Name: Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer hoe je alfa-synucleine voorgevormde fibrillen genereert van monomeren voor Parkinson-modellen. Dit protocol omvat kwaliteitscontrole, sonificatie en stereotaxische injectie met glazen naalden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Michael J. Fox Foundation, het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte (NS099416) en het Weston Brain Institute.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li>
<li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li>
<li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Over+Quantity%3A+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
<li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
<li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).</li>
<li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson%27s+Disease+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li>
<li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li>
<li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein%2C+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788(2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li>
<li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li>
<li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li>
</ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk, en Caryel Sortwell zijn momenteel betrokken bij contractuele regelingen met de Michael J. Fox Foundation om de kwaliteitscontrole α-SYN materiaal gegenereerd door Proteos, Inc co-auteur Nicole Polinski, is een medewerker van de Michael J. Fox Stichting, die heeft gecontracteerd Proteos, Inc te produceren α-SYN monomeer. Coauteurs Megan Duffy, Laura Vandewalle-Daley, en Nicholas Kanaan hebben niets te onthullen.

De productie van α-SYN PFFs geschikt voor het zaaien van neuronen en leidt tot Lewy lichaam-achtige inclusies is afhankelijk van meerdere factoren en stappen. Een kritieke factor is dat de monomeren die voor het produceren van fibrillen worden gebruikt specifiek voor fibrilization4,9,14,15moeten worden geformuleerd. Als de monomeren niet voor fibrilization worden geformuleerd, kan fibrillen niet vormen of fibrillen die doen de vorm kan geen α-SYN pathologie veroorzaken. Evenzo, de buffer die de monomeren zijn in ook invloed fibrilization. Als dusdanig, voor de beste resultaten, zou de zoute concentratie ongeveer 100 mM NaCl en pH tussen 7,0 en 7,3 moeten zijn. Een eerste stap die veranderlijkheid introduceert is de methode waarbij het aanvankelijke eiwitgehalte wordt bepaald, met meting bij A280 waarschijnlijk om nauwkeurigere resultaten te veroorzaken en daarom de aangewezen methode is. De discrepantie in eiwitconcentratie kan de doeltreffendheid van het fibrilization proces verminderen evenals de veronderstelde PFF concentratie veranderen die in experimenten wordt gebruikt. Beide kunnen leiden tot een afname van het zaaien efficiëntie en batch variatie tussen experimenten.
Initiële kwaliteitscontrole stappen zullen bevestigen kritieke kenmerken van de PFFs, in het bijzonder dat zij een vezelachtig conformatie (elektronenmicroscopie), bevatten amyloid structuren (thioflavin T assay), en zijn pelletable (sedimentatie assay). Het is belangrijk op te merken dat de resultaten van de thioflavin T-assay zal fluctueren met de tijd en zijn niet een directe maatregel van de hoeveelheid amyloid structuren aanwezig zijn, in plaats van, de thioflavin T-assay mag alleen worden gebruikt als een indicator van amyloid structuren aanwezigheid binnen het monster. Thioflavin T wordt typisch gebruikt in in-vitro assays, zoals de bovengenoemde assay om de fibrillen bevatten amyloid structuren te tonen. Alternatief, thioflavin S wordt gebruikt in weefsel op te sporen amyloid structuren, zoals weergegeven in Figuur 7. Met betrekking tot de sedimentatie Assay, de resultaten blijkt alleen dat de PFFs zijn voornamelijk gevonden in de pellet bare Fractie. Als de monsters worden uitgevoerd in denaturerende omstandigheden, een enkele prominente band van ongeveer 14 kDa, de grootte van α-SYN monomeren, is aanwezig op de gels. Dit is in tegenstelling tot de veelvoudige banden huidig bij hogere moleculaire gewichten die met PFFs zouden worden verwacht als een inheems of niet-denaturerende gel werd gebruikt. Ten slotte is het succesvol passeren van al deze initiële kwaliteitscontrole stappen niet garanderen α-SYN inclusie zaaien activiteit. Om deze reden, moeten de de cultuur experimenten van de cel of een kleine cohort van chirurgisch-ingespoten dieren worden gebruikt om de doeltreffendheid van de PFFs vóór gebruik in grotere experimenten te testen.
Sonication is een cruciale stap in het proces en parameters zullen verschillen, afhankelijk van het model van geen ultrasoonapparaat gebruikt. Sonication parameters moeten worden toegepast en geverifieerd om aan te tonen dat korte PFF fragmenten zijn geproduceerd. Fibril grootte heeft invloed op het zaaien, met kortere fibrillen zaaien efficiënter. Hoewel kortere fibrillen zaad efficiënter, dit effect plateaus en de optimale pff lengte is ongeveer 50 nm4,18. Het is ook belangrijk om de steekproeven niet te bewerk en de PFFs aan bovenmatige hitte bloot te stellen, aangezien dit het zaaien efficiency kan verminderen. Deze sonicated PFFs moeten worden getest op de werkzaamheid in de kleine cel cultuur of in vivo experimenten voorafgaand aan het gebruik in grotere schaal experimenten. Aangezien de verschillende sonische zittingen het potentieel hebben om veranderlijkheid te introduceren, zouden de experimentele behandelingsgroepen moeten dienovereenkomstig worden gepland.
Bij het leveren van PFFs in vivo, de lokalisatie van de injectie site (s) en het totale bedrag PFFs gebruikt kan invloed hebben op het aantal neuronen dat zal de ontwikkeling van inclusies, alsmede de omvang van neurodegeneratie7,14. De coördinaten in het Protocol bieden een plaats om te beginnen, maar moeten worden getest in het lab om ervoor te zorgen de gewenste doelregio ontwikkelt α-SYN pathologie voorafgaand aan het gebruik in grootschalige experimenten. Indien gewenst, kan het volgen van kleurstof of fluorescente parels als manier worden gebruikt om het regionale richten te testen alvorens PFFs te gebruiken. De hoeveelheid PFFs die in vivo wordt gebruikt varieert tussen groepen, waarbij de meeste groepen met een totaal tussen 5 en 20 µ g PFFs bij één of verdeeld tussen twee injectieplaatsen1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14. aangezien het aantal injectieplaatsen, plaats van injectieplaatsen, en hoeveelheid PFFs ingespoten resultaten en vooruitgang van de synucleinopathy kan beïnvloeden, zouden de stroomafwaartse uitkomsten van de gebruikte parameters voorafgaand aan het gebruiken van het model moeten worden gekenmerkt om test potentiële interventies of het onderzoeken van temporele kenmerken van het model.
Bij het selecteren van een model te gebruiken voor het testen van therapeutische of het bestuderen van progressie van de ziekte, moet het gebruikte model worden geselecteerd om het beste antwoord op de vraag gesteld. Niet alle modellen zullen beschikken over bepaalde ziekte kenmerken van PD, of bieden het tijdschema nodig om potentiële interventies te testen. De PFF model recapituleert belangrijkste kenmerken van PD, zoals α-SYN pathologie en neurodegeneratie, en kan leiden tot een bescheiden motorische beperkingen. Het model biedt een voorspelbare en langdurige tijd-cursus, waar inclusies vorm maanden vóór neurodegeneratie. Hierdoor kunnen onderzoekers de verschillende fasen onderzoeken en exploiteren gedurende de langdurige progressie van de synucleinopathy. De huidige en toekomstige gebruik van het model in het algemeen zal naar verwachting gunstig zijn in de studie van de progressie van de ziekte en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

De ziekte van Parkinson (PD) wordt voornamelijk gekenmerkt postmortem door twee belangrijke pathologische kenmerken: wijdverbreide en progressieve Alfa-synuclein (α-SYN) pathologie, en nigrostriatal degeneratie. Na injectie in wild type muizen of ratten, α-SYN voorgevormde fibrillen (PFFs) induceren progressieve accumulatie van pathologische α-SYN, die kan resulteren in langdurige degeneratie van Substantia nigra pars Compacta (SNpc) dopamine neuronen in de loop van vele maanden, evenals sensorimotor tekorten1,2,3,4,5,6. Neuronen worden blootgesteld aan α-SYN fibrillen, hetzij via directe intracerebrale injectie of toegevoegd aan de media van gekweekte neuronen. Wanneer de PFFs worden genomen in de neuronen, de PFFs handeling "zaad" de vorming van inclusies door middel van sjablonen, en accumulatie van endogene α-SYN in phosphorylated inclusies1,7,8, 9. Inclusies delen gelijkaardige eigenschappen aan Lewy organismen: bevattend α-SYN phosphorylated bij serine 129 (pSyn), ubiquitin, en P62; bezitten amyloid quaternaire structuren zoals aangetoond met positieve thioflavin kleuring; en zijn bestand tegen proteïnase K spijsvertering1,3,5,7,8,9,10,11, 12. PFF blootstelling leidt tot α-SYN inclusie vorming in de primaire en sommige vereeuwigd neuronen in de cultuur, evenals muizen, ratten, en niet-menselijke primaten in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Het is belangrijk op te merken dat PFFs niet zal leiden tot α-SYN inclusie vorming in alle modellen van de cel cultuur en sommige gekweekte neuronen zal zaad beter dan anderen.
Een ander belangrijk kenmerk van de in vivo α-SYN PFF model is de verschillende sequentiële pathologische fasen die ontstaan over enkele maanden. In knaagdieren, na intrastriatal injectie, α-SYN inclusie vorming pieken in het algemeen binnen de SNpc en vele corticale regio's binnen 1-2 maanden. Deze aggregatie piek wordt gevolgd door nigrostriatal degeneratie ≈ 2-4 maanden later1,3,5. Deze afzonderlijke pathologische stadia verstrekken onderzoekers het platform waarmee om strategieën te bestuderen en te ontwikkelen die 1) verminderen α-SYN samenvoeging, 2) duidelijke reeds gevormde α-SYN opneming, en/of 3) verhindert verdere neurodegeneratie. De PFF model biedt verschillende voordelen en nadelen ten opzichte van neurotoxiciteit, transgene, en virale vector gemedieerde α-SYN overexpressie modellen zoals eerder beoordeeld6. De keuze van welk model of benadering te nemen moet worden bepaald door welk model het beste past bij de vraag van de onderzoekers vragen.
Hoewel het PFF model met succes door vele laboratoria is gebruikt, zijn er nog groepen die inconsistentie met het produceren van fibrillen en het veroorzaken van verenigbare α-SYN pathologie14hebben ervaren. Voorbeelden van inconsistenties variëren van PFFs die weinig of geen α-SYN pathologie produceren, batch tot batch zaaien efficiëntie, en zelfs het falen van fibrillen te vormen. Aldus, is de normalisatie van α-SYN PFF generatie en in vivo toepassing kritiek om voor nauwkeurige interpretaties betreffende de invloed van nieuwe therapeutische interventies toe te staan. Het volgende protocol schetst de stappen die nodig zijn voor het genereren van PFFs van α-SYN monomeren, de in vitro kwaliteitscontrole van de PFFs eenmaal gevormd, de sonication en meting van PFFs voorafgaand aan het gebruik, en suggesties om succesvol te vergemakkelijken in vivo injectie van PFFs in ratten of muizen.

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco&rsquo;s phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alpha-synuclein (gefosforyleerd op serine 129) antilichaam</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alpha-synuclein antilichaam</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoonzuur</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>Doorzichtige medische krimpslang (0,036" binnendiameter)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>Doorzichtige medische krimpslang (0,044" binnendiameter)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>Kopersulfaat</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoTop verwarmd deksel</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/koolstof gecoate elektronenmicroscoop raster</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Glas capillaire buis (0,53 mm buitendiameter; 0,09 mm binnendiameter; 54 mm lengte)</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>Glas naald puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke alpha-synuclein monomer voor het genereren van voorgevormde fibrillen</td><td>Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>Muis alpha-synuclein monomer voor het genereren van voorgevormde fibrillen</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>Oranje medische krimpslang (0,021" binnendiameter)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica 3,2 mm tip</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Q125 sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavine S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavine T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit</td><td>Genscript</td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetaat</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van alfa-synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Gebruik van de in vivo Alfa-synuclein voorgevormde fibril (α-SYN PFF) model van synucleinopathy is aan populariteit wint onder onderzoekers gericht op de ziekte van Parkinson-model synucleinopathy en nigrostriatal degeneratie. De standaardisering van α-SYN PFF generatie en in vivo toepassing is cruciaal om te zorgen voor een consistente, robuuste α-SYN pathologie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de generatie van fibrillen van monomeer α-SYN, post-fibrilization kwaliteitscontrole stappen, en voorgestelde parameters voor een succesvolle neurochirurgische injectie van α-SYN PFFs in ratten of muizen. Beginnend met monomeer α-SYN, komt fibrilization over een incubatieperiode van 7 dagen voor terwijl het schudden bij optimale buffer voorwaarden, concentratie, en temperatuur. Post-fibrilization kwaliteitscontrole wordt beoordeeld door de aanwezigheid van pelletable fibrillen via sedimentatie Assay, de vorming van amyloid conformatie in de fibrillen met een thioflavin T Assay, en elektronen microscopische visualisatie van de fibrillen. Overwegende dat een succesvolle validatie met behulp van deze tests is noodzakelijk voor succes, ze zijn niet voldoende om te garanderen PFFs zal zaad α-SYN opneming in neuronen, als zodanig aggregatie activiteit van elke PFF partij moet worden getest in de cel cultuur of in pilot Animal cohorten. Voorafgaand aan het gebruik, PFFs moet worden sonicated onder nauwkeurig gestandaardiseerde omstandigheden, gevolgd door onderzoek met behulp van elektronenmicroscopie of Dynamische lichtverstrooiing te bevestigen fibril lengtes zijn binnen optimale grootte bereik, met een gemiddelde lengte van 50 nm. PFFs kan dan worden toegevoegd aan cel cultuurmedia of gebruikt bij dieren. Pathologie detecteerbaar door immunokleuring voor phosphorylated α-SYN (psyn; serine 129) is duidelijk dagen of weken later in de cel cultuur en knaagdieren modellen, respectievelijk.

De generatie van fibrillen van α-SYN monomeren begint met het bepalen van de concentratie van de monomeren. Zowel de test van de A280 als de meting van de absorptie op 280 nm kan gebruikt worden om het eiwitgehalte te meten; de resultaten van de test, echter, suggereerden een hogere concentratie dan de A280 methode. PFFs afgeleid van muis α-SYN monomeer had een waarde van 14,05 ± 0,22 en een A280 van 8,05 ± 0,03 µ g/µ L (Figuur 1). Evenzo bleek PFFs afgeleid van humaan α-SYN monomeer ook bij een hogere concentratie, met een waarde van 12,95 ± 0,38 en een A280 van 7,83 ± 0,05 µ g/µ L (Figuur 1). De A280 metingen zijn specifiek voor α-SYN op basis van de opneming van de extinctie coëfficiënten en deze resultaten werden gebruikt om de monomeren te verdunnen vóór 7-daagse incubatie.
Voorafgaand aan de incubatie was de vloeistof met de α-SYN monomeren duidelijk, maar moet troebel na fibril vorming verschijnen. Onderzoek met transmissie elektronenmicroscopie bevestigde de aanwezigheid van lange fibrillen, metend 10-20 nm breed (Figuur 4). Ter vergelijking, α-SYN monomeren waren nauwelijks zichtbaar zonder waarneembare vorm zichtbaar (Figuur 4). Met visuele bevestiging van fibrillair structuren, amyloid conformatie van de fibrillen is het volgende kenmerk van PFFs dat moet bevestigd met behulp van een thioflavin T assay. Thioflavin T vertoont versterkte fluorescentie bij het binden aan amyloid; aldus, wijst het verhoogde fluorescente signaal van de steekproeven op aanwezigheid van amyloid. Als voorbeeld, thioflavin in dPBS produceerde een signaal van 3.287 ± 580 relatieve fluorescente eenheden (RFU), muis α-SYN monomeer produceerde een signaal van 4.174 ± 158 RFU, en de muis PFFs produceerde een signaal van 59.754 ± 6.224 RFU (Figuur 5). In vergelijking, produceerde het menselijke α-SYN monomeer een gelijkaardig signaal van 4.158 ± 105 RFU aan het monomeer van de muis, en het menselijke PFFs veroorzaakte een hoger signaal van 1.235.967 ± 113.747 RFU in vergelijking tot muis PFFs (Figuur 5). Om de aanwezigheid van pelletable fibrillen te beoordelen, werd een sedimentatie assay uitgevoerd. Fibrillen zal pellet met centrifugeren. In zowel de muis en de menselijke PFF monsters, moet de bovendrijvende fractie hebben meer eiwitten in de pellet dan de bovendrijvende (Figuur 6). In tegenstelling, de meerderheid van het eiwit van de muis en de menselijke monomeren was aanwezig in de bovendrijvende, met weinig aanwezig in de pellet (Figuur 6). Met de PFFs zichtbaar aanwezig door elektronenmicroscopie, amyloid structuren aanwezig, en fibrillen pelletable, de PFFs geslaagd alle in vitro kwaliteitscontrole stappen.
Zowel werden de muis als de menselijke PFFs sonicated om PFFs van aangewezen lengten te veroorzaken voor het zaaien van α-SYN opneming4,18. PFFs werden verdund tot de gewenste concentratie van 4 µ g/µ L en sonicated. Onmiddellijk voorafgaand aan de operatie, werden 25 representatieve fibrillen afgebeeld door elektronenmicroscopie en gemeten aan vlek controle de fibril grootte. De sonicated muis PFFs gemeten 48,8 ± 3,1 nm, terwijl de menselijke PFFs gemeten 52,1 ± 4,4 nm in lengte; PFFs van beide soorten waren daarom de aangewezen lengte (50 nm of minder) om het zaaien activiteit te veroorzaken. Het uitvoerigere onderzoek van ongeveer 500 fibrillen openbaarde de gemiddelde lengte en de lengte distributie van sonicated muis fibrillen. De gemiddelde lengte was 44,4 ± 0,6 nm, met 86,6% van het PFFs meten van 60 Nm of minder (Figuur 4). In vergelijking, menselijke PFFs gemiddeld 55,9 ± 1,1 nm met 69,6% van PFFs het meten van 60 Nm of minder (Figuur 4).
Na intrastriatal injectie van sonicated muis PFFs in ratten zoals eerder beschreven3,5, een reeks van weefselsecties werden verwerkt op 2 maanden na de operatie, wanneer het aantal van de opneming met neuronen is bekend dat piek in de SNpc, voor de bevestiging van phosphorylated α-SYN inclusies5. Inclusie dragende neuronen, zoals aangegeven door immunohistochemische kleuring voor pSyn (antilichaam in de tabel van materialen) aanwezig zijn binnen de SNpc (Figuur 7), evenals andere regio's in de hersenen die innervate de striatum (anterior reuk kern, motor, cingulate, Piriform, prelimbisch, somatosensorische, entorhinale, en insulaire cortices, amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Deze inclusies delen gelijkaardige eigenschappen met Lewy organismen, zoals bindende thioflavin S, en weerstand van totale α-SYN aan proteïnase K (Figuur 7), zoals aangetoond door immunohistochemische kleuring (antilichaam en proteïnase K in lijst van materialen) . Bevestiging van zaaien in de hersenen geeft aan de in vivo kwaliteitscontrole is doorgegeven, en de hoeveelheid PFFs eerder bevroren en opgeslagen uit dezelfde partij kan worden sonicated onder identieke parameters, met lengtes gevalideerd, in grotere experimenten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Figuur 1 . Methodes voor de generatie van α-SYN fibrillen. Schets van de stappen die nodig zijn om fibrillen te produceren van α-SYN monomeren. Monomeren worden gedurende 10 min (15.000 x g, bij 4 °c) gecentrifugeeerd. Bovendrijvende wordt overgebracht naar een schone buis en de eiwitconcentratie wordt bepaald door of de absorptie bij 280 nm, of een test van het doel van het. Grafiek toont de concentraties van mens en muis α-SYN monomeren. Kolommen geven de groep betekent, foutbalken vertegenwoordigen ± 1 standaardfout van het gemiddelde. Na eiwitconcentratie wordt bepaald, α-SYN monomeren worden verdund, kort gewerveld en uitgebroed voor 37 ° c gedurende 7 dagen, terwijl schudden op een orbitale mixer ingesteld op 1.000 RPM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> Figuur 2 . Kleuring methoden voor transmissie elektronenmicroscopie. Diagram van negatieve kleuring voor elektronenmicroscopie. A) beelden die de elektronen microscopisch specimen rasters afbeelden. Het rooster heeft een doffe of lichte kant en een glanzende of donkere kant. De glanzende/donkere kant is bekleed met een formvar/Carbon ondersteuning film. B) illustratie van de kleuring procedure. De grid is zwevend glanzend/donkere kant naar beneden op de eerste druppel van ddH2O voor 1 min en de overmaat is Wicked weg met filtreerpapier. Het proces wordt herhaald met de tweede druppel van ddH2o, verdunde PFFs of monomeren, twee druppels uranyl acetaat, en twee extra druppels ddH2o. grids kunnen worden opgeslagen in een raster vak totdat het beeld. Schaalbalk = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Figuur 3 . Montage van aangepaste glas naald spuiten. Schema van de stappen die nodig zijn om glas naald bijgevoegde spuiten monteren. Siliconen glas capillaire buizen worden getrokken en in het midden gesneden om glas naalden te produceren. Shrink wrap slang wordt gebruikt om de metalen naald voor te bereiden en vormen een innerlijke afdichting wanneer de glazen naald wordt geschoven op de metalen naald. Twee extra lagen van krimp-wrap slang die overlapping van de basis van de glazen naald en de metalen naald worden achtereenvolgens toegevoegd en warmte toegepast op de glazen naald veilig en vormen een waterdichte afdichting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Figuur 4 . Visualisatie van α-SYN monomeren en α-SYN fibrillen via transmissie elektronenmicroscopie. Representatieve handtekeningen van α-SYN monomeren en fibrillen. Top panelen: muis en menselijke α-SYN monomeer. Middelste panelen: volledige lengte muis en menselijke α-SYN PFFs. onderste panelen: muis en menselijke α-SYN PFFs na sonication. Onderste grafiek: distributie van sonicated muis en menselijke α-SYN PFF lengtes. Schaalbalk = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Figuur 5 . Bevestiging van amyloid structuren door thioflavin T assay. Meting van fluorescent signaal van muis en menselijk α-SYN monomeer en PFF steekproeven. Links: resultaten van de muis α-SYN monomeren en α-SYN PFFs. Rechts: resultaten van menselijke α-SYN monomeren en α-SYN PFFs. In elke grafiek wordt een dPBS negatief besturingselement weergegeven. Alle metingen worden uitgedrukt als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU). Kolommen geven de groep betekent, foutbalken vertegenwoordigen ± 1 standaardfout van het gemiddelde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Figuur 6 . Sedimentatie assay voor pelletable α-SYN. beelden van Coomassie gekleurd gels. Getoonde bands zijn op ongeveer 14 kDa gebaseerd op de eiwit ladder. Links: muis monomeer en PFFs. Rechts: menselijke monomeren en PFFs. Voor alle monomeer-en PFF monsters worden de opnieuw gesuspendeerde pellet (P) en bovendrijvende (S) weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Figuur 7 . Eigenschappen van opneming in het Rat model dat α-SYN pathologie bevestigt. Representatieve handtekeningen van de Substantia nigra pars Compacta op 2 maanden na de injectie. Links: neuronen met pSyn en counterstained met cresyl Violet. Midden: Thioflavin S positieve neuronen. Rechts: α-SYN-bevattende inclusies bestand tegen proteïnase K. scale Bar = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">gelieve Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Het doel van dit artikel is het schetsen van de stappen die nodig zijn voor de generatie van fibrillen van monomeer Alfa-synuclein, latere kwaliteitscontrole, en het gebruik van de voorgevormde fibrillen in vivo.

Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Het Alpha-Synuclein Preformed Fibril model wordt door laboratoria wereldwijd gebruikt om synucleinopathieën te bestuderen. Hoewel het model met succes is gebruikt door vele laboratoria, hebben sommige groepen inconsistenties ervaren die fibrils genereren en consistente alfa-synuclein pathologie produceren. We hopen dat dit protocol, dat de generatie fibrils van alfa-synuclein monomeren en het gebruik van voorgevormde fibrils in vivo beschrijft, vragen kan beantwoorden die onderzoekers hebben over het gebruik van het model.Het Alpha-Synuclein Preformed Fibril-model vat de belangrijkste kenmerken van de ziekte van Parkinson samen, zoals alfa-synucleinpathologie en neurodegeneratie. En het is aangetoond dat het leidt tot bescheiden motorische beperkingen in sommige dierlijke modellen. De vorming van insluitsels die fosforyleerde alfa-synuclein en langdurige tijdskoers naar neurodegeneratie bevatten, biedt onderzoekers verschillende stadia gedurende de progressie van de synucleinopathie, om te bestuderen en te targeten voor potentiële therapeutische interventies.Demonstreren van de voorbereiding van aangepaste glazen naalden, is onze lab technicus, Christopher Kemp. Om deze procedure te beginnen, ontdooien alpha-synuclein monomeren op ijs. Opnieuw suspened de ontdooide monomeren door zachtjes flicking op de buis.En centrifuge op 15,000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een schone 1,5 mL microcentrifugebuis en neem het overgedragen bedrag. Verdun de monomeren met 1x dPBS tot een uiteindelijke concentratie van 5 mg per mL.Kort vortex te mengen, en kort centrifuge om alle vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis. Gebruik vervolgens lijmfolie om het deksel van de microcentrifugebuis gesloten te maken. Plaats de buis in een orbitale thermo mixer met een deksel gedurende zeven dagen op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 1.000 rpm.Aan het einde van zeven dagen moet de inhoud van de buis troebel lijken. Ten eerste, don alle nodige persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, een lab jas, en een gezichtsschild. Bevestig vervolgens in een celkweekkap een sonde met een diameter van 3,2 mm aan de converter.Stel de sonicators amplitude op 30%en puls op een seconde op en een seconde uit en de tijd op een minuut. Ontdooi de fibrils bij kamertemperatuur, en terwijl nog in de kweekkap, verdun de fibrils met steriele dPBS. Demp vervolgens een laboratoriumweefsel met 70% ethanol en gebruik dit om de sonde van de sonicator af te vegen om het schoon te maken.Dompel het puntje van de sonde onder in dubbel gedestilleerd water en pulseer 10 keer om de sonde verder schoon te maken. Daarna veeg je de sonde droog met een laboratoriumweefsel. Plaats de gereinigde sondepunt in de buis van verdunde fibrils en plaats de punt aan de onderkant van de buis.Sonicate de verdunde fibrils met behulp van de eerder ingestelde parameters tijdens het verplaatsen van de sonde op en neer tijdens elke puls om ervoor te zorgen dat alle fibrils in de vloeistof worden gesoniceerd. Na de sonicatie, kort centrifugeren voor een seconde op 2,000 g om alle vloeistof te verzamelen van de zijkanten van de buis. Dompel de sondepunt onder in 1%SDS en pulseer 10 keer om de sonde schoon te maken.Verwijder vervolgens de punt van de SDS en dompel deze onder in dubbel gedestilleerd water en pulseer 10 keer. Veeg de sonde met een lab weefsel gedempt met 70%ethanol en veeg het droog met een droog lab weefsel. Maak de sonde los van de converter en sla op.Daarna veeg je alle oppervlakken in de kap weg met 1%SDS, gevolgd door 70% ethanol. Om te beginnen, plaats een siliconen glazen capillaire buis in een glazen naald trekker. Zet het verwarmingselement aan en laat de bijgevoegde gewichten de verwarmde glazen capillaire buis strekken.Gebruik vervolgens een schaar om de getrokken glazen bolletje op het dunste punt in het midden te snijden en de glazen naald uit de glazen naaldtrekker te verwijderen. Gebruik vervolgens een schaar om een lengte van krimpfolie buizen te snijden tot ongeveer 40 mm. Schuif de krimpfolie over de metalen naald van een 10 microliter schuine spuit.Gebruik een open vlam om de krimpfolie op de naald te verwarmen en vast te houden, terwijl u ervoor zorgt dat de naald wordt gedraaid om de warmte gelijkmatig toe te passen. Schuif het grotere uiteinde van de getrokken glazen naald voorzichtig over de metalen naald van de spuit. Snijd hierna een lengte van krimpfolie tot ongeveer 40 mm en schuif deze voorzichtig over de glazen naald om de basis van de glasnaald en de metalen naald van de spuit te overlappen.Gebruik een open vlam om de krimpfolie te verwarmen om de glazen naald aan de metalen naald te beveiligen. Om de naald verder te beveiligen en mogelijke lekken te voorkomen, snijdt u een extra lengte van krimpfolie tot ongeveer 40 mm en schuift u deze voorzichtig over de glazen naald om de basis van de glazen naald en de metalen naald van de spuit te overlappen. Gebruik een open vlam om de krimpfolie te verwarmen om de glazen naald aan de metalen naald te beveiligen.Gebruik vervolgens een schaar om de glazen naald te trimmen, zodat de punt ongeveer 8 mm lang is. Om de naald te testen, vul een 1 mL spuit met een bijgevoegde 26 meter naald met gedestilleerd water. Verwijder de metalen zuiger van de aangepaste glasnaalspuit en steek de naald van de met water gevulde spuit in de basis van de aangepaste spuit.Inspecteer de interface van de glazen naald en de metalen naald op lekken en bevestig een gestage waterstroom. Vul vervolgens een microcentrifugebuis met gedestilleerd water. Gebruik de aangepaste glazen naaldspuit om het gedestilleerde water in te trekken.Inspecteer de naald om te bevestigen vloeistof wordt genomen in de spuit en dat er geen bubbels. Als er bubbels zijn, of als het water niet in de naald wordt opgesteld, kan het trimmen van de naald helpen de druk te verlichten. Bewaar hierna de spuit voorzichtig met de bijgevoegde glazen naalden, in de spuitdozen tot het nodig is voor operaties.Onderzoek met transmissieelektronenmicroscopie bevestigt de aanwezigheid van lange fibrils. Ter vergelijking, alpha-synuclein monomeren zijn gerst zichtbaar en hebben geen waarneembare vorm. Analoïde bevestiging van de fibrils wordt vervolgens bevestigd met behulp van een Thioflavine T Assay.Een representatieve test toont de dPBS en muis monomeren produceren een lager signaal in relatieve flouresent eenheden in vergelijking met muis PFFs. Menselijke alfa-synuclein monomeer produceert een vergelijkbaar signaal aan muis monomeer. Terwijl de menselijke PFFs eveneens een hoger signaal dan monomeren produceren.Om de aanwezigheid van pelitible fibrils te bespepen, wordt een sedimentatietest uitgevoerd. In zowel de muis en de menselijke PFF monsters, de supernate overtreding moet meer eiwit in de pellet dan de supernatant. Daarentegen is het grootste deel van het eiwit van de muis en menselijke monomeren aanwezig in de supernatant met weinig aanwezig in de pellet.Zowel muis als menselijke PFF's zijn gesoniceerd om PFF's van de juiste lengtes te produceren voor het zaaien van alfa synuclein insluitsels. Een uitgebreid onderzoek van ongeveer 500 fibrils toont aan dat de gemiddelde lengte van muisfibrils ongeveer 44 nanometer is. Met 86,6% van de PFF's van 60 nanometer of minder.Menselijke PFF's hebben echter een gemiddelde lengte van ongeveer 55,9 nanometer met 69,6% van de PFF's van 60 nanometer of minder. In vivo wordt onderzoek naar de werkzaamheid van PFF bevestigd met behulp van immunohistochemie. Insluitsels gevormd in de substantia nigra, delen vergelijkbare eigenschappen als Lewy lichamen in dat ze fosforyleerde alfa synuclein bevatten, bevatten aminloyed structuren, en vlek met thioflavine S, en zijn resistent tegen Proteinase K spijsvertering.Sonicatie kan het individuele soniceren blootstellen aan aerosolized voorgevormde fibrils. Als zodanig moet de juiste veiligheidskleding worden gedragen en sonicatie uitgevoerd in een kap om het risico van blootstelling te minimaliseren.

generation-alpha-synuclein-preformed-fibrils-from-monomers-use

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the injection of alpha-synuclein fibrils into a mouse to induce neuroinflammation. The fibrils are injected intraperitoneally into a transgenic mouse expressing mutated alpha-synuclein proteins. Upon reaching the central nervous system, the fibrils enter neurons and induce aggregation of the mutated proteins. The aggregates spread to neighboring neurons, microglia, and astrocytes. Recognition of the aggregates triggers microglia to induce neuroinflammation, damaging the...

Induction of Neuroinflammation in Mice via Injection of Alpha-Synuclein Fibrils

This video demonstrates the process of quantifying alpha-synuclein accumulation in embryonic mouse dopamine neurons pre-treated with alpha-synuclein pre-formed fibrils. It outlines the steps for fixing, staining, and quantifying the dopamine neurons containing alpha-synuclein aggregates using immunofluorescence.

Studying Alpha-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons

Eiwitten kunnen ofwel een natuurlijke structuur aannemen ofwel verkeerd vouwen in onoplosbare amyloyde. Omstandigheden die de verkeerd vouwende route bevorderen, leiden tot de vorming van verschillende soorten amyloyde fibrillen. De hier beschreven methoden maken een snelle omzetting van natuurlijke eiwitten in amyloyde in vitro mogelijk.

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

Een ELISA die een nieuwe kwantitatieve aanpak biedt, wordt beschreven. Het detecteert specifiek ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in een transgenisch muismodel (M83) van synucleïnopathie door gebruik te maken van verschillende antilichamen tegen ofwel de Ser129 gefosforyleerde αS-vorm of het C-terminale deel van het eiwit.

Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van steeds onoplosbaarder/geaggregeerd alfa-synucleïne (α-syn) uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Door het gebruik van buffers met toenemende detergentsterkte en hoogsnelheids ultracentrifugeringstechnieken, kunnen de variabele eigenschappen van α-syn-aggregatie in zieke en niet-zieke weefsel worden onderzocht.

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen in het peritoneum of de tong van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen, die humaan alfa-synucleine met familiaire A53T mutatie en vuurvlieg luciferase tot expressie brengen, kunnen neuropathologie induceren, waaronder neuroinflammatie in het centrale zenuwstelsel.

Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neuronale α-synucleinaccumulatie in primaire muis dopamine neuronen te bestuderen. Fosforyleerde α-synuclein aggregaten in neuronen worden geïnduceerd met voorgevormde α-synucleinfibrils. Geautomatiseerde beeldvorming van immunofluorescently gelabelde cellen en onbevooroordeelde beeldanalyse maken dit robuuste protocol geschikt voor medium-to-high doorvoerscreening van geneesmiddelen die α-synucleinaccumulatie remmen.

Het bestuderen van voorgevormde Fibril Geïnduceerde α-Synuclein Accumulatie in primaire embryonale muis Midbrain Dopamine Neuronen

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Dit protocol beschrijft een methode voor intranasale toediening van α-synucleïneaggregaten. Deze methode geeft inzicht in de voortplanting van α-synucleïne van het reukslijmvlies naar de bulbus olfactorius bij de ziekte van Parkinson.

Techniek voor intranasale toediening van α-synucleïne-aggregaten

Leer hoe je alfa-synucleine voorgevormde fibrillen genereert van monomeren voor Parkinson-modellen. Dit protocol omvat kwaliteitscontrole, sonificatie en stereotaxische injectie met glazen naalden.

Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Meer video's verkennen