschreven11.
<ol><li>Herstel mono-nucleaire beenmergcellen, zoals eerder beschreven12,13,14,15, van wild type C57. Bl6 muizen (die de cd 45,2 congenic marker uitdrukken) en van C57. Bl6-SJL-muizen (die de CD 45,1 congenic marker uitdrukken) die zijn getransplanteerd met MLL-AF9-uitdrukken van leukemie cellen (CD 45,2+). Opmerking: BM kan bij muizen worden teruggewonnen door12,13 te breken of door botten te spoelen14,15. Voor de hier gepresenteerde experimenten werd BM hersteld van zowel gezonde als leukemie muizen via Flushing.</li>
</ol>2. mitochondriale ROS Fluorogenic kleurstof kleuring
<ol><li>Zodra mono-nucleaire beenmergcellen zijn teruggewonnen uit gezonde en/of leukemie muizen, vlek een hoeveelheid cellen met Trypan blauw en tellen met behulp van een hemocytometer om te bepalen van het beginaantal van de totale BM-cellen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en respendeer de pellet in F-PBS (PBS aangevuld met 2% foetaal runderserum en een 1% Penicileen/streptomycine cocktail) tot een concentratie van 2 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Aliquot 200 μL celsuspensie per buis in 9 eenkleurige bedienings buizen met het label als volgt: Geen vlek, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (alleen voor gezonde Hspc's), CD 45,2-APC (alleen voor leukemie cellen), CD34-FITC, mitochondriale ROS kleurstof en levende/dode cel vlek. Opmerking: Optionele Een positieve controle voor de inductie van mitochondriale ROS kan worden bereid door 2 x 105 cellen in 200 μL te behandelen met 20 ΜM Menadione natrium Bisulfite (MSB) voor 1 uur bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 . Een tweede controle om de door MSB gemedieerde inductie van mitochondriale ROS om te keren kan worden bereid door 2 x 105 cellen in 200 μL te behandelen met 20 ΜM MSB plus 100 μM N-acetyl-L-CYSTEÏNE (NAC) voor 1 uur bij 37 °c in een 5% Co2 -incubator.</li>
	<li>Aliquot de overblijvende cellen in een buis (experimentele buis) en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Respendeer de cellen in F-PBS met een levende/dode celvlek volgens de instructies van de fabrikant. Inincuberen op ijs gedurende 30 min. Zorg ervoor dat u Live/Dead Stain aan de eenkleurige controle buis toevoegt.</li>
	<li>Voeg 1,0 mL kamertemperatuur (RT) F-PBS toe aan zowel single-Color als experimentele buizen gekleurd met de Live/Dead kleurstof. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.</li>
	<li>Respendeer 50 μg van de mitochondriale ROS-kleurstof in 13 μL dimethylsulfoxide (DMSO) om een 5 mM stockoplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Verdun mitochondriale ROS-kleurstof tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM in RT F-PBS met of zonder verapamil (50 μM).</li>
	<li>Aspirate uit de Wash van de levende/dode cel vlek. Voeg 200 μL mitochondriale ROS kleurstof vlek met verapamil toe aan elke experimentele buis en de mitochondriale ROS Dye éénkleurige controle buis.</li>
	<li>Vortex te mengen en inbroed gedurende 10 min bij 37 ° c in het donker.</li>
	<li>Voeg 1,0 mL RT F-PBS toe aan de mitochondriale ROS-gekleurd besturingselement met één kleur en experimentele buizen. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.</li>
	<li>Zuig de supernatant uit en was de cellen met een extra 1,0 mL RT F-PBS. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.</li>
</ol>3. kleuring van Lineage-antilichamen
<ol><li>Bereid de in tabel 1vermelde cocktails met antilichamen voor. Opmerking: Deze antilichamen cocktails zijn eerder14,15,16geoptimaliseerd.</li>
	<li>Aspirate de supernatant van de laatste mitochondriale ROS Dye Wash van de experimentele buizen met gezonde BM en voeg 200 μL antilichaam cocktail #1 aan elke buis. Vortex om te mengen. Ook de single-Color besturings buizen voorbereiden. Inincuberen voor 60 min op ijs in het donker.</li>
	<li>Aspirate de supernatant van de laatste mitochondriale ROS Dye Wash van de experimentele buizen met leukemie BM en voeg 200 μL van de antilichaam cocktail #2 aan elke buis. Vortex om te mengen. Inincuberen voor 60 min op ijs in het donker.</li>
	<li>Was met 1,0 mL koude F-PBS en centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.</li>
	<li>Respendeer cellen in 500 μL koude F-PBS en filtreer de cellen in een flow cytometer-buis met behulp van een 40 μm-filter om aggregaten uit te sluiten.</li>
</ol>4. flow Cytometrie acquisitie en analyse
Opmerking: Verschillende hematopoietische stam-en voorlopercellen zijn zeldzaam, zoals op lange termijn hematopoietische stamcel. Zo moeten idealiter 3-5 miljoen gebeurtenissen worden verzameld voor elke experimentele buis tijdens flow cytometrie verwerving voor voldoende analyse van mitochondriale ROS in de verschillende HSPC-subsets.
<ol><li>Gebruik de No-Stain-bedienings buis om de spreidings plots (FSC-A) en Side (SSC-A) in te stellen op basis van de grootte en complexiteit van de geanalyseerde celpopulatie.</li>
	<li>Gebruik de buizen zonder vlekken en enkele kleuren om de flow cytometer te compenseren.</li>
	<li>Gate uit vreemd puin uit de voorwaartse en zijspreidings plot (Figuur 2A, B, eerste paneel van links).</li>
	<li>Poort uit wambuizen met een dubbele discriminator zoals de voorwaartse discriminator (Figuur 2a, B, tweede paneel van links).</li>
	<li>Volg de gating-strategie voorgesteld in afbeelding 2a,B om te selecteren van levende cellen, lineage lage cellen en de verschillende hspc en leukemie subsets.</li>
	<li>Analyseer voor elke populatie van belang de mediane fluorescentie intensiteit (MFI) van het TRPE-kanaal (x-as) in een histogram plot om de verschillen in het mitochondriale ROS-signaal te evalueren (Figuur 3a-C, linker panelen). Niveaus van mitochondriale ROS kunnen worden geëvalueerd op de single-cell niveau door het vergelijken van mitochondriale ROS kleuring versus specifieke Lineage markers in een Scatter plot.</li>
</ol>

<ol><li>Dröse, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li>
<li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li>
<li>Höhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Happily+%28n%29ever+after%3A+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress%2C+proteostasis+loss+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li>
<li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+inflammation%2C+and+cancer%3A+how+are+they+linked%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li>
<li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+cell+state+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).</li>
<li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li>
<li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li>
<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
<li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li>
<li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li>
<li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT%2FFOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776(2008).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li>
<li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Fluorogene kleurstoffen die zijn ontwikkeld voor de detectie van Ros worden vaak geëvalueerd in vaste cellen door microscopie of in levende cellen door flow flowcytometrieonderzoeken22. Flow cytometrische evaluatie van mitochondriale ROS in BM-cellen met behulp van mitochondriale ROS fluorogenic kleurstoffen heeft twee belangrijke voordelen: 1) het is een snelle en eenvoudige techniek die geschikt is voor Live-celanalyse en 2) het maakt het mogelijk om te onderscheiden en te analyseren zeldzame po...

Reactieve zuurstof soorten (ROS) zijn zeer reactieve moleculen afgeleid van moleculaire zuurstof. De meest goed gedefinieerde cellulaire locatie van ROS productie is de mitochondriën, waar elektronen die passeren de elektronentransport keten (ETC) tijdens oxidatieve fosforylering (OXPHOS) worden geabsorbeerd door moleculaire zuurstof die leidt tot de vorming van een specifieke type ROS genaamd Super oxiden1. Door de acties van een reeks enzymen, genaamd superoxide dismutases of sod's, worden super oxiden omgezet in waterstof peroxiden, die vervolgens worden geneutraliseerd in water door enzymen zoals katalase of glutathion peroxiasen (GPX). Verstoringen in ROS-regelgevende mechanismen kunnen leiden tot de overtollige productie van ROS, vaak aangeduid als oxidatieve stress, die schadelijke en potentieel dodelijke cellulaire gevolgen zoals Macromolecuul schade hebben (dat wil zeggen, DNA, eiwitten, lipiden). Bovendien is oxidatieve stress gerelateerd aan verschillende pathologieën, zoals diabetes, ontstekingsziekten, veroudering en tumoren2,3,4. Te handhaven redox homeostase en oxidatieve stress te voorkomen, cellen bezitten een verscheidenheid van ROS-regulerende mechanismen5.
Fysiologische niveaus van bepaalde ROS zijn noodzakelijk voor goede embryonale en volwassen Hematopoiesis6. Echter, overtollige ROS wordt geassocieerd met DNA-schade, cellulaire differentiatie en uitputting van het hematopoietische stam en voorlopercellen pool. Er is ook bewijs dat veranderingen in redox biologie kunnen verschillen tussen leukemie en gezonde cellen. Bijvoorbeeld, Ros niveaus neigen te zijn hoger in acute myeloïde leukemie (AML) cellen ten opzichte van hun gezonde tegenhangers en andere studies hebben gesuggereerd dat leukemie stamcellen een lage steady-state niveau van Ros voor overleving7,8behouden. Belangrijk, strategieën voor therapeutisch kapitaliseren op deze redox verschillen hebben aangetoond belofte in verschillende menselijke kanker instellingen9,10. Daarom, assays die het mogelijk maken voor de beoordeling van ROS niveaus in muismodellen kunnen verbeteren ons begrip van hoe deze soorten bijdragen aan cellulaire fysiologie en ziekte pathogenese, alsmede mogelijk bieden een platform voor de beoordeling van de effectiviteit van nieuwe redox-gerichte anti-kankertherapieën.

<table><tbody><tr><td>Heat inactivated FBS</td><td>VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td><td>97068-085</td><td>Media</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>Media</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>BD falcon</td><td>352096</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>BD falcon</td><td>352098</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>40 &mu;m cell strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-9751</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Menadione sodium Bisulfite</td><td>Sigma aldrich</td><td>M5750</td><td>Pro-oxidant</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma aldrich</td><td>A7250</td><td>Anti-oxidant</td></tr><tr><td>CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11</td><td>Biolegend</td><td>100310</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD4 PE-Cy5 clone RM4-5</td><td>eBioscience</td><td>15-0041-81</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7</td><td>eBioscience</td><td>15-0081-81</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy5 clone 6D5</td><td>Biolegend</td><td>115510</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103210</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108410</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119</td><td>Biolegend</td><td>116210</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD48 PE-Cy5 clone HM48-1</td><td>Biolegend</td><td>103420</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD117&nbsp; APC-Cy7 clone 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105825</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>Sca1 peacific Blue clone D7</td><td>Biolegend</td><td>108120</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD150 APC clone TC15-12F12.2</td><td>Biolegend</td><td>115909</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD34 FITC clone RAM34</td><td>BD Bioscience</td><td>553733</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>CD45.2 APC clone 104</td><td>Biolegend</td><td>1098313</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td>Dye</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Dye</td></tr><tr><td>Live/dead Yellow Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34967</td><td>Dye</td></tr></tbody></table>

flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en mll-af9 gedreven leukemie

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We presenteren een flowcytometrische benadering voor het analyseren van mitochondriale ROS in diverse levende beenmerg (BM)-afgeleide stam-en voorlopercellen van gezonde muizen en muizen met AML aangedreven door MLL-AF9. Specifiek beschrijven we een tweestapskleurings proces, waarbij gezonde of leukemie BM-cellen eerst worden gekleurd met een fluorogene kleurstof die mitochondriale Super oxiden detecteert, gevolgd door kleuring met met fluorochrome verbonden monoklonale antilichamen die worden gebruikt verschillende gezonde en kwaadaardige hematopoietische voorlopercellen te onderscheiden. We bieden ook een strategie voor het verwerven en analyseren van de monsters door flow Cytometry. Het gehele protocol kan worden uitgevoerd in een tijdsbestek van slechts 3-4 h. We markeren ook de belangrijkste variabelen om te overwegen, evenals de voordelen en beperkingen van het bewaken van ROS productie in het mitochondriale compartiment van levende hematopoietische en leukemie stam en voorlopercellen subpopulaties met behulp van fluorogenic kleurstoffen doorstroming cytometrie . Bovendien presenteren we gegevens die mitochondriale ROS overvloed varieert tussen verschillende gezonde HSPC subpopulaties en leukemie voor ouders en bespreken de mogelijke toepassingen van deze techniek in hematologisch onderzoek.

Gepresenteerd is een methode voor het analyseren van ROS in de mitochondriën van meerdere gezonde en MLL-AF9-uitdrukken leukemie populaties. Figuur 1 geeft een schematische weergave van de protocol workflow, die bestaat uit 4 belangrijke stappen: 1) BM-isolatie van muizen; 2) kleuring BM-cellen met een fluorogenic kleurstof die mitochondriale ROS herkent, met name Super oxiden; 3) oppervlak marker antilichaam kleuring te afbakenen verschillende gezonde en leukemie hematopoietische populaties...

We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Reactieve zuurstofsoorten of ROS, zijn zeer reactieve zuurstofsoorten die worden geproduceerd door cellen, en beïnvloedt hun gedrag. Hoewel overtollige ROS kan ook leiden tot wijdverbreide cellulaire ravage, en in ernstige gevallen, celdood. Zo is het behoud van ROS homeostase van fundamenteel belang voor cellulaire functie en overleving.Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, richt zich op het meten van een specifiek type ROS, dat wordt gegenereerd door mitochondriën, voornamelijk als een metabolisch bijproduct in levende, normale of gezonde hematopoietische stam- en voorlopercelpopulaties, evenals in leukemiecellen uit het muismodel van bloedkanker, Acute Myeloïde Leukemie of AML. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te evalueren hoe genetische manipulatie, zoals gendesletie of overexpressie, invloeden mitochondriale ROS in verschillende gezonde en kwaadaardige hematopoietische populaties. En als gevolg daarvan, potentieel inzichtelijke informatie over redux staat en eventueel het metabolisme van de cellen.Deze techniek machtigt flow regelen metrische analyse van een protogene sonde te controleren mitochondriale ROS productie in levende gezonde en kwaadaardige hematopoietische stengel en voorvader subpopulaties. Dit protocol is eenvoudig en kan in een paar uur worden voltooid. Bovendien is het geschikt voor live celanalyse en maakt het mogelijk om mitochondriale ROS in stamcelpopulatie in het beenmerg te onderscheiden en te analyseren, met behulp van oppervlaktemarkering van kleuring.Na het verzamelen van mononucleaire beenmergcellen van wilde strakke muizen en leukemische MLL-AF9 muizen, volgens het manuscript, aliquot 200 microliters van de cel suspensie in elk van de negen enkele kleuren controle buizen. Aliquot de resterende cellen in andere experimentele buizen, 200 microliters elk. Plaats vervolgens in een centrifuge twee experimentele buizen met beenmergcellen en leukemische cellen, en een controlebuis.Centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten. Vervolgens decanteren de supernatant, en opnieuw op te schorten de cellen in kamertemperatuur F-PBS met een levende / dode cel vlek, volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.Voeg daarna 1 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de drie levende/dode gekleurde buizen en één enkele kleurcontrolebuis voor mitochondriale ROS-kleurstof. Plaats de buizen in de centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Dan, verkrijg een 5 millimolar mitochondriale ROS kleurstof voorraad oplossing door opnieuw schorsing van 50 microgram mitochondriale ROS kleurstof in 13 microliters van DMSO.Voeg vervolgens 13 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de 13 microliter mitochondriale ROS-kleurstof om te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolar. Voeg indien nodig 13 microliter van 50 millimolar Verapamil toe aan de oplossing om mitochondriale effluxpompen te remmen. Haal de buizen uit de centrifuge en aspirate uit de was van de levende / dode cel vlek.Voeg 200 microliters F-PBS toe in de live/dode kleuringscontrole en houd het in ijs tot het klaar is om de analyse te starten. Voeg 200 microliters van de mitochondriale ROS kleurstofvlek met Verapamil toe aan elke experimentele buis, evenals de mitochondriale ROS-kleuringsbuis. Vortex te mengen en uitbroeden gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius in het donker.Voeg vervolgens 1 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de besturing en experimentele buizen. Vijf minuten centrifugeren bij 300 keer G bij kamertemperatuur. Aspirate uit de supernatent en was de cellen met een extra een milliliter kamertemperatuur F-PBS.Centrifuge opnieuw gedurende vijf minuten op 300 keer G, bij kamertemperatuur. Bereid eerst twee antilichaamcocktails voor gezonde en leukemie beenmergcellen. Aspirate de supernatant uit de experimentele buis met gezonde beenmergcellen, en voeg 200 microliter van de antilichaam cocktail nummer een aan de buis.Vortex om te mengen. Bereid ook de single color control tubes voor door 200 microliters van F-PBS en één microliter van het bijbehorende antilichaam toe te voegen. 60 minuten incuberen op ijs in het donker.Aspirate de supernatant uit de experimentele buis met leukemie beenmerg, en voeg 200 microliters van de antilichaam cocktail nummer twee, aan de buis. Vortex om te mengen. 60 minuten incuberen op ijs in het donker.Daarna was je alle buizen met 1 milliliter koude F-PBS en centrifuge vijf minuten bij 300 keer G bij kamertemperatuur. Schort de cellen opnieuw op in 500 microliter koude F-PBS. Breng de celsuspensie over in elke stroomcytometerbuis met een filter van 40 micrometer voor het uitsluiten van aggregaten.Plaats eerst een geen vlek controle buis in de stroom cytometrie machine en start de overname om de stroom cytometrie machine te compenseren. Herhaal dit voor andere controlebuizen. Lees daarna de experimentele buizen om de poorten op te zetten.Als u de grootte en complexiteit van de celpopulatie wilt analyseren, stelt u eerst voor een gezonde HSPC het voorwaartse spreidingsgebied in en stelt u populaties van het gebied voor spreidingsgebied in. Druk op de Square Gate-knop, om vreemde brokstukken van het voorste en zijverstrooiende perceel te verwijderen. Dan, op een voorwaartse strooigebied en hoogteperceel, gebruik een dubbele discriminator om doubletten uit te gate.Selecteer levende cellen, afstamming lage cellen, en de verschillende gezonde HSPC. Voor elke populatie van belang, analyseren van de mediane fluorescentie intensiteit van het TRPE-kanaal in een histagram plot, om verschillen in de mitochondriale ROS signaal te evalueren. Herhaal dezelfde procedure van grootteanalyse, gating en histogram plotten voor leukemiepopulaties.Beenmergcellen geïsoleerd van gezonde muizen werden gekleurd met een levende / dode kleurstof en een mitochondriale ROS kleurstof, en vervolgens gekleurd met antilichamen herkennen afstamming markers: plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 en CD150. Bovendien werden beenmergcellen van leukemiemuizen ook bevlekt met CD45.2 om onderscheid te maken tussen MLL-AF9 leukemiecellen van gezonde beenmergcellen met cd45.1. Een vergelijking van mitochondriale ROS kleuring, tussen gezonde CD48 negatieve LSK, en myeloïde voorlopers, toont aan dat myeloïde voorlopers aanzienlijk hogere niveaus van mitochondriale ROS kleuring vertonen.Bovendien, c-Kit hoge leukemie voorlopers vertonen aanzienlijk hogere niveaus van mitochondriale ROS kleuring, in vergelijking met c-Kit intermediaire lage leukemie cellen, gezonde CD48 negatieve LSK en myeloïde voorlopers. C-Kit intermediaire lage leukemiecellen, ook weergegeven een aanzienlijk hogere waarde in vergelijking met CD48 negatieve LSK cellen, maar niet aan myeloïde voorlopers. Mitochondriale ROS-kleurstoffen zijn zeer reactief en passende wasstappen zijn nodig om ervoor te zorgen dat een overmaat aan de kleurstof is verwijderd voordat u met de volgende stappen begint.Er zijn verschillende chemisch verschillende ROS fluorogene kleurstoffen die kunnen worden gebruikt in dit protocol, om een beetje kennis van de redux status in levende hematopoietische cellen te bereiken. Deze techniek is op grote schaal gebruikt in de literatuur, en kan nuttige inzichten geven over de metabole en signalering trajecten die differentieel zijn geregeld in leukemie cellen, in vergelijking met hun normale tegenhangers.

flow-cytometric-analysis-mitochondrial-reactive-oxygen-species-murine

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Het manuscript geeft een technische procedure die kan worden gebruikt om C1498 celkweken karakteriseren in vitro en acute leukemie geïnduceerd in muizen na de injectie. Fenotypische en functionele analyses worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie, immunofluorescentie microscopie, cytochemie en May-Grünwald Giemsa kleuring.

Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige uitdrukking van leukemie stamcel merkers op primaire acute myeloïde leukemie cellen door stroom cytometry. We laten zien hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts.

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Xenobiotic Efflux pompen zijn zeer actief in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) en veroorzaken extrusie van TMRM, een mitochondriale membraan potentiële fluorescerende kleurstof. Hier presenteren we een protocol om het mitochondriale membraan potentieel in Hspc's met TMRM nauwkeurig te meten in aanwezigheid van verapamil, een effluxpomp remmer.

Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.

Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

Leer flowcytometrische analyse van mitochondriale ROS in muizen hematopoëtische stam- en voorlopercellen en MLL-AF9 leukemie. Deze methode meet reactieve zuurstofsoorten en evalueert genetische manipulatie-effecten.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie (Video) | JoVE Journal

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

Meer video's verkennen