Name: In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Ontdek een voorwaartse genetische aanpak om nieuwe neuroprotectieve genen te identificeren in Drosophila melanogaster. Deze methode omvat een klimtest, histologie en DNA-sequencing om inzicht te geven in neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn vooral dankbaar voor Dr. Barry Ganetzky, in Who 's Lab het genetische scherm werd uitgevoerd, waardoor de identificatie en karakterisering van Brat als een neuroprotectieve gen. We danken Dr. Steven Robinow voor het vriendelijk verstrekken van de verzameling van ENU-gemutageniseerde vliegen gebruikt in het genetische scherm gepresenteerd in dit artikel. Wij danken de leden van Ganetzky Lab, drs. Grace Boekhoff-Falk en David Wassarman voor nuttige besprekingen gedurende de gehele duur van dit project, Ling Ling Ho en Bob Kreber voor technische assistentie, Dr. Aki Ikeda voor het gebruik van zijn microtoom faciliteit aan de University of Wisconsin en Dr. Kim Lackey en de optische analyse faciliteit aan de Universiteit van Alabama.

<ol><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+cycle%3A+the+neuron+itself+and+its+circumstances%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li>
<li>Aranda-Anzaldo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-mitotic+state+in+neurons+correlates+with+a+stable+nuclear+higher-order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.</a> Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).</li>
<li>Haelterman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+chemically+induced+mutations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).</li>
<li>Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+forward+with+genetics%3A+recent+technological+advances+and+forward+genetics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice.</a> The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).</li>
<li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing%3A+The+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+microRNA+miR-8+tunes+atrophin+levels+to+prevent+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila.</a> Cell. 131 (1), 136-145 (2007).</li>
<li>Helfrich, C., Engelmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian-Rhythm+of+the+Locomotor-Activity+in+Drosophila-Melanogaster+and+Its+Mutants+Sine+Oculis+and+Small+Optic+Lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes.</a> Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , Foundation for Statistical Computing. (2008).</li>
<li>Bokel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+screens+%3A+from+mutagenesis+to+screening+and+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Bioogyl%22%5BJournal%5D)">EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping.</a> Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).</li>
<li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsley%2C+DL+%22The+Genome+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Genome of Drosophila Melanogaster</a>. , (1992).</li>
<li>Cook, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+chromosomal+deletions+to+provide+extensive+coverage+and+subdivision+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome.</a> Genome Biology. 13 (3), R21(2012).</li>
<li>Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Mutation+in+Brain+Tumor+Causes+Both+Neural+Over-Proliferation+and+Neurodegeneration+in+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila.</a> Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).</li>
<li>Gloor, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+repressors+of+P+element+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Type I repressors of P element mobility.</a> Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).</li>
<li>Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+specifies+intermediate+progenitor+cell+identity+by+attenuating+beta-catenin%2FArmadillo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity.</a> Development. 141 (1), 51-62 (2014).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Loewen, C. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Nuclear+Interactions+Affecting+Lifespan+and+Neurodegeneration+in+a+Drosophila+Model+of+Leigh+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li>
<li>Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnr1+mutations+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+by+activating+the+innate+immune+response+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).</li>
<li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+brain%3A+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Polo+ameliorates+APP-induced+Alzheimer%27s+disease-like+symptoms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 16816(2015).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagens%2C+transposons%2C+and+transgenes+to+interrogate+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 15-28 (2014).</li>
<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Genome+Sequencing+and+a+New+Bioinformatics+Platform+Allow+for+Rapid+Gene+Identification+in+D.+melanogaster+EMS+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens.</a> Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila.</a> Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Voorwaartse genetische schermen in Drosophila zijn een effectieve benadering geweest om genen te identificeren die betrokken zijn bij verschillende biologische processen, waaronder leeftijdsafhankelijke neuro bescherming5,23,24, 25. met behulp van deze strategie, we waren succesvol in het identificeren van Brat als een nieuwe neuroprotectieve gen17....

Neuronen zijn voor het grootste deel post-mitotische en niet in staat om1,2te verdelen. Bij de meeste dieren bestaan neuroprotectieve mechanismen om deze cellen gedurende de levensduur van het organisme te behouden, vooral op oudere leeftijd wanneer neuronen het meest kwetsbaar zijn voor beschadiging. Genen die aan deze mechanismen ten grondslag liggen, kunnen worden geïdentificeerd bij mutanten die neurodegeneratie vertonen, een fenotypische indicator voor het verlies van neuroprotectie, met behulp van een forward genetisch protocol. Voorwaartse genetische schermen die gebruik maken van chemische mutagene agentia, zoals ethyl methanesulfonaat (EMS) of N-ethyl-N-nitrosoureumderivaat (ENU), zijn met name nuttig vanwege de willekeurige puntmutaties die zij induceren, resulterend in een inherent onbevooroordeelde benadering die licht heeft werpen op talrijke genfuncties in eukaryotische model organismen3,4,5 (in tegenstelling, Röntgen mutagenese creëert DNA-onderbrekingen en kan resulteren in herschikking in plaats van puntmutaties6).
De gewone fruitvlieg Drosophila melanogaster is een ideaal onderwerp voor deze schermen vanwege de hoge kwaliteit, goed geannoleerde genoom sequentie, zijn lange geschiedenis als modelorganisme met sterk ontwikkelde genetische hulpmiddelen, en het meest aanzienlijk, zijn gedeelde evolutionaire geschiedenis met mensen7,8. Een beperkende factor in de toepasselijkheid van dit protocol is vroege letaliteit veroorzaakt door de gemuleerde genen, die zou voorkomen dat testen op oudere leeftijd9. Voor niet-dodelijke mutaties is een klim test, die gebruik maakt van negatieve geotaxi's, echter een eenvoudige, maar uitgebreide methode om verminderde motorische werking10te kwantificeren. Om voldoende motorische reactiviteit te vertonen, zijn vliegen afhankelijk van neurale functies om de richting te bepalen, de positie ervan te voelen en de beweging te coördineren. Het onvermogen van vliegen om voldoende te klimmen in reactie op prikkels kan daarom duiden op neurologische gebreken11. Zodra een bepaalde defecte klim fenotype is geïdentificeerd, kan verder testen met behulp van een secundair scherm zoals histologische analyse van hersenweefsel worden gebruikt om neurodegeneratie in klimmen-defecte vliegen te identificeren. Daaropvolgende genmapping kan vervolgens worden gebruikt om de genomische regio te onthullen op het chromosoom dat het defecte neuroprotectieve gen van belang draagt. Om de chromosomale regio van belang te verfijnen, kan Meiotische mapping met behulp van Mutante vlieg lijnen met dominante marker genen met bekende locaties op het chromosoom worden uitgevoerd. De marker genen dienen als referentiepunt voor de mutatie, aangezien de frequentie van recombinatie tussen twee loci een meetbare afstand biedt die kan worden gebruikt om de geschatte locatie van een gen in kaart te kunnen gebracht. Ten slotte creëert het kruisen van de gemuteerde lijnen met lijnen die evenwichtige tekortkomingen vertonen op de in de meiotisch toegewezen chromosomale regio van belang een complementatie test waarbij het gen van belang kan worden geverifieerd als het bekende fenotype5wordt uitgedrukt. Polymorfe nucleotide sequenties in het geïdentificeerde gen, mogelijk resulterend in een veranderde aminozuur sequenties, kunnen worden geëvalueerd door het gen te sequentiëren en te vergelijken met de Drosophila genoom sequentie. Latere karakterisering van het gen van belang kan zijn het testen van extra Mutant allelen, mutatie redding experimenten en onderzoek van aanvullende fenotypes.

<table><tbody><tr><td>Belangrijke apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Afzuigputting voor histologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipe E100</td><td>Voorkeursobjectief voor beeldvorming is 20x</td></tr><tr><td>Beeldvormingssoftware</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoopcamera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly pushing en klimtest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Drosophila-flesje, smal</td><td>VWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Algemeen laboratorium etiketteertape</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Standaard muismat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoscoop</td><td>Motic</td><td></td><td>Model SMZ-168</td></tr><tr><td>CO2 verdovingsstation (Blowgun, voetklep, Ultimate Flypad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td>Bevat geen CO2-tank</td></tr><tr><td>Fijne penselen</td><td>SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila incubator</td><td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Genmapping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila lijn gebruikt voor recombinatiemapping</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3227</td><td>Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>Drosophila balancerlijn gebruikt voor recombinatiemapping</td></tr><tr><td>Deficiëntiekit voor chromosoom 2L</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Histologieanalyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, (100%)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial azijnzuur</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade;&nbsp;Premium Microcentrifugebuisjes: 1,5 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice clearingagent 1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylinen</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosine</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;&nbsp;Richard-Allan Scientific&trade; montagemedium</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Unifrost Poly-L-Lysine microscoopglazen, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade;&nbsp;Dekglazen: Rechthoeken</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545M</td><td>Afmetingen: 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Traceable timer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diawarmer</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>modelnr. 26025</td></tr><tr><td>Dialade en -rekken</td><td>DWK Life Sciences</td><td></td><td>Rek om 20 dia's te houden</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade;&nbsp;Extra lange pincetten</td><td>Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade;</td><td>Kimberly-Clark&trade; Professional&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 inch Puritan applicators</td><td>Hardwood Products Company, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Scheermessen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tupperware of glazen containers voor histologievloeistoffen</td><td></td><td></td><td>16 + 1 voor stromend water</td></tr><tr><td>Gestoomde microtomemesjes</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade;&nbsp;Rond ijsemmer met deksel, 4 L</td><td>Corning&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolf</td><td></td><td></td><td>Of andere container voor ijswater en cassettes</td></tr><tr><td>Weefselbad</td><td>Precision Scientific Company</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moleculair onderzoek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Gel en PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Ex Taq DNA polymerase</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu;l</td></tr><tr><td>Invitrogen&trade;&nbsp;SYBR&trade; Safe&trade; DNA Gel Stain&nbsp;</td><td>&nbsp;Invitrogen&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&trade; Agarose</td><td>&nbsp;Invitrogen&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>&nbsp;Invitrogen&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApE-A plasmid Editor software</td><td></td><td></td><td>Beschikbaar voor gratis download</td></tr><tr><td>Statistisch onderzoek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R softwarepakket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verder onderzoek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in drosophila melanogaster te identificeren

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Er is veel te begrijpen over het ontstaan en de progressie van neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de onderliggende genen die verantwoordelijk zijn. De voorwaartse genetische screening met behulp van chemische mutagene agentia is een nuttige strategie voor het in kaart brengen van Mutante fenotypes op genen bij Drosophila en andere model organismen die geagglomerde cellulaire trajecten met mensen delen. Als het gemuleerde gen van belang niet dodelijk is in vroege ontwikkelingsstadia van vliegen, kan een klim test worden uitgevoerd om te schermen voor fenotypische indicatoren van verminderde hersen werking, zoals lage klim snelheden. Vervolgens kan secundaire histologische analyse van hersenweefsel worden uitgevoerd om de neuroprotectieve functie van het gen te controleren door het scoren van neurodegeneratie fenotypes. Genmapping strategieën omvatten Meiotische en deficiëntie mapping die afhankelijk zijn van deze zelfde testen kunnen worden gevolgd door DNA-sequencing om mogelijke nucleotide veranderingen in het gen van belang te identificeren.

In deze aerticula presenteren we de stappen die worden gebruikt om de genen hersentumor (Brat) te identificeren als een rol spelen bij het onderhoud van neuronale integriteit (bijv. neuroprotectie) bij volwassen vliegen17; een methodologie die kan worden gebruikt om genen te identificeren die betrokken zijn bij neuroprotectie. We gebruikten een voorwaartse genetische benadering (de strategie wordt geschetst in Figuur 1a</stron...

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Het belangrijkste doel van dit protocol is om de kracht van voorwaartse genetica te gebruiken om genen te identificeren die bij ongereguleerde leiden tot neurodegeneratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een onbevooroordeelde en eenvoudige aanpak biedt voor de identificatie van neuroprotectieve genen die mogelijk moeilijker uit te voeren zijn in zoogdiermodellen. Deze techniek kan worden gebruikt om nieuwe genen te identificeren die betrokken zijn bij het proces van neurodegeneratie die wordt geassocieerd met vele aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson.Naast het identificeren van neuroprotectieve genen, kan de voorwaartse genetische benadering worden gebruikt om genen te ontdekken die betrokken zijn bij andere biologische processen zoals neuronale functie en transmissie. Om te beginnen verzamel je homozygoot vliegen uit lijnen die behoren tot de ENU-gemutageniseerde verzameling Drosophila-mutanten die in kaart zijn gebracht op het tweede chromosoom. Draai de vliegen van 10 tot 12 dagen in een testkamer zonder verdoving een lijn per keer en laat ze om te herstellen voor vijf minuten.Met de vijf centimeter lijn markering kant naar beneden, met geweld tik op de kamer drie keer op een muismat geplaatst op een solide oppervlak, zodat alle vliegen beginnen met de test aan de onderkant. Observeer vliegbeweging over een periode van 10 seconden. Noteer het aantal vliegen dat de vijf centimeter lijn binnen deze tijd bereikt of passeert, evenals het totale aantal geteste vliegen.Wacht een minuut voordat u een tweede proces begint. Herhaal een minimum van drie proefrepliceerten per regel. Na het verdoven van de vliegen op een kooldioxide pad, verbreken vliegen hoofden met een chirurgisch mes en gebruik een penseel om ze voorzichtig plaats in een milliliter van fixatief Carnoy's in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis.Bewaar de buis dan 's nachts op vier graden Celsius. De volgende dag, zorg ervoor dat de hoofden zijn gezonken in de fixatieve oplossing. Onder een rookkap, gebruik maken van een P1000 pipet om de fixatieve oplossing te vervangen door een milliliter van 70%ethanol en onderhouden van de monsters op vier graden Celsius voor toekomstige analyse.Breng met behulp van een Pasteur pipet de vaste koppen over in microbiopsiecassettes en sluit de cassettes. Stuur de cassettes naar een histologiefaciliteit voor verwerking of plaats ze in een geautomatiseerde weefselverwerkingsmachine indien ter plaatse beschikbaar. Voer het programma uit om de hoofden te dehydrateren, te wissen en te infiltreren met paraffine.Breng vervolgens de cassettes over in een paraffine inbeddingsstation met paraffine verwarmd op 60 graden Celsius en plaats metalen basismallen die passen bij de cassettes op het verwarmde station. Gebruik fijne tangen om de hoofden te oriënteren zodanig dat ze geconfronteerd met de top in de basis mal. Een goede hoofdoriëntatie is cruciaal voor de histologieanalyse.Na verharding, trim elk paraffine blok om het oppervlak dat zal worden doorsneden te minimaliseren. Snijd vijf micrometer secties van elk blok op het microtome. Plaats vervolgens de geseletinlinten in een verwarmd waterbad op 35 graden Celsius gedurende maximaal vijf minuten.Dompel een met polylysine gecoate glijbaan onder in het verwarmde waterbad en gebruik een houten applicator om de doorsneden linten op de glijbaan te plaatsen. Laat de glijbanen 's nachts drogen bij kamertemperatuur. De volgende dag, gebruik maken van een dia-warmer om de dia's te verwarmen voor 15 minuten op 63 graden Celsius.Plaats de glijbanen onder een rookkap op een glijrek en plaats het rek in HistoChoice gedurende vijf minuten, tweemaal gevolgd door verschillende ethanol en gedestilleerde waterbadbehandelingen volgens het manuscript. Breng het rek in een container gevuld met Harris Hematoxylin voor twee tot vijf minuten te vlek. Haal vervolgens het rek uit de Hematoxylin-oplossing en plaats het 10 minuten onder stromend leidingwater voordat de volgende kleuringsstappen worden aangebracht.Na het bevlekken, met behulp van tangen, neem de dia's uit de HistoChoice of Xylene oplossing. Druppel een dun laagje permanent montagemedium op het monster en plaats voorzichtig een coverslip op de bovenkant. Vermijd vorming van bellen.Nadat het montagemedium is gehard, plaatst u de dia onder een lichtmicroscoop om beelden van representatieve hersensecties bij ongeveer midbrain te verkrijgen. Bereid eerst een voedsel met flacon voor het genereren van heterozygoot vrouwelijke vliegen. Na de verdoving van kooldioxide, gebruik een penseel om vijf mannetjes van de mutantlijn en 10 maagdelijke vrouwtjes van de sternopleurale vastgelopen kwab en pin over Curly O lijn in het flesje om een kruis te maken.Plaats de flacon op 25 graden Celsius. Verzamel na 10 tot 12 dagen ten minste 15 maagdelijke vrouwelijke nakomelingen die het gemuteerde chromosoom en het markerchromosoom dragen. Kruis ze naar vijf mannetjes uit een evenwichtige lijn die een andere zichtbare dominante marker Curly O over scutoid of gelijkwaardig draagt.Na 10 tot 12 dagen, verzamel de heterozygoot mannelijke nageslacht die ofwel scutoid of Curly O en de potentieel gerecombineerde chromosoom van het kruis. Individueel stuur je ze aan maagdelijke vrouwtjes uit de stam die het gemuteerde chromosoom dragen. Tien tot 12 dagen later, verzamel het nageslacht van het laatste kruis in nieuw voedsel dat flacons bevat en verouder de vliegen bij 29 graden Van Celsius aan 10 tot 14 dagen.Voer histologie uit op vliegenhoofden en herhaal voor nakomelingen van elk individueel kruis. Met deze informatie voert u deficiëntiemapping in kaart brengen op een vernauwd gebied van het chromosoom om de locatie van de recessieve mutatie te verfijnen. Elke deficiëntielijn heeft een schrapping van verschillende gebieden van de chromosomen waardoor ze kunnen worden gebruikt voor complementatietesten.Vervolgens kruislijnen van de Drosophila deficiëntiekit voor het tweede chromosoom en zoek naar niet-complementatie van het fenotype van het belang. Om referentie voor DNA-sequentie-analyse te verkrijgen, download je een FASTA-formaatbestand met de genomische consensusvolgorde van het BRAT-gen van FlyBase of gebruik je een bestand met resultaten voor de BRAT-sequentie van een genetische achtergrondcontrole, bijvoorbeeld de oorspronkelijk gemutageized Drosophila-lijn. Open sequencing bestanden in de A Plasmid Editor.Ga naar Bewerken en klik op Reeksen uitlijnen. Selecteer met de muis van de computer alle reeksen om te vergelijken. Geef in het vervolgkeuzemenu de referentiereeks voor deze uitlijning aan.Controleer het gesequeneerde gebied op nucleotideveranderingen in vergelijking met de referentiereeks. Sla desgewenst de uitlijning op een computer in RTF-indeling op door op Tekst te klikken en vervolgens opslaan. Voer de redding experiment door het verzamelen van F1 nakomelingen van elk kruis.Selecteer zorgvuldig gemarkeerde balancers. Leeftijd van de vliegen op Drosophila voedsel medium op 29 graden Celsius en uitvoeren histologie analyse op de hersenen om te zoeken naar neurodegeneratie als voorheen. Om leeftijdsafhankelijke analyse van neurodegeneratie in 867 mutanten uit te voeren, verouderen de vliegen tot vijf, 15 en 25 dagen en voeren de daaropvolgende histologieanalyse uit.Dit protocol presenteert een voorwaartse genetische benadering van het scherm door middel van een verzameling van chemisch gemutageiseerde vliegen met behulp van een klimtest. Onder 235 homozygoot lijnen, ongeveer 37% van de geteste lijnen tentoongesteld een klimpas tarief onder 50%wanneer getest op de leeftijd van 10 tot 12 dagen. Latere histologische scherm op 51 van de lijnen vertonen de laagste klimpas tarief bleek dat 29 van deze lijnen toonde zichtbare verschijning van gaten in de hersenen neuropil variërend van mild tot ernstig indicatief voor neurodegeneratie.De neurodegeneratie fenotype in 867 vliegen is recessief omdat de hersenen van heterozygoot 867 vliegen die zijn doorgestreept om een wilde soort stam waren vergelijkbaar met die van controles. De deficiëntielijn Df24116 vormt geen aanvulling op het 867 gemuteerde fenotype op basis van de klimtest. Histologische verificatie toont de deficiëntielijn Df24116 vormt geen aanvulling op het 867 neurodegeneratie fenotype terwijl Df9296 dat wel doet.Het onderzoeken van het hersenfenotype van 867 mutanten gekruist naar extra deficiëntielijnen bevestigde dat de mutatie is opgenomen in het gebied van het genoom dat het gen BRAT omvat. Het is belangrijk om te onthouden tijdens deze procedure om zo rigoureus en nauwkeurig mogelijk te werken als dit protocol combineert verschillende stappen die, indien ten onrechte uitgevoerd kan de identificatie van mutanten met neurodegeneratie in kandidaat-genen beïnvloeden. Afhankelijk van de geïdentificeerde genen kan latere analyse het testen van extra eicellen van het gen van het belang of interacties met genen die een rol spelen in bekende trajecten van neurodegeneratie omvatten.Tijdens de histologie procedure, vergeet niet om de Carnoy fixatieve oplossing te behandelen met de nodige voorzichtigheid, omdat het chloroform bevat. Draag handschoenen en gebruik met voldoende ventilatie idealiter onder de rookkap. Op dezelfde manier, voer alle histologie vlekken onder de rookkap.

in-vivo-forward-genetic-screen-to-identify-novel-neuroprotective

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Gekoppelde Nanoinjection en Elektrofysiologie test voor het screenen op bioactiviteit van verbindingen met behulp van de Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Deze video beschrijft een eenvoudige methode om vliegbeweging te kwantificeren en toont de uitgevoerde klimtest.  De vliegklimtest is een algemene test van de motorische functie die afhankelijk is van een negatieve geotaxis-respons.

Fly Climbing Assay: een methode om algemene voortbeweging in Drosophila melanogaster te testen

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren...

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een protocol met de Drosophila sensorisch neuron - dendritische arborization (da) neuron letsel model, dat in vivo combineert wonen imaging, twee-foton laser axotomy/dendriotomy en de krachtige vliegen genetische werkset, als een platform voor de screening potentiële initiatiefnemers en remmers van neuroregeneration.

Een Drosophila In Vivo letsel Model voor het bestuderen van de Neuroregeneration in de perifere en centrale zenuwstelsel

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Dit artikel biedt gedetailleerde protocollen voor het toebrengen van penetrerend traumatisch hersenletsel (PTBI) aan volwassen Drosophila en het onderzoeken van de resulterende neurogenese.

Stimuleren en analyseren van volwassen neurogenese in de drosophila centrale hersenen

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Ontdek een voorwaartse genetische aanpak om nieuwe neuroprotectieve genen te identificeren in Drosophila melanogaster. Deze methode omvat een klimtest, histologie en DNA-sequencing om inzicht te geven in neurodegeneratieve ziekten.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Meer video's verkennen