Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Deze in vitro test toont angiogeen ontkiemen in een hoge doorvoer en schaalbaar platform. Dit kan worden gebruikt om nieuwe doelen in angiogenese te vinden. Deze angiogenese test combineert complexe cellulaire micro-omgevingen met gradiënten en perfusie met een platform dat compatibel is met hoge doorvoer screening.

Angiogenese speelt een belangrijke rol in zowel de gezondheid als de ziekte. Inzicht in de mechanismen die optreden tijdens angiogenese kan ons helpen om te begrijpen hoe kankers groeien en hoe weefsels herstellen. Deze methode kan inzicht geven in de mechanismen tijdens hart- en vaatziekten en weefselregeneratie.

In beide speelt angiogenese een belangrijke rol. Voor het eerste gebruik van dit microfluïde platform, moet u zich bewust zijn van de wet van volumes en hoe pipette. U de stappen bevestigen door onder een microscoop te kijken of de plaat ondersteboven te draaien.

Sommige stappen zijn moeilijk om een gevoel te krijgen voor bij het lezen van de methode, bijvoorbeeld hoe klein de microfluïde kanalen zijn of hoe de plaat te houden. Het aantonen van deze procedures zal Wendy Stam, een technicus van ons laboratorium. Om te beginnen, breng de microfludische 384-put plaat naar een steriele laminaire stroomkap.

Verwijder het deksel en voeg 50 microliter water of fosfaat gebufferde zoutoplossing toe aan elk van de 40 observatieputten met behulp van een meerkanaals pipet. Voeg vervolgens 1,5 microliter van vier milligram per milliliter collageen een oplossing aan de gel inlaat van elke microfluïde eenheid. Zorg ervoor dat de druppel gel is geplaatst in het midden van elke put om voor de gel om het kanaal in te voeren.

Na het vullen van vijf microfluïde eenheden, draai de plaat ondersteboven om visueel te inspecteren juiste vulling van de gel kanalen. Plaats de microfludische plaat in een couveuse op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 10 minuten om collageen een polymeriseren. Haal vervolgens de plaat uit de couveuse en breng over op een steriele laminaire stroomkap.

Voeg 50 microliter van 10 microgram per milliliter fibronectine coderingsoplossing toe aan de uitlaatput van het bovenste perfusiekanaal van elke microfluïde eenheid. Druk de pipetpunt tegen de zijkant van de put voor een correcte vulling van de put zonder luchtbellen te vangen. Het kanaal vult en de vloeibare pannen op de uitlaat zonder de uitlaat goed te vullen.

Plaats de plaat vervolgens minstens twee dagen in de couveuse. Ontdooi nu snel de bevroren IPSC-VC's voor minder dan een minuut in een 37 graden Celsius waterbad. Breng vervolgens de cellen over naar een buis van 15 milliliter en voeg langzaam 10 milliliter basaal medium toe om te verdunnen.

Teken 10 microliter van de oplossing en tel de cellen op een cel teller. Centrifugeren de buis op 100 keer g gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant zonder verstoring van de cel pellet en resuspend in basale medium om een concentratie van twee keer 10 tot de zevende cellen per milliliter opleveren.

Breng vervolgens de microfluïde 384-putplaat van de couveuse over naar een steriele laminaire stroomkap. Aspirate de fibronectin coderingsoplossing uit de perfusie uitlaat en voeg 25 microliter basale medium in de uitlaatputten. Voeg een een microliter druppel van cel suspensie aan elke top perfusie inlaat goed.

De druppel vlakt af in een paar seconden. Controleer onder een microscoop of het zaaien homogeen is binnen een enkel kanaal en tussen kanalen. Incubeer de microfluïde put plaat voor een tot 1,5 uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Controleer daarna de cellen om te bevestigen dat ze zich hebben gehecht. Verwijder het basale medium uit de bovenste perfusieuitlaatputten. Voeg warm vat cultuur medium in de top perfusie inlaat en uitlaat.

Plaats de plaat op een rocker platform dat is ingesteld op een zeven graden hoek en acht minuten schommelen interval in de incubator. Op dag een en twee na het zaaien, beeld de plaat met behulp van een Brightfield microscoop met geautomatiseerde fase om de levensvatbaarheid van de cel te bevestigen. Na twee dagen, een confluent monolayer heeft gevormd tegen het collageen een steiger.

Bereid eerst 4,5 milliliter angiogeen ontkiemend medium door 4,5 milliliter basaal medium aan te vullen met 4,5 microliter VEGF-voorraad, 4,5 microliter PMA-voorraad en 2,25 microliter S1P-voorraad. Bereid 8,5 milliliter vatgroeimedium voor door het basale medium aan te vullen met 5,1 microliter VEGF en 3,4 microliter BFGF. Aspirate medium uit de putten en voeg 50 microliter van verse vat cultuur medium in de top perfusie inlaat en uitlaat putten en gel inlaat en uitlaat putten.

Voeg vervolgens 50 microliter angiogeen spruitmengsel toe aan elk van de inlaat- en uitlaatputten van de bodemperfusiekanaal. Plaats de plaat terug in de couveuse op het rockerplatform om een gradiënt van angiogene groeifactoren te vormen. Één dag en twee dagen na toevoeging van de angiogene groeifactoren, gebruik een microscoop Brightfield om de putten op een geautomatiseerd stadium te beelden.

Om anastomose en spruitstabilisatie te bestuderen, voeg een microliter van 0,5 milligram per milliliter fluorescerend gelabeld albumine toe aan de bovenste perfusie inlaat. Meng vervolgens de oplossing met een pipet van 50 microliter. Breng de plaat naar een fluorescerende microscoop met geautomatiseerde fase en incubator ingesteld op 37 graden Celsius.

Stel de microscoop in op de 10X-doelstelling en corrigeer de belichtingsinstellingen. Verwerf timelapse-beelden elke minuut gedurende 10 minuten. Haal de plaat uit de microscoop en breng de plaat over op een steriele laminaire stroomkap.

Verwijder alle medium uit de putten en vervang zowel het medium van de vaatkweek als het angiogene ontkiemende medium in de overeenkomstige putten. Plaats de microfluïde plaat terug in de couveuse om angiogeen te blijven ontkiemen. Herhaal op dag zes de beeldvorming om de doorlaatbaarheid te bestuderen.

Om de celcultuur op te lossen, aspirate alle cultuurmedia uit de putten. Voeg 25 microliter van 4% PFA in PBS toe aan alle perfusieinlaat- en uitlaatputten. Plaats vervolgens een kant van de microfluïde plaat op het deksel in een lichte hoek van vijf graden om de stroom te induceren.

Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Daarna, aspirate de PFA uit de putten. Was alle perfusieinlaten en -uitgangen twee maal met 50 microliter HBSS.

Dan aspirate de HBSS uit de putten. Paraformaldehyde is een gevaarlijke chemische stof die moet worden behandeld het dragen van handschoenen en alleen geopend in een rookkap. Voeg vervolgens 50 microliter van 0,2% niet-ionische oppervlakteactieve stoffen toe aan alle perfusieinlaten en uitlaten om 10 minuten op kamertemperatuur te doordringen en plaats de microfluïde plaat op het deksel onder een lichte hoek van vijf graden.

Aspirate de niet-ionische oppervlakteactieve uit de putten en was de perfusiekanalen tweemaal door 50 microliters hbss toe te voegen aan alle perfusie-inlaat- en uitlaatputten. Aspirate de HBSS uit de putten. Bereid Hoechst 1, 000 tot 2.000 voor op het bevlekken van de kernen en bereid Phalloidin 100 tot 200 in HBSS voor het bevlekken van F-actin.

Combineer zes milliliter HBSS, 30 microliter F-actin en drie microliters van Hoechst in een Falcon buis. Voeg vervolgens 25 microliter aan elke perfusieinlaat en uitlaatput goed toe. Plaats de plaat onder een lichte hoek en incubbateren op kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten.

Was twee maal met 50 microliter HBSS in alle perfusieinlaten en -uitgangen. Dan direct beeld met behulp van een fluorescerende microscoop met geautomatiseerde fase of bewaar de plaat beschermd tegen licht op vier graden Celsius voor later gebruik. In dit protocol werden de microvaten continu geperfuseerd en blootgesteld aan een gradiënt van angiogene groeifactoren.

Het zaaien van de IPSC-IC's met behulp van de passieve pompmethode resulteerde in homogene zaaddichtheden. De timelapse van een druppel die bovenop de inlaat van het microfluïde kanaal wordt geplaatst toont de druppel direct na toevoeging, de druppel bovenop de inlaatstam na toevoeging, tot de druppel meniscus door de inham werd vastgemaakt die in een stroom naar de uitgang resulteerde. Blootstelling aan een gradiënt van angiogene factoren resulteerde in directionele angiogene ontkiemen van de microvaten binnen het patroon collageen een gel.

Duidelijke tipcelvorming en invasie in het collageen één gel was zichtbaar 24 uur na toevoeging van de angiogene gradiënt, terwijl voorraadcellen inclusief lumenvorming na 48 uur zichtbaar waren. Na fixatie en kleuring werden de vorm en lengte van deze spruiten geïdentificeerd. Echter, zonder toevoeging van groeifactoren, geen invasie in het collageen een gel werd waargenomen.

Met confocale beeldvorming werd de spruitdiameter bepaald en werd de lumenvorming bevestigd. Deze methode kan worden gebruikt om te screenen op nieuwe angiogene remmers. Dit kan helpen om nieuwe behandelingen te vinden tegen diabetische retinopathie, reumatoïde artritis en kanker.

We onderzoeken momenteel hoe we co-culturen kunnen creëren, waaronder een model van de bloed-hersenbarrière en gevasculariseerde organoïden.