Het bestuderen van organelle dynamica in B-cellen tijdens immuun Synapse vorming

In deze review bespreken we zowel beeldvorming als biochemische technieken die worden gebruikt om organellepositionering en -samenstelling te bestuderen, evenals cytoskeletonherschikkingen die worden waargenomen tijdens de vorming van een immunologische synaps. In de beginfase van de actieve verbouwing kunnen B-cellen hun celoppervlak verhogen en de hoeveelheid antigeen BCR-complexen die bij de synaps worden verzameld, maximaliseren. Aan de andere kant kan lokale rekrutering van lysosomen, samen met het centrosome op het synaptische membraan, worden gekoppeld aan lyssome secretie, waarvan bekend is dat het de extractie van geïmmobiliseerde antigenen vergemakkelijkt.

Uptaken antigeen wordt verder verwerkt binnen endolyssom zoossige compartimenten in peptiden, die worden geladen op MHC klasse II moleculen voor presentatie aan T helper cellen. Daarom is het bestuderen van organelledynamica geassocieerd met de immuunsynaps cruciaal om te begrijpen hoe B-cellen volledig worden geactiveerd. Immunofluorescentie van B-cellen geactiveerd met geïmmobiliseerd antigenen stelt ons in staat om verschillende celcomponenten te volgen en hoe ze kunnen worden aangeworven voor de immuunsynaps.

B-cellen kunnen worden geactiveerd door geïmmobiliseerde antigenen op een kraaloppervlak of een coverslipoppervlak. Antigen-gecoate kralen worden bereid door het uitbroeden van specifieke liganden met amino-kralen eerder behandeld met glutaraldehyde om aminogroepen te activeren. Resuspend geactiveerde kralen in 100 microliter van PBS en vortex.

Bereid ondertussen de antigeenoplossing voor door 100 microgram per mL BCR-ligand toe te voegen in 150 microliter PBS. Voeg vervolgens 50 microliter geactiveerde kralen toe aan de antigeenoplossing en broeder 's nachts bij vier graden Celsius. Vergeet niet, ook gebruik maken van een niet-gerelateerde ligand als negatieve controle.

Na incubatie, was kralen met PBS. Aspirate de supernatant en vervangen door PBS. Herhaal dit drie keer.

Vervolgens blokkeren de drie aminogroepen door geresuspended kralen in 500 microliter van een oplossing van BSA. Tot slot, resuspend kralen in 70 microliter van PBS. Om de uiteindelijke concentratie te berekenen, u een hemocytometer gebruiken om de kralen te tellen.

Gebruik voor B-celactivering een buis van 50 mL en resuspend cells tot een concentratie van 1,5 miljoen per mL in CLICK, aangevuld met 5%foetaal runderserum. Voeg vervolgens 150.000 B-cellen toe, wat overeenkomt met een 100 microliter van het celkraalmengsel aan een poly-L-lysine-gecoate coverslip ad incubate bij 37 graden voor de verschillende tijdstippen. Een tweede benadering om B-cellen te activeren is ze op antigeengecoate coverslips te zaaien.

Hiervoor worden vachtglijbanen met anti-BCR en B220 met de celhechting verbeterd. Bereid de antigeenoplossing voor door anti-BRC en B220 in PBS toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 10 microgram per mL en 0,5 microgram per mL. Stel vervolgens de coverslip over een deksel van 24 put plaat bedekt met parafilm film en voeg 40 microliter antigeen oplossing.

Sluit de plaat af en broed dan 's nachts uit op 4 graden. Om de activering in coverslip te starten, eerst wassen met PBS en laat ze drogen voor een paar minuten. Voeg vervolgens 150.000 B-cellen toe en incubeer op 37 graden voor de verschillende tijdstippen.

In beide gevallen raden we aan om bij het activeren van kralen of met antigencoated dia's te beginnen met het langste tijdspunt en vervolgens door te gaan naar de kortere. Zodra u de droge coverslip op de microscoopdia hebt gemonteerd, u een epifluorescentie of een confocale microscoop gebruiken om uw monsters te bekijken, afhankelijk van de resolutievereisten. Focus het monster met behulp van het uitgezonden licht.

U moet zoeken naar velden waar cellen en kralen op één en één verhouding interageren. Voor B-cellen geactiveerd op met antigeen bedekte coverslips, gebruik de 100x doelstelling voor een betere resolutie. Voor parameters u overwegen een z-stack te nemen die de hele cel bedekt.

U actin labelen om de onder- en bovengrenzen van de cel af te bakenen. Voor B-cellen geactiveerd met antigencoated kralen en label het voor organellen beperkt tot een punt, eerst afbakenen twee gebieden: de cel gebied en de kraal gebied. Identificeer vervolgens de positie of de organelle per punt en verkrijg de lokalisatiecoördinaten.

Teken twee vectoren: één tussen het celcentrum en de organelle en andere tussen het celcentrum en het kraalcentrum. Meet de lengte van beide en meet de hoek tussen de twee vectoren, nu alpha genoemd. Maak een projectie met de vector tussen het centrosome en het celcentrum met behulp van de Guassian van alfa en bereken vervolgens de polariteitsindex van de organelle door de geprojecteerde vector, a, door b te delen.

Aldus wijst een polariteitsindex tussen nul en één op een gepolariseerd fenotype. Waarden tussen nul en min één geven een niet-gepolariseerd fenotype aan. Om de polariteitsindex te bepalen voor meer verspreide organellen, zoals lysosomen, u hetzelfde algoritme gebruiken dat eerder is genoemd, waarbij de organellelokalisatiecoördinaten voor de coördinaten van de labels van het massacentrum worden gewijzigd, in dit geval lysosomen.

Net als bij de eerder beschreven analyse duidt een polariteitsindex tussen nul en een op een gepolariseerd fenotype, terwijl waarden tussen nul en min een niet-gepolariseerd fenotype aangeeft. Om de hoeveelheid van elke organelle die nauw wordt aangeworven voor de nieuwe synaps te kwantificeren, u het percentage van de organellefluorescentie bij de kraal berekenen. Hiervoor moet u de bead- en celgebied afbakenen, de respectieve fluorescentieintensiteit meten en vervolgens de kraalfluorescentie verdelen door de som van de kraal en de celfluorescentie.

U krijgt de hoeveelheid van elke organelle die in contact is met de nieuwe synaps. U ook een rechthoek tekenen tegenover de kraal. Gebruik een gewicht dat overeenkomt met een kwart van de cellengte, meet vervolgens de fluorescentieintensiteit binnen de rechthoek en deel het door de totale fluorescentie.

Dit algoritme zal altijd om het percentage van de organelle te verkrijgen dat dicht bij de nieuwe synaps ligt, maar niet noodzakelijkerwijs in direct contact met de interface. Om de centrosome-geassocieerde componenten in rust- en geactiveerde B-cellen te kwantificeren. Kortom, we bepalen drie parameters.

Het cel- en kraalgebied en de centrosomale lokalisatie coördineert. Vervolgens definiëren we een cirkel rond het centrosome en voeren we een radiale profielanalyse uit vanuit het midden van het eerder gedefinieerde centrosome. Zodra u het perceel, bepalen de straal waarop 70% van de maximale fluorescentie wordt gehandhaafd.

Gebruik deze straal om een cirkel rond het centrosome te tekenen. Ten slotte, verkrijg fluorescentiedichtheid van de component van belang op het centrosome gebied en het celgebied, en verdeel beide waarden om de fluorescerende dichtheidsverhouding te verkrijgen. Om de verdeling van organellen op de immuunsynapsinterface te meten, moet u eerst het gebied van de B-cellen identificeren dat in contact komt met de met antigencoate coverslip.

U actin labelen om u te helpen dit gebied te definiëren. Meet vervolgens het gebied dat in contact komt met de dia, de hoogte en de breedte van de cel. Het gebied dat naar de antigen-gecoate dekkingslip wordt gericht is een meting van de cel B die zich bij de activering van de cel van B uitspreidt.

Gebruik de hoogte- en breedtewaarden om een centraal gebied in de cel af te bakenen, dat met een kwart van de hoogte en de breedtewaarden van de grenzen wordt gescheiden. Gewoonlijk komen deze overeen met ongeveer een derde van het totale celgebied. Bereken ten slotte de rekrutering van organelles in het midden van de nieuwe synaps, waarbij de fluorescentiedichtheid in het centrale gebied wordt gedeeld door de fluorescentiedichtheid van de hele cel.

Positieve waarden van deze index wijzen op een organelleverrijking in het midden van de nieuwe synaps. Negatieve waarden wijzen daarentegen op een perifere verdeling. Om de verdeling van organellen over de z-vlakken van B-cellen geactiveerd op antigeengecoate coverslips te meten, u eerst de synaptische interface en de bovengrens van de cel afbakenen.

Teken vervolgens een lijn over het celcentrum en maak de afbeelding opnieuw in stukken om een XZ-afbeelding te verkrijgen. Meet het hoofd van de cel en verdeel het beeld in 10 fracties van hetzelfde gebied, van de immuunsynaps tot de bovengrens van de cel. Meet de fluorescentie in elke z-fractie en bereken het percentage fluorescentie door de fluorescentie bij elke z-fractie te delen door de totale fluorescentie van de cel.

Tot slot, plot het percentage van fluorescentie intensiteit per z-fractie. Fractie één en twee vertegenwoordigen de synaptische interface. Hier is de workflow of de centrosome isolatieprocedure.

Gebruik 20 miljoen B-cellen per aandoening. Pre-treat cellen met Cytochalasine D en Nocodazole volgens het vereiste protocol om centrosome detachement te vergemakkelijken. Vervolgens kijken cellen door ze te resuspending ze in 5 mL van tbs buffer.

Herhaal dit met 1 mL van 0,1x TBS buffer aangevuld met 8%sucrose. De celpellet opnieuw opschort met 150 microliters lysebuffer. Centrifuge op 10,000 g gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius om de cytosol en organellen van de kern te scheiden.

Herstel de cel supernatant voorzichtig terug en plaats op een 1,5 mL buis. Vul het met 300 microliter gradiënt buffer aangevuld met 60% sacharose. Centrifugemonsters op 10.000 g gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius.

Deze centrifugatiestap is belangrijk om de centrosomes te concentreren. Verwijder na centrifugatie de supernatant voorzichtig tot u bij de interface bent. Vortex het monster dat in de buis blijft.

Bereid discontinu sucrosegradiënt in een ultracentrifugebuis voor door 0,45 mL van 70% sacharose te overmaken, met 0,27 mL van 50% sacharose, en vervolgens 0,27 mL van 40% sacharose in gradiëntbuffer. Plaats de centrosome-verrijkte monsters op het discontinu verloop en kalibreer het gewicht van elk monster in de respectieve adapters. Centrifugeren de buizen op 40,000 g gedurende 1 uur bij 4 graden Celsius, met minimale versnelling en zonder pauze om te voorkomen dat de helling verstoren.

Verzamel na centrifugatie zorgvuldig 12 fracties met gelijk volume. Hiermee wordt het voorbeeld opnieuw opgeschort met een laadbuffer en een SDS-PAGINA uitgevoerd. Om organelledistributie in B-cellen te bestuderen tijdens de vorming van een immuunsynaps, gebruikten we 2A1.6 B-cellen geactiveerd met antigeengecoate kralen voor verschillende tijdstippen.

Als controle werden B-cellen geactiveerd met kralen die een niet-gerelateerde BCR-ligand bevatten. Vervolgens detecteren we met behulp van immunofluorescentievlekken verschillende organellen, die hun lokalisatie veranderen bij activering met geïmmobiliseerde antigenen. We tonen hier het centrosome, gelabeld met alfa-tubuline en golgi apparaat gelabeld met Rab6a.

In de grafiek tonen we de polariteitsindex voor centrosome en golgi-apparaat polariteit verus elk keer punt van activering, waarin elke stip vertegenwoordigt een cel. Tijdens de activering kunnen we vaststellen dat de polariteitsindexen voor deze organellen waarden bereiken die dichter bij 1 liggen, wat wijst op een toename van hun rekrutering voor de IS.Organelles die een meer verspreide verdeling vertonen, zoals lysosomen, kunnen ook worden gekwantificeerd met behulp van een polariteitsindex. We kunnen vaststellen dat de polariteitsindex van het lyososome meer positieve waarden zal bereiken bij activering, die het gevolg is van de rekrutering naar de IS. We tonen een complementaire aanpak om de rekrutering van een lysosoom ten opzichte van de immuunsynaps te kwantificeren.

Met behulp van hetzelfde protocol van activering met kralen met antigencoating werd de lysosoomwerving aan de IS berekend door het fluorescentielabel te kwantificeren van lyosomen die werden aangeworven voor het gebied dat rond de kraal of binnen het synaptische gebied is gedefinieerd. We kunnen die open activatie waarnemen. Er is een toename van lysosomen gekoppeld aan de site van synaps.

Hier presenteren we de kwantificering van actine op het centrosome in B-cellen geactiveerd met specifieke en niet-specifieke antigeen-gecoate kralen. De pool van actin wordt aangegeven met een pijl. Kwantificering van centrosome-geassocieerde componenten, zoals actin in dit geval, kan worden vertegenwoordigd door punt plot, waarin elke stip vertegenwoordigt een cel.

Na de activering neemt de B-cel af in de hoeveelheid actin rond het centrosome. Deze stap is belangrijk om het centrosome los te maken van het perinuclear gebied om de polarisatie naar de nieuwe synaps mogelijk te maken. Voor B-cel geactiveerd op antigeen gecoate oppervlak, u onderzoeken actin remodeling evenals de werving van organellen aan het synaptische membraan.

Hier tonen we de analyse van organellen, zoals het golgi-apparaat en het endoplasmatische reticulum, dat respectievelijk een centrale en perifere verdeling vertoont. Bovendien kunnen we het verspreidingsgebied van B-cellen berekenen na verschillende tijdstippen van activering. Hiervoor labelen we actin om de cellimiet in het XY-vlak te kunnen definiëren.

In de grafiek u de toename van het celgebied observeren na 30 en 60 minuten activering. De verdeling van een organelle kan ook worden berekend in het XZ-vlak in respectievelijk de synaptische interface. De grafiek vertegenwoordigt de verdeling van actin in z-vlak, waar de eerste twee vlakken overeenkomen met de synaptische interface.

We kunnen vaststellen dat actin wordt verrijkt op dit gebied bij activering. Naast beeldanalyse kan biochemische benadering ook worden gebruikt om verandering in centrosome samenstelling bij de activering van B-cellen te bestuderen. We tonen hier een representatieve westerse vlek van centrosome-bevattende fractie gemarkeerd door de beige rechthoek.

Centrosome fracties werden geïsoleerd op een discontinu sucrose gradiënt en gedetecteerd door gamma-tubuline nivellering. De westelijke vlek hieronder toont actin en Arp2 in centrosome fracties van rustende B-cellen, die uitgeput raken bij activering. B lymfocyten ondergaan dynamische veranderingen op de membraaninterface om een functionele immuunsynaps te vormen.

Dit proces kan worden bestudeerd door beeldvorming en biochemische technieken beschreven hier in deze video. Wij geloven dat deze analyse waarde-informatie kan opleveren over de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij hoe B-cellen efficiënt kunnen worden geactiveerd.