Ontwikkeling van gerichte lokale laesies bij Genomes (TILLING) populaties in kleine graangewassen door mutageen

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van robuuste TILLING-populaties met een hoge mutatiefrequentie door EMS mutagenesis in kleine graangewassen. TILLING populaties kunnen worden gebruikt voor functionele genomics, evenals voor forward genetische ruimte gen ontdekking in kleine graangewassen. De MET deze techniek ontwikkelde TILLING-populaties hebben hoge mutatiefrequenties, en dit protocol kan worden toegepast op elk genotype.

De Cel-1 test gebaseerde mutatie detectie kan worden uitgevoerd met behulp van basislabapparatuur. De belangrijkste stap is het bepalen van de optimale EMS-concentratie. Daarom moet een EMS-doseringscurve specifiek worden gemaakt voor de individuele bevolking.

Om te beginnen, weken 100 zaden met het genotype van belang in elk van de zes 250 milliliter glazen kolven, met 50 milliliter gedestilleerd water. Schud acht uur lang bij 100 RPM bij kamertemperatuur voor imbibition. Bereid vervolgens in een rookkap 50 milliliter EMS-oplossingen van vijf verschillende concentraties door EMS-vloeistof en gedestilleerd water te mengen.

Na imbibition, decanteren het water uit vijf flessen. Voeg 50 milliliter EMS-oplossing toe in elk van de vijf kolven die indrongen zaden bevatten. Schud de kolven 16 uur bij 75 RPM en kamertemperatuur.

Decanteer nu de EMS-oplossing in een lege afvalfles en giet de behandelde zaden op kaasdoek geplaatst op een lege afvalfles om apart te verzamelen voor elke behandeling. Gebruik extra water om te helpen gieten van de zaden. Spuit ook meerdere milliliters EMS-inactiverende oplossing op de wand van verontreinigde kolven.

En dompel gebruikte pipettips 24 uur onder in de oplossing. Inactief de gebruikte EMS-oplossing door één volume EMS-inactiverende oplossing toe te voegen om gedurende 24 uur te behandelen. Houd met behulp van een twist das de EMS behandelde zaden in de kaasdoek en was twee uur onder stromend leidingwater.

Na het wassen, transplanteer elk zaad afzonderlijk in worteltrainers die potgrond bevatten. Kweek planten op 20 tot 25 graden Celsius voor een 16 uur licht periode. Controleer na 15 dagen transplantatie de planten en tel het aantal zaden dat niet ontkiemde.

Gegevens van de overleving van planten registreren. Als de overlevingskans niet binnen 40 tot 60% is, voert u een tweede ronde van doseringsoptimalisatie uit met een gewijzigde concentratie tot het bereiken van de gewenste letaliteit van 40 tot 60%Na het mutagenesis-experiment verzamelt u het bladweefsel van M2-planten in een 96-putweefselopvangdoos. Weefsel wordt verzameld uit M2 planten die werden geteeld uit zelfvoorzienende M1 planten.

Van elke M1-installatie wordt één M2-plant getoond. Haal DNA af met behulp van een planten-DNA-extractiekit met een DNA-zuiveringssysteem volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laad vervolgens twee microliters van het DNA-extract in LV-platen met 16 sleuven.

Kwantificeer DNA met behulp van een spectrofotometer op golflengten van 260 en 280 nanometer. Verdun de DNA-concentratie tot 25 nanogram per microliter met nuclease-vrij water. Maak vier keer DNA-pools van 200 microliters door het DNA van elke put in de vier 96 putblokken te combineren tot een poolplaat met behoud van de rij- en kolomidentiteit van elk monster.

Bereid vervolgens een PCR master mix buis voor gen specifieke primers door toe te voegen in elke buis PCR buffer, vooruit en omgekeerde primers, en DNA polymerase volgens het manuscript. Aliquot de master mix in de putten van een 96 goed PCR plaat. Voeg vervolgens de samengevoegde DNA-sjabloon toe.

Laad de PCR-buizen in een thermische cycler en gebruik een touchdownprofiel om de PCR-reactie op de thermische cycler uit te voeren. Om heteroduplexen tussen niet-overeenkomende 100 000 100 PCR-producten in de thermische cycler in een ander programma uit te broeden. Voeg vervolgens 2,5 microliter zelfgemaakte Cel-1 endonuclease toe aan elk van de heteroduplexed PCR-producten.

Incubeer gedurende 45 minuten bij 45 graden Celsius. Daarna beëindigt u de Cel-1-reactie door 2,5 microliter van 0,5 molaire EDTA toe te voegen bij pH acht. Laad 30,5 microliter van elk cel-1 behandeld product gemengd met vijf microliter kleurstof op een 3%agarose gel en loop twee en een half uur op 100 volt.

Om mutanten te deconvoluteeren, de zygositeit van mutanten te bepalen door twee PCR-reacties uit te voeren voor individueel M2-DNA waarin de eerste reactie 2,5 microliter M2-DNA en 2,5 microliter van wild type DNA bevat en de tweede reactie slechts vijf microliter van M2-DNA bevat. Dit protocol toont EMS mutageenizing van kleine graangewassen en de karakterisering van mutant. De doseringscurve geeft optimale EMS-doses aan voor de gewenste overlevingskansen van 50% voor drie verschillende tarwesoorten.

De aanwezigheid van gemakkelijk identificeerbare fenotypes in de M2-populatie bevestigt de effectiviteit van mutagenese in kleine graanpopulaties. Hier zijn vier voorbeelden van de mutant fenotypes in M2 TILLING populaties, een albino mutant in een gerst M2 populatie, een chlorina mutant in een gerst M2 populatie, een bonte mutant met roze verkleuring in een Aegilops tauschii M2 populatie, en een low-tillering mutant in een Triticum monococcum M2 populatie. Een mutant identificatie met behulp van Cel-1 op agarose gel platforms toont een potentiële mutant zwembad geïdentificeerd uit 12 mutant zwembaden door unieke cleaved bands.

De deconvolutie van mutantenspoorten bepaalde de zygositeit van mutatie en hielp om de mutatie op te sporen tot individuele monsters. De A4 zwembad had heterozygoot mutaties, aangegeven door cleaved bands in zowel Box 4 en Box 4 wild type DNA monsters. De H5-pool bevatte homozygootmutaties omdat unieke gespleten banden alleen aanwezig waren in box 5 H5 wild type DNA monster.

De belangrijkste stap is het bepalen van de optimale concentratie van EMS om 40 tot 60% letaliteit te bereiken. Zodra een TILLING populatie met een hoge mutatiefrequentie is ontwikkeld, kan deze worden gebruikt voor functionele karakterisering van elk gen van belang. Bovendien kan de populatie een bron van nuttige genetische variatie zijn voor gewasverbetering.

TILLING is veelvuldelijk gebruikt voor functionele genomische studies in model- en gewasplanten. Het bereik van de verkregen mutaties kan worden missents, knock-outs, stille, of zelfs mispliced vormen. EMS is een mutageen.

Gebruik daarom de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het hanteren van het EMS. Ontsmetten restjes oplossingen en gebruikte pipet tips.