Karakterisering van eiwitten door grootte-uitsluiting chromatografie gekoppeld aan multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS)

SEC-MALS is een kwantitatieve methode voor het bepalen van het molecuulgewicht, de grootte en de conformatie van macromoleculen in oplossing. Het kan oligomers en complexen identificeren en moeilijke monsters karakteriseren, zoals glycoproteïnen en membraaneiwitten. SEC-MALS is een absolute methode.

Het is afhankelijk van fundamentele fysica, en is niet afhankelijk van samenwerking tegen moleculaire normen, de conformatie van het molecuul, of hoe we omgaan met het scheidingsmedium. SEC-MALS kan worden toegepast op vele systemen die worden gescheiden door sec. Van peptiden en kleine polymeren tot eiwitten, nucleocapsids, polysaccharides, synthetische polymeren, virusachtige deeltjes en kleine virussen.

Het is belangrijk om te controleren of uw systeem en buffers de aanbevelingen van de leverancier voor een laag deeltjesgehalte missen. Raadpleeg voor de zekerheid contact met de medewerker van de technische ondersteuning van de leverancier. Begin deze procedure met de voorbereiding van het SEC-MALS-systeem zoals beschreven in het tekstprotocol.

Bereid met behulp van elke PLC-grade reagentia een liter fosfaatgebufferde zoutoplossing voor met 50 tot 100 millimolar natriumchloride. Filter de buffer op 0,1 micron met behulp van een gebotteld polyether cel schuim filter, of iets dergelijks. Filter de eerste 50 tot 100 milliliter buffer naar een afvalfles om de deeltjes uit de droge filters te verwijderen.

Vervolgens filtert u de rest op een schone, steriele fles die eerder is gewassen met gefilterd, gedeïoniseerd water en bewaard om te voorkomen dat stof binnenkomt. Spoel de kolom 's nachts door met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut om de kolom in de buffer te equiliberen en deeltjes te verwijderen. Gebruik de continue stroommodus van de FPLC en zorg ervoor dat de stroom niet stopt totdat alle SEC-MALS-runs zijn voltooid.

Plaats de DRI-stroomcel in de zuiveringsmodus tijdens de nachtelijke flush. Bij het starten van de flush, geleidelijk oprit van de stroomsnelheid om te voorkomen dat de kolom vergieten effect, veroorzaakt door een plotselinge verandering van druk in de kolom. Schakel de zuivering uit voordat het voorbeeld wordt uitgevoerd.

Controleer de netheid van het systeem door licht op de slang stroomafwaarts van de kolom te tikken om opgehoopte deeltjes vrij te geven. Let op het signaal in de 90 graden detector op het voorpaneel display van het MALS-instrument. Controleer of het piek-tot-piekgeluid niet meer dan 50-100 microvolts is.

Controleer ook of de brekingsindex, of RI-signaal, stabiel is tot minder dan 1 keer tien tot de min zeven brekingsindex-eenheden. Voer een blanco injectie uit om te controleren of de injector schoon is van deeltjes. Een blanco is gewoon de lopende buffer bereid in een verse, steriele flacon.

Als de deeltjespiek niet meer dan één milliliter in volume is, en niet meer dan vijf millivolt boven de basislijn, dan is het systeem klaar voor monsters. Voer anders extra blanco injecties uit totdat ze schoon zijn, of voer onderhoud uit om de injector schoon te maken. Nu, bereid ten minste 200 microliter BSA op een tot twee milligram per milliliter in de SCC buffer.

Filter het eiwit op 02 micron, met behulp van een spuittipfilter. Gooi de eerste paar druppels filtraat weg om deeltjes uit de droge filters te verwijderen. Als alternatief, centrifugeren het monster op 10.000 keer G gedurende vijftien minuten om neerslag van niet-oplosbare aggregaten en andere grote deeltjes mogelijk te maken.

Injecteer vervolgens 100 microliter van de BSA-oplossing in de lus. Open nieuw experiment vanuit de methode in het MALS-softwaremenu. Selecteer vervolgens de onlinemethode in de map met methoden voor lichtverstrooiingsinstallaties.

Als er een DLS-detector aanwezig is, selecteert u de onlinemethode in de lichtverstrooiing met de QELS-map. Stel parameters in van het voorbeeld en de mobiele fase in de configuratiesectie. Stel in de algemene pompweergave de stroomsnelheid in op die in de FPLC.

Navigeer vervolgens naar de algemene pompweergave, oplosmiddeltak, naamveld en selecteer PBS. Voer in de injectorweergave de voorbeeldbranch in de naam BSA in. Stel dn/dc in op 0,185, stel A2 in op 0 en stel de UV-extinctiecoëfficiënt in op 0,667 milliliter per milligram centimeter.

Schakel in de sectie procedures de basisverzamelingsweergave in om de trigger van het selectievakje automatisch te injecteren. Stel de duur van de run in op 70 minuten, zodat gegevens worden verzameld voor de gehele toespeling, totdat het totale permeatievolume van de SEC-kolom is bereikt. Start het experiment in de MALS-software door op de run-knop te klikken.

Het zal beginnen met het lezen van de gegevens na ontvangst van het pulssignaal van het FPLC-instrument via de MALS-detector. Nul het DRI-signaal door op de auto-zero-knop op het voorpaneel van het instrument te klikken. Werken in de FPLC-software, navigeren naar handmatige, handmatige instructies uit te voeren, merk, en voeg de naam van het eiwit en de run.

Schakel de injectieklep van handmatige belasting te injecteren, onder de stroom pad, injectieklep. Neem een pulssignaal op door een puls van 0,5 seconde onder IO-boxpuls digitaal uit te voegen. Dit zal leiden tot het verzamelen van gegevens in de MALS-software.

Injecteer het monster in de lus. Klik op uitvoeren in de FPLC-software om de experimentrun te starten. Voer de analyse stap voor stap uit, volgens de sectie procedures in de MALS-software.

Controleer of pieken worden weergegeven op ongeveer hetzelfde zinspelingsvolume in UV, MALS en RI door de basisverzamelingsweergave te controleren. Definieer in de basislijnweergave de basislijn voor alle signalen. Definieer in de toppenweergave de pieken die moeten worden geanalyseerd door op de muis te klikken en te slepen.

Selecteer de centrale 50% van elke piek. Selecteer eerst de monomeerpiek en vervolgens de dimerpiek. Controleer onder elke piek de juiste waarden van dn/dc en uitstervingscoëfficiënt op 280 nanometer voor BSA.

Selecteer in de uitlijningsweergave in de uitlijningsweergave het centrale gebied van de pieken door op de muis te klikken en te slepen. Klik op signalen uitlijnen en vervolgens in orde. In de procedures, band verbreding uitzicht, kies de centrale 50% van de monomeer piek.

Controleer of de brekingsindexdetector is opgegeven als referentie-instrument. Klik vervolgens op Fit presteren en breng aan om de UV- en lichtverstrooiingssignalen aan te passen aan het brekingsindexsignaal. Zoom in op de pieken om te controleren of ze elkaar zeer nauw overlappen binnen de centrale 50 tot 70%en klik vervolgens op oke.

Selecteer in de procedure, normalisatieweergave, piek. Voer 3,0 nanometer in als de RG-waarde, klik op normaliseren en klik vervolgens op oke. Bekijk de grafiek van de resultaten in de EASI-grafiekweergave.

Selecteer de molaire massa in de display drop down aan de bovenkant van het venster. Gebruik het besturingselement, klik en sleep om in te zoomen op het piekgebied. Als u de uiteindelijke getabuleerde gewichtsgemiddelde resultaten voor de monomeer- en dimerpieken wilt bekijken, navigeert u naar piekresultaten, molaire massamomenten, MW en selecteert u de resultaten, rapportsamenvatting.

Zuiverheid wordt gemeld onder piekresultaten, massafractie. Selecteer opslaan als methode in het bestandsmenu en sla de geanalyseerde BSA-gegevens op als standaardmethode voor toekomstige metingen van alle soorten eiwitten. De normalisatie en bandbreedte parameters bepaald voor BSA zal worden overgedragen in de analyse.

Hier worden SEC-MALS-analyses van BSA weergegeven, met behulp van een 200 Angstrom porie grootte uitsluiting kolom. Chromatogramsporen worden genormaliseerd naar de monomeerpiek en worden gecompenseerd voor helderheid. Veelvoorkomende artefacten die kunnen worden genegeerd, worden opgemerkt, waaronder een deeltjespiek in de buurt van het begin van het lichtverstrooiingssignaal, evenals zout en opgeloste luchtpieken in de buurt van het totale permeatievolume in het brekingsindexsignaal.

Het chromatogram vertoont een uitstekende monomeer-dimer-trimer scheiding, en het licht verstrooiingssignaal vertoont een hoog signaal naar ruis. De gemiddelde molaire massawaarden van de monomeer en het dimergewicht vertonen een hoge homogeniteit. Hier zijn voorbeelden van lage kwaliteit SEC-MALS analyses.

In dit voorbeeld resulteert onvoldoende scheiding op een 75 Angstrom porie grootte uitsluiting kolom resulteert in een deeltjespiek tussen acht tot negen minuten, die niet goed gescheiden is van de eiwitten. Hier is er een onvoldoende signaal naar ruisverhouding, en uitgebreide deeltjes grenzend aan de eiwitten zijn zichtbaar in het lichtverstrooiingssignaal. De sleutels tot goede SEC-MALS resultaten zijn het selecteren van een geschikte kolom, ervoor te zorgen dat het systeem is gekalibreerd met weinig licht verstrooiingsgeluid, en pre-filtering of centrifuging de monsters om deeltjes te verwijderen.

Na SEC-MALS kunnen eiwitmonsters verder worden geanalyseerd op bindingsaffiniteit, bioliza, oppervlakteplasmon resonantie, isothermale titratiecalorimetrie, bioleroïde phorometry, microschaal thermoforese of samenstellinggradiënt, multi-angle lichtverstrooiing. De eiwitstructuur kan worden bepaald door x-ray kristallografie, cryo-elektronen miscroscopie, of NMR.