Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

Prototyping synthetische gennetwerken wordt sterk verbeterd door het gebruik van celvrije genexpressiesystemen. Ons protocol beschrijft het fabricageproces voor meerlaagse microfluïde stroomreactor en laat zien dat een dergelijk apparaat kan worden gebruikt voor langdurige celvrije expressie van GFP. Celvrije eiwitexpressies in combinatie met microfluïde stroomreactoren vormen het rapid prototyping platform voor het ontwerp van synthetische biologische apparaten.

Deze hele setup is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor de geleiding van biochemische of chemische reacties die een hoog niveau van controle vereisen. Het waarborgen van de stabiliteit van de celvrije reactieoplossing is cruciaal en moeilijk te bereiken. Zorg ervoor dat u zich richt op het verstrekken van voldoende koeling en gebruik maken van de slang die in dit protocol.

Het fabriceren en voorbereiden van het experimentele platform vereist de verbinding van tal van individuele componenten, een proces dat moeilijk te volgen is zonder visuele hulpmiddelen. Om te beginnen volgt u in het bijbehorende tekstprotocol om het microfluïde apparaat te fabriceren en de pneumatische regel- en stroomdrukregeling in te stellen die zal worden gebruikt voor het regelen van de kleppen die van cruciaal belang zijn voor dit apparaat. Om de off-chip koeling op te zetten, begin met het oprollen van een lengte van PTFE-buizen op de koude vlak van een Peltier-element en zet de spoel vast met tape.

Zorg ervoor dat het ene uiteinde van de PTFE-slang is aangesloten op reservoirs van het drukcontrolesysteem van de stroomlaag en dat het andere uiteinde niet meer dan één centimeter van het Peltier-oppervlak uitsteekt. Voeg vervolgens een lengte van vijf tot 10 centimeter van PEEK-buizen in het uitstekende uiteinde van de PTFE-slang. Breng een voldoende hoeveelheid thermische verbinding aan op de hete aandacht van het Peltier-element en plaats deze op de koude plaat van het waterblok.

Zorg ervoor dat de slang, het Peltier-element en het koelblok te allen tijde met elkaar in contact staan. Sluit vervolgens het Peltier-element aan op de temperatuurregelaar met behulp van een seriële busconnector, zodat de spanning die aan de Peltier wordt geleverd kan worden geregeld. Plaats vervolgens een thermistor op het Peltier-oppervlak en sluit de output aan op de temperatuurregelaar.

Pas na het inschakelen van de waterkoeler de aan de Peltier geleverde spanning aan tot de temperatuur stabiel is op vier graden Celsius. Voor elk controlekanaal van het microfluïde apparaat snijdt een lengte van standaard buizen die een meter lang. Aan de ene kant, steek de pin van een 23 meter, een halve inch Luer stomp en aan de andere kant steek een roestvrij stalen verbindingspen.

Sluit de Luer stomp aan op een mannelijke Luer 3/32 inch prikkeldraad nylon connector en steek de weerhaak van de connector in een lengte van polyurethaan buizen. Steek deze polyurethaanbuizen direct in een van de solenoïde kleppen. Bevestig vervolgens een 23 meter halve inch Luer stomp aan een spuit en steek dit in een drie tot vier centimeter lang stuk standaard buizen.

Plaats het open uiteinde van deze slang in een reservoir van ultra zuiver water en vul de spuit met ultra zuiver water. Nummer elk controlekanaal van het microfluïde apparaat zoals hier weergegeven. Voor de kanalen vier tot en met 29, zoek de bijbehorende slang en steek de metalen pin in het open uiteinde van de slang bevestigd aan de spuit.

Injecteer vervolgens water in de leidingsbuizen tot de helft van de lengte is gevuld. Los vervolgens de slang los van de spuit en steek de roestvrijstalen connectorpin in het overeenkomstige gat van het microfluïde apparaat. Herhaal deze stap voor alle besturingskanalen.

Gebruik nu de bedieningsinterface om alle solenoïde kleppen te openen. Dit zal de vloeistof onder druk zetten in de leiding kanaal buizen dwingen het in de microfluïde apparaat en het sluiten van alle membraan-gebaseerde kleppen in het apparaat. Voor elk van de ongekoelde reagentia gesneden een meter lengte van de standaard buizen om het reservoir uitlaat aan te sluiten op de microfluïde apparaat inlaten.

Neem een uiteinde van de slang en steek dit in het reservoir ervoor te zorgen dat de slang bereikt de basis van het reservoir. De reservoirbuizenafzet moet zo worden aangedraaid dat een luchtdichte afdichting wordt bereikt. Steek vervolgens een roestvrije verbindingspin in het open uiteinde van de slang.

Bevestig vervolgens een 23 meter halve inch Luer stomp aan het einde van een een milliliter spuit. Voeg een korte lengte van de standaard buizen aan de Luer stomp. Plaats het uiteinde van de slang in de gewenste reagensoplossing en vul de spuit met het reagens.

Steek vervolgens de roestvrijstalen connectorpin in de polyurethaanbuis die op de spuit is aangesloten en vul de slang met het reagens. Bij het gebruik van kleine reactievolumes komt het reagens niet in het reservoir terecht en fungeert de slang zelf als reservoir. Los de spuit los en plaats de connectorpin in een van de inlaatgaten van de microfluïde van het microfluïde apparaat.

Breng vervolgens druk uit op elk van de reservoirs met behulp van de drukregelaarsoftware om de reagentia in het microfluïde apparaat te dwingen. Zorg ervoor dat de waterkoeler en Peltier elementen zijn ingeschakeld met de oppervlaktetemperatuur van de Peltier ingesteld op vier graden Celsius. Monteer de koelset zo dicht mogelijk bij het microfluïde apparaat om het ongekoelde volume tussen de Peltier en de inlaat van het apparaat te minimaliseren.

Sluit dan degene die de ene milliliter spuit aan een 23 meter halve inch Luer stomp met een korte lengte van de standaard buizen aan het einde. Teken in de te gekoelde reagens om de spuit te vullen. Sluit vervolgens de PEEK-slang aan op de spuit via de verbindingsbuizen en druk op de spuit die het reagens door de PEEK-buizen en in de PTFE-slang dwingt.

Los ten slotte de PEEK-slang los van de spuit en plaats deze rechtstreeks in de stroomkanaalinlaten van het microfluïde apparaat. Wanneer de druk wordt uitgeoefend, wordt het gekoelde reagens in het microfluïde apparaat gedwongen. Zorg ervoor dat het microfluïde apparaat veilig is op het microscoopstadium met alle bedienings- en stroomlaagbuizen en sluit eventuele openingen op de couveuse.

Stel vervolgens de omgevingstemperatuur van de couveuse in op 29 graden Celsius. Zorg er dan voor dat het koelsysteem is ingeschakeld en is ingesteld op vier graden Celsius voordat het experiment wordt gestart. Controleer of de druk die wordt uitgeoefend op de drukregelaar van het stroomkanaal is ingesteld op 800 millibar en met behulp van de software, de uitgangsdruk van elk individueel stroomkanaal instellen op tussen de 20 en 100 millibar.

Controleer of de druk die wordt uitgeoefend op het controlekanaal solenoïde kleppen is een bar voor kanalen een tot en met acht en drie bar voor kanalen negen tot en met 29. Sluit vervolgens de uitlaat van het apparaat door kanaal 29 onder druk te zetten en tegelijkertijd de besturingskanalen één tot en met drie en 15 tot en met 28 te depressuriseren. Druk vervolgens selectief op de besturingskanalen van de multiplexer om één geselecteerd reagens in het apparaat te laten stromen.

Gebruik de microscoop om het verwijderen van lucht te controleren en er vervolgens voor te zorgen dat alle reagentia correct stromen zonder luchtbellen in te voeren. Stel met behulp van het meegeleverde softwarepakket de gegevensvelden in die verband houden met het kalibratieproces zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bepaal vervolgens het vloeistofvolume dat tijdens één instroomstap uit elke reactor wordt verplaatst door het kalibratieprotocol uit te voeren.

Volg samen met de stappen die door de besturingssoftware worden gepresenteerd om de analyse van het kalibratie-experiment te voltooien en om de verversingsverhouding van elke ringreactor in het microfluïde apparaat te bepalen. Ten slotte stelt u de vereiste waarden in voor het gewenste experiment binnen de virtuele besturingsinterface. Start het experimentele protocol door op de experimentknop uit te voeren in de besturingsinterface.

Tijdens een kalibratie-experiment worden de reactoren gevuld met een fluorofofre waarvan de intensiteit na elke verdunning wordt geregistreerd. De daling van de fluorescentieintensiteit per verdunning geeft het volume aan van de reactorring die wordt verplaatst voor het ingestelde aantal instroomstappen. Dit volume wordt de vernieuwingsverhouding genoemd.

De gemiddelde verversingsratio en standaarddeviatie worden weergegeven voor elke verdunningsstap in rood. Zeven van de acht reactoren vertonen zeer vergelijkbaar gedrag, maar één reactor vertoont schommelingen na de zevende verdunningscyclus. Dit benadrukt de noodzaak van unieke refresh ratio's voor elk van de reactoren.

De langdurige in vitro transcript en vertaling reactie hier getoond had 30% van de reactor volume verplaatst om de 14,6 minuten. Twee reactoren van de microfluïde inrichting waar gebruikt als losse flodders. Alle andere reactoren bestonden uit 75% in vitro transcriptie en vertaalreactieoplossing en 25% van ultra zuiver water of 2,5 nanomolar lineaire DNA-sjablonen die coderen voor de expressie van het deGFP-eiwit.

In alle vier de reactoren waar DNA werd toegevoegd, was er duidelijke deGFP expressie. Eén reactor geeft een lager fluorescentiesignaal weer. Dit kan worden veroorzaakt door verschillen in stroom, wat resulteert in minder DNA dat de reactor binnenkomt of als gevolg van variaties in de reactorafmetingen.

Na 14 uur, een plotselinge toename wordt gezien in het signaal van de reactoren met DNA. Dit wordt veroorzaakt door een luchtbel die de stroomlaag van het microfluïde apparaat binnendringt. Bij hervatting van de stroom keert het experiment terug naar de vorige fluorescentieintensiteit.

Celvrije reactieoplossingen zijn na verloop van tijd onderhevig aan degradatie, tenzij ze voldoende gekoeld zijn, waardoor het koelproces beschreven in dit protocol van cruciaal belang is. Door de veelzijdigheid van het platform kunnen verschillende biochemische en chemische reacties op een nauwkeurige en gecontroleerde manier worden uitgevoerd. De toepassing van microfluïde stroomreactoren heeft opeenvolgende ontwerp build testcycli voor prototyping dubbele genetische circuits versneld.