Name: Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer een vereenvoudigde methode voor kortetermijnkweek van vrij zwevende hersenschijven uit volwassen menselijk breinweefsel. Deze techniek maakt biochemische en immunohistochemische analyses mogelijk voor onderzoek naar neurodegeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (post-doctoraats Fellowship PNPD/INCT-HSM naar A.F. en pre-Doctoral Fellowship to N.D.M.) en FAEPA. G.M.A. bezit een Master Fellowship van FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. bezit een CNPq Research Fellowship. We danken de patiënten en hun families voor het doneren van de door de weefsels voor dit onderzoek. We willen de steun van bewoners, verpleegkundigen, technici en het CIREP-team erkennen, van het klinisch ziekenhuis van de medische school van Ribeirão Preto, de Universiteit van São Paulo, die in verschillende stadia van het proces heeft geholpen.

Levende volwassen hersenweefsels werden verkregen van patiënten die resectieve Neurochirurgie ondergingen voor de behandeling van pharmacoresistant temporale kwal epilepsie (Figuur 1A). Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het klinieken ziekenhuis op de medische school Ribeirão Preto (17578/2015), en patiënten (of hun juridisch verantwoordelijke persoon) spraken de voorwaarden voor geïnformeerde toestemming af en ondertekenden deze. De verzameling van het weefsel werd gedaan door het Neurochirurgie team in het epilepsie chirurgie centrum (CIREP-clinics Hospital aan de Ribeirão Preto Medical School, Universiteit van São Paulo, Brazilië).
1. sterilisatie van materialen
Opmerking: alle materialen en oplossingen moeten vóór gebruik gesteriliseerd worden.
<ol><li>Steriliseer alle chirurgische gereedschappen en vibratome snijden materiaal (meshouder, preparaat schijf, buffer lade) in een droge steriliserend oven voor 4 uur bij 180 °c.</li>
	<li>Steriliseren temperatuurgevoelig materiaal of apparatuur door UV-of gamma-bestraling.</li>
	<li>Steriliseren media en oplossingen door autoclavation of filtratie door middel van 0,22 μm porie membranen.</li>
</ol>2. voorbereiding van de oplossingen
<ol><li>Bereid 15-20 mL transportoplossing voor: 50% v/v Hanks ' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) pH 7,4, 50% v/v Basaal medium voor het onderhoud van postnatale en volwassen hersenneuronen (tabel met materialen), aangevuld met 10 mm 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfoninezuur (Hepes), 3 mg/mL glucose en 33 μg/mL gentamicine. Opmerking: de transport oplossing moet gedurende ten minste 20 minuten voorafgaand aan de monsterafname gekoeld en zuurstofrijk (borrelend met Manager gas) zijn.</li>
	<li>Bereid 300 ml van de snijden oplossing (HBSS aangevuld met 10 mm Hepes en 3 mg/ml glucose) en koel het af in een vriezer op het punt van de initiële kristalvorming.</li>
	<li>Bereid 20 mL kweekmedium voor: Basaal medium voor het onderhoud van postnatale en volwassen hersenneuronen (tabel met materialen) aangevuld met 1% L-glutamine derivaat (tabel vanmaterialen), 2% supplement voor neurale cultuur (tabel van Stoffen), 1% penicileen/streptomycine en 0,25 μg/ml amfotericine B.</li>
</ol>3. opzet van de snijapparatuur
Opmerking: dit protocol wordt idealiter uitgevoerd met de hulp van een collega als gevolg van de logistiek van monsterafname in de chirurgische ruimte.
<ol><li>In een emmer zout-toegevoegd ijs, laat de snijden oplossing rusten onder de Manager mengsel borrelen (95% O2,5% co2) voor ten minste 20 minuten vóór gebruik.</li>
	<li>Bereid een blok van 3% agarose (ongeveer 2 cm x 2 cm x 2 cm) en superlijm het op de viatome specimen schijf om extra mechanische ondersteuning te creëren voor het weefselmonster tijdens het snijden (Figuur 1E).</li>
	<li>Stel de vibratome voor snijden: sectie dikte van 200 μm, frequentie van trillingen van 100 Hz, en de snelheid van het Segeren tussen 0.5-1.0 mm/s.</li>
	<li>Vergrendel de vibratome-buffer lade op de vibratome-basis en voeg ijs toe om het koel te houden voordat u de snijden-oplossing en het monster ontvangt, en tijdens de snijden-procedure.</li>
</ol>4. monsterverzameling
Opmerking: in dit protocol werd humaan neocorticale weefsel verzameld in de chirurgische ruimte en getransporteerd naar het laboratorium.
Let op: bij het omgaan met menselijke monsters, volg de juiste veiligheidsprotocollen vastgesteld door de instelling.
<ol><li>De transport apparatuur (Figuur 1C) instellen die bestaat uit: een draagbare gascilinder met het Manager-mengsel aangesloten op een druk/flux klep die de gasuitgang regelt die is aangesloten op een silicium slang die de gasproductie verbindt met het vervoer het schip een transportvaartuig, meestal een conische centrifugebuis van 50 mL met geperforeerd deksel voor gasinvoer, met de transportoplossing; en ijs voor monster koeling tijdens transport.</li>
	<li>Het specimen (Figuur 1B) onmiddellijk naar het lab verzamelen en transporteren. Dompel het preparaat onder in een koude transportoplossing (voortdurend borrelen met het Manager mengsel).</li>
</ol>5. Segeren
<ol><li>Breng het preparaat over in een Petri schaaltje (100 mm x 20 mm) met een snijden oplossing en verwijder, met fijne chirurgische gereedschappen, voorzichtig zoveel mogelijk van de resterende hersenvliezen in het monster (Figuur 1D).</li>
	<li>Kies de beste sample oriëntatie voor het produceren van plakjes met de bijzondere karakteristieken van het experimentele ontwerp, en met een No. 24 scalpel Blade, trim een vlakke ondergrond om de basis te zijn gelijmd aan de specimen schijf.</li>
	<li>Met behulp van een wegwerp plastic lepel en delicate penselen, verzamel het fragment van de Petri schaal en droge overtollige oplossing met behulp van filtreerpapier (droog door capillariteit en Vermijd het aanraken van het weefsel fragment met papier).</li>
	<li>Bevestig het weefsel met behulp van superlijm aan de vibratome-specimen schijf totdat het stevig aan de schijf is bevestigd en in contact komt met het agarose-blok (Figuur 1E).</li>
	<li>Plaats de vibratome specimen disk (met weefsel goed aangesloten) in de vibratome buffer tray gevuld met snijden oplossing die tijdens het hele proces moet borrelen.</li>
	<li>Vergrendel de meshouder op zijn plaats met het scheermesje stevig vast.</li>
	<li>De snijden-oplossing moet zowel het preparaat als het blad bedekken en vervolgens beginnen met snijden (Figuur 1F).</li>
	<li>Snijd het preparaat in schijfjes van 200 μm. Opmerking: Hoewel sommige vibratomes de specimens automatisch knippen, kunnen de nauwe observatie en kleine aanpassingen in de snijsnelheid tijdens het proces helpen bij het produceren van betere segmenten. Gooi de eerste onregelmatige schijfjes weg.</li>
	<li>Breng de segmenten van de buffer lade over naar een Petri schaaltje met een snijden oplossing en snijd losse randen en overtollige witte Mater in een verhouding van ongeveer 70% cortex/30% witte stof.</li>
</ol>6. cultuur
Opmerking: Voer deze stap uit in een laminaire flowkast onder steriele omgeving.
<ol><li>Voeg 600 μL kweekmedium per put (in een 24-put) toe en inincuberen gedurende ten minste 20 minuten bij 36 °C en 5% CO2 voorafgaand aan het bekleden van de plakjes.</li>
	<li>Plaat één segment per put met een penseel (Figuur 1G).</li>
	<li>Als er ongebruikte putjes in de plaat zitten, vul ze dan met 400 μL steriel water.</li>
	<li>Incuberen de plaat bij 36 °C, 5% CO2. Opmerking: de eerste gemiddelde vervanging moet worden uitgevoerd tussen 8-16 uur na het bekleden, afhankelijk van de grootte van het segment.</li>
	<li>Supplement 10 mL van het eerder bereide kweekmedium met 50 ng/mL hersenen afgeleide neurotrophic factor (BDNF). Opmerking: tijdens de eerste 8-16 h worden de schijfjes geïnineerd in 600 μL medium om nutriënten ontbering en verzuring te voorkomen, aangezien het gemiddelde verbruik in deze fase wordt versneld. Vanaf de volgende stap wordt het volume van het medium per put aangepast tot 400 μL.</li>
	<li>Verwijder 333 μL van het geconditioneerde medium van elke put en voeg 133 μL vers BDNF-aangevuld medium toe.</li>
	<li>Herhaal het proces van gemiddelde vervanging om de 24 uur door een derde van het geconditioneerde medium te vervangen door een nieuw, met BDNF aangevuld medium.</li>
</ol>7. evaluatie van de gezondheid, morfologie en functie in gekweekte plakjes
Opmerking: om celdood te induceren met het oog op illustratie in de representatieve resultaten, werden sommige plakjes ingediend bij een behandeling van 24 uur met de oxidatieve stress-inductor H2O2. Stappen 7.1.2 en 7.1.3 beschrijven het gebruik van H2O2 om celdood te induceren.
<ol><li>Levensvatbaarheid van de cel Opmerking: een eenvoudige, ongecompliceerde methode om neurotoxische/neuroprotectie te evalueren in betwiste segment culturen is de 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium (MTT) test36, die het percentage van metabole actieve cellen meet onder normale omstandigheden in vergelijking met behandelde monsters.<ol>
<li>Vervang in de laminaire flowkast een derde van het medium met vers medium.</li>
		<li>Van een 30% H2o2 stockoplossing, voeg een volume van h2o2 per put toe om de beoogde eindconcentratie te bereiken (30 mm of 300 mm). Opmerking: H2O2 is toegevoegd na de dagelijkse verandering van het medium om de juiste toevoer van verse voedingsstoffen te garanderen voor de uitdaging.</li>
		<li>Incuberen de plaat voor 24 uur bij 36 °C, 5% CO2. NB: na de behandeling met H2O2 (of een andere toxische stimulans van belang) beschrijven de volgende stappen de levensvatbaarheid van de cel door de MTT-test.</li>
		<li>Voeg 40 μL MTT-oplossing toe aan een eindconcentratie van 0,5 mg/mL voor elke put in de plaat.</li>
		<li>Incuberen de plaat bij 36 °C, 5% CO2 voor 3 uur.</li>
		<li>Was de schijfjes met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en breng deze over naar een micro tube.</li>
		<li>Verwijder de resterende oplossing zorgvuldig door Pipetting.</li>
		<li>Weeg de microbuisjes met de segmenten af om de massa van elk segment te bepalen (dit is de sleutel voor het normaliseren van de extinctie metingen). Opmerking: indien nodig kunnen monsters in dit stadium worden bevroren (-20 °C) voor latere verwerking.</li>
		<li>Homogeniseren de segmenten in 200 μL van isopropanol/HCl met behulp van een gemotoriseerde vijl.</li>
		<li>Centrifugeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 minuten bij 2600 x g.</li>
		<li>Vang het supernatant op en meet de extinctie bij 540 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>KCl-geïnduceerde neuronale depolarisatie Opmerking: fosforylering van de mitogeen geactiveerde proteïne kinase (MAPK) signalering Cascade proteïne ERK, gevolgd door Western blotting, kan worden gebruikt voor de kwantificering van de neuronale reactie op KCl-geïnduceerde depolarisatie37 .<ol>
<li>Vervang in de stroom kast het kweekmedium door 300 μL HBSS die eerder zijn geëscaleerd tot 36 °C.</li>
		<li>Vervang de HBSS met 300 μL verse HBSS die eerder zijn geëscaleerd tot 36 °C.</li>
		<li>Incuberen de plaat bij 36 °C, 5% CO2 gedurende 15 min.</li>
		<li>Vervang de HBSS met ofwel de verse HBSS of met 80 mM KCl depolariserende oplossing (beide bij 36 °C) en inbroed bij 36 °C, 5% CO2 gedurende 15 min.</li>
		<li>Breng de segmenten van de plaat over naar de microbuisjes. In deze stap kunnen segmenten worden opgeslagen bij-20 °C voor latere verwerking.</li>
		<li>Bereid weefsel extracten voor in 150 μL radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (50 mM tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% nonionische oppervlakteactieve stof; 0,1% natriumdodecylsulfaat; pH 7,5). Centrifugeer extracten bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 16000 x g, verzamel supernatant en bepaal de totale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-methode.</li>
		<li>Laad 30 μg totaal eiwit op een 12% natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE).</li>
		<li>Breng na elektroforese het gelgehalte over naar een nitrocellulose membraan.</li>
		<li>Na het blokkeren van het membraan met 5% niet-vette droge melk in TBS plus 0,1% tween, incuberen met muis anti-pERK (1:1000) voor 16 uur bij 4 °C. Na het wassen, inincuberen voor 2 h bij RT met konijn anti-ERK1/2 (1:1000).</li>
		<li>Inincuberen met het geschikte HRP-geconjugeerde secundair antilichaam bij RT gedurende 1 uur.</li>
		<li>Onthul met het gewenste HRP-substraat.</li>
	</ol></li>
	<li>Morfologische evaluatie Opmerking: naast overleving van de cel en functionele evaluaties is het belangrijk om weefsel morfologie te analyseren. Let op dat resectioneren van het gekweekte segment een belangrijke stap is om zo veel mogelijk materiaal van hoge kwaliteit te produceren voor morfologische analyse.<ol>
<li>Bevestiging, cryoprotecting en resectioning van de plakjes<ol>
<li>Breng de segmenten van de putten over met cultuurmedium naar een nieuwe 24-putplaat met PBS.</li>
			<li>Verwijder de PBS en voeg 1 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) toe. Het is belangrijk dat segmenten plat worden gehouden voordat PFA wordt toegevoegd. Inincuberen op 4 °C.</li>
			<li>Verwijder voorzichtig de PFA-oplossing en voeg 1 mL 30% sucrose-oplossing toe. Inincuberen voor 48 uur bij 4 °C.</li>
			<li>Stel de Vries microtoom in op-40 °C.</li>
			<li>Bereid een sacharose basis op de microtoom fase waar de schijfjes moeten worden geplaatst (Figuur 2a). Laat het volledig bevriezen en snijd zorgvuldig enkele van de bevroren sucrose om een plat oppervlak te produceren waarop het segment wordt geplaatst.</li>
			<li>Plaats elk segment op een uitgerekte plastic film en gebruik een penseel om het weefsel plat te maken.</li>
			<li>Breng het uitgerekte segment in één beweging over naar de bevroren sacharose basis. Opmerking: het is niet mogelijk om het segment te verplaatsen wanneer het zich boven de bevroren sacharose basis bevindt. Voer deze overdrachts stap zorgvuldig uit.</li>
			<li>Laat de schijfje rusten voor 5-10 min voor een goede bevriezing.</li>
			<li>Snijd het segment in 30 μm secties.</li>
			<li>Breng de 30 μm-secties over in een Petri schaaltje met PBS.</li>
			<li>Ga verder met het histologie protocol dat meer geschikt is voor het experimentele ontwerp. Opmerking: de 30 μm-secties kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor vrij zwevende immunohistochemie, gemonteerd op microscopie dia's voor verdere histologie of opgeslagen in antivriesoplossing bij-20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunohistochemistry Opmerking: de standaardprotocollen immunohistochemie en immunofluorescentie variëren tussen laboratoria. Voor een gedetailleerde versie van het protocol dat hier wordt gebruikt, verwijzen wij u naar Horta et al.38. Primaire antilichamen die worden gebruikt voor immunostainings in Figuur 2 omvatten neuronale kernen (neun), gezonde volwassen neuron marker, gliacellen fibrillair zuur eiwit (GFAP), astorcytes marker, geïoniseerde calcium binding adapter (IBA-1), en Microglia Markering.<ol>
<li>Inbroed de segmenten in blokkerende oplossing (bijv. 2% normaal Donkey serum in PBS) gedurende 40 min.</li>
			<li>Incuberen 's nachts met primair antilichaam onder milde opwinding bij 4 °C.</li>
			<li>Na wassen met PBS, incuberen voor 120 min met biotinyleerd secundair antilichaam onder milde agitatie bij RT.</li>
			<li>Na het wassen met PBS, incuberen bij RT voor 120 min met avidin-peroxidase conjugaat (tabel van materialen).</li>
			<li>Onthulling met DAB + 0,04% nikkel ammonium.</li>
			<li>Monteer de bevlekt delen op gelatine gecoate microscopie dia's en laat ze lucht drogen. Dehydraat in ethanol, diaphanize in xyleen, afwerking met afdekmedium (tabel van de materialen), bedekken met een dekslip, en beeld.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol voor het produceren van vrij zwevende, korte-termijn segment culturen is een alternatieve methode voor het kweken van volwassen menselijke neocorticale schijfjes. Een dergelijk protocol voor segment culturen kan vatbaar zijn voor studies over (maar niet beperkt tot) optogenetica1,44,45, elektrofysiologie2,3,4,<su...

Het gebruik van menselijke monsters in onderzoek is ondubbelzinnig een geweldige optie om menselijke hersen pathologieën te bestuderen, en moderne technieken hebben nieuwe manieren geopend voor robuuste en ethische experimenten met behulp van door de patiënt afgeleid weefsel. Methoden zoals organotypic/slice culturen bereid uit volwassen menselijk brein zijn steeds vaker gebruikt in paradigma's zoals optogenetica1, elektrofysiologie2,3,4,5, plasticiteit 6,7,8,9, neurotoxiciteit/neuroprotectie10,11,12,13, celtherapie14, screening van geneesmiddelen15,16,17, genetica en genbewerken12,18,19,20, onder andere, als een strategie voor betere het begrijpen van neurologische aandoeningen tijdens de volwassenheid.
Het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan menselijke hersen pathologieën is afhankelijk van experimentele strategieën die een groot aantal onderwerpen vereisen. Omgekeerd is, in het geval van segment culturen, hoewel de toegang tot menselijke monsters nog steeds moeilijk is, de mogelijkheid om tot 50 schijfjes uit één enkel corticale monster te genereren gedeeltelijk de eis van het werven van meerdere vrijwilligers door het verhogen van de aantal replicaten en uitgevoerde assays per verzameld weefsel21.
Verschillende protocollen voor organotypische/segment culturen van de hersenen zijn beschreven, variërend van de klassieke Franceschetti-concepten22,23 tot de rolbuis24,25,26, semi-permeabele membranen interface27,28,29,30en vrij zwevende segmenten31,32. Afhankelijk van de bijzonderheden van een experimenteel ontwerp, heeft elke techniek zijn eigen voor-en nadelen. Op korte termijn, vrij zwevende segmenten culturen van volwassen menselijke hersenen is in sommige gevallen voordelig over de methode die wordt gebruikt door Stoppini et al.27, indien rekening houdend met het feit dat, hoewel lange termijn cel overleving in vitro is meestal een belangrijke zorg bij het evalueren van een cultuur methode, in veel experimenten slechts korte perioden in cultuur zijn nodig12,31,32,33,34,35. Onder deze omstandigheden presenteert het gebruik van vrij zwevende culturen het voordeel dat het eenvoudiger en kosteneffectiever is, en dat het nauwkeuriger lijkt op de oorspronkelijke menselijke weefsel aandoening dan op plakjes die gedurende 2-3 weken in cultuur worden gehouden.
Ondanks het potentieel van segment culturen aan de neurowetenschappen, zijn studies die gebruik maken van volwassen zenuwweefsel om dergelijke culturen voor te bereiden nog schaars, met name van menselijke proefpersonen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik van verzamelde hersenweefsel van levende menselijke donoren ingediend bij recidiverend hersenchirurgie om vrij zwevende segment culturen te bereiden. Procedures voor het onderhouden en uitvoeren van biochemische en celbiologie testen met behulp van deze culturen zijn gedetailleerd. Dit protocol is bewezen waardevol voor het analyseren van de levensvatbaarheid en neuronale functie in onderzoeken naar de mechanismen van neuro pathologieën die verband houden met de volwassenheid.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>1096341000</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3449&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-154</td><td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td></tr><tr><td>Antibody anti-pERK (mouse)</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-7383</td><td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3014</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 1x Dye Reagent</td><td>BioRad</td><td>500-0205</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Used in RIPA buffer</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salts</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1387-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td><td>Vetec</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td><td>GE</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1064041000</td><td>Used in RIPA buffer</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk (Molico)</td><td>Nestl&eacute;</td><td></td><td>Used for membrane blocking</td></tr><tr><td>PBS Buffer pH 7,2</td><td>Laborclin</td><td>590338</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomicin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Prime Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td><td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750</td><td>Used in RIPA buffer</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>GE</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T-1378</td><td>Used in RIPA buffer</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Used in RIPA buffer</td></tr><tr><td>Ultrapure Water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td></tr><tr><td>Equipment en materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning</td><td>CL S3526</td><td>Flat Bottom with Lid</td></tr><tr><td>Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&nbsp;</td><td>GE</td><td>29047575</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen Mixture</td><td>White Martins</td><td></td><td>95% O2, 5% CO2</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>CO-24</td><td>Incubation of slices 5% CO2, 36&ordm;C</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Greiner</td><td>001608</td><td>1,5mL microtube</td></tr><tr><td>Motorized pestle</td><td>Kimble Chase</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>Size of a dessert spoon</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Bic</td><td></td><td>Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td></tr><tr><td>Scalpel Blade</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Number 24</td><td>Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td></tr><tr><td>Superglue (Loctite Super Bonder)</td><td>Henkel</td><td></td><td>Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>Leica</td><td>14047235612 - VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Naam van Materiaal/Equipment voor Immunohistochemie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-NeuN (mouse)</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>MAB377</td><td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td></tr><tr><td>Antibody anti-GFAP (mouse)</td><td>Merck</td><td>MAB360</td><td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td></tr><tr><td>Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>EPR16588 - ab178846</td><td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td><td>Vector</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-9015</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Synth</td><td>00G1002.02.AE</td><td>Used for coating slides</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&ordm;C</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td><td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Slides (Star Frost)</td><td>Knittel Glaser</td><td></td><td>Gelatin coated slides</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Vetec</td><td>60REAVET017050</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td><td>Vector</td><td>PK-4000, Kit Standard</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Synth</td><td>01X1001.01.BJ</td><td></td></tr></tbody></table>

korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypische, of segment culturen, zijn op grote schaal gebruikt om aspecten van het centrale zenuwstelsel functioneren in vitro te modelleren. Ondanks het potentieel van segment culturen in de neurowetenschappen, zijn studies die gebruik maken van volwassen zenuwweefsel om dergelijke culturen voor te bereiden nog schaars, met name die van menselijke proefpersonen. Het gebruik van volwassen menselijk weefsel om segment culturen voor te bereiden is bijzonder aantrekkelijk om het begrip van menselijke neuropathologieën te verbeteren, omdat ze unieke eigenschappen hebben die kenmerkend zijn voor het volwassen menselijke brein dat ontbreekt in plakjes die worden geproduceerd door knaagdieren (meestal neonataal) zenuwweefsel. Dit protocol beschrijft hoe te gebruiken hersenweefsel verzameld van levende menselijke donoren voorgelegd aan recidiverend hersenchirurgie om te bereiden op korte termijn, vrij zwevende segment culturen. Er worden ook procedures gepresenteerd voor het onderhouden en uitvoeren van biochemische en celbiologie-testen met behulp van deze culturen. Representatieve resultaten tonen aan dat de typische menselijke corticale laminering wordt bewaard in plakjes na 4 dagen in vitro (DIV4), met de verwachte aanwezigheid van de belangrijkste neurale celtypen. Bovendien ondergaan plakjes bij DIV4 een robuuste celdood wanneer ze worden uitgedaagd met een toxische stimulus (H2O2), wat het potentieel van dit model aangeeft om als platform te dienen in celdood testen. Deze methode, een eenvoudiger en kosteneffectief alternatief voor het veelgebruikte protocol met behulp van membraan inserts, wordt vooral aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen die gericht zijn op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter leeftijdsgebonden hersenziekten. Ten slotte, hoewel het protocol is gewijd aan het gebruik van corticale weefsel verzameld van patiënten die worden voorgelegd aan de chirurgische behandeling van pharmacoresistant temporale kwal epilepsie, wordt aangevoerd dat weefsel verzameld uit andere hersengebieden/voorwaarden ook moet worden beschouwd als bronnen om soortgelijke vrij zwevende segment culturen te produceren.

Een kritisch aspect om de kwaliteit en de gezondheid van de gekweekte plakjes te evalueren is de aanwezigheid en typische morfologie van de verwachte neurale celtypen, neuronen en gliacellen. De typische architectuur van de menselijke corticale laminatie werd waargenomen in een segment op DIV4, onthuld door neuronale immunolabeling (Figuur 2D). Daarnaast werd ook de verwachte aanwezigheid van Microglia en astroglia (Figuur 2B, C...

Een protocol om vrij zwevende segment culturen van volwassen menselijk brein voor te bereiden wordt gepresenteerd. Het protocol is een variatie van de veelgebruikte segment cultuurmethode met behulp van membraan inserts. Het is eenvoudig, kosteneffectief, en aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen gericht op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter de leeftijd geassocieerde hersenziekten.

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

We presenteren een protocol voor te bereiden vrij zwevende slice culturen uit hersenweefsel verzameld van levende menselijke donoren voorgelegd aan resective hersenchirurgie. Deze cultuur is vatbaar voor het uitvoeren van biochemische en celbiologie testen of immunohistochemie. Het zal naar verwachting bijdragen aan de opheldering van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan neurodegeneratie in geassocieerde hersenziekten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudiger en kosteneffectiever alternatief is voor het klassieke slice cultuur protocol met membraan inserts. Hoewel het algemene protocol niet complex is, zijn sommige stappen zoals het verwijderen van hersenvliezen, het lijmen van het weefsel aan de vibratome specimen schijf, en resectie voor immunohistochemie het best te begrijpen wanneer visueel aangetoond. Helpen om de procedure aan te tonen zullen Niele Mendes en Glaucia Almedia die grad studenten, en Giovanna Nogueira, een andere grad student.Om deze procedure te beginnen, voeg zout toe aan een emmer ijs. Breng de snijoplossing over op deze emmer en laat deze minstens 20 minuten rusten onder het carbogenmengsel dat voor gebruik borrelt. Bereid v

short-term-free-floating-slice-cultures-from-the-adult-human-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Organotypische Slice Cultuur van E18 Rat Brains

We beschrijven een methode om organotypische hippocampale slices die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere hersengebieden te bereiden. Brain plakjes worden gelegd op poreuze membranen en cultuur media is toegestaan ​​om een ​​interface te vormen. Deze methode behoudt de bruto-architectuur van de hippocampus voor maximaal 2 weken in cultuur.

Organotypische hippocampus Slice culturen

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

This video demonstrates a technique for preparing free-floating slice cultures from the adult human brain. Thin slices are generated from a brain section using a vibratome. These slices are then suspended in a culture medium supplemented with growth factors to maintain tissue viability.

Preparing Free-Floating Slice Cultures from an Adult Human Brain

The video demonstrates the generation and maintenance of organotypic slice cultures from glioblastoma tissue. The isolated tissue is embedded in an agarose matrix, and thin sections are obtained using a vibratome. These sections are then placed on permeable membrane inserts within a microplate and cultured in a slice culture maintenance media for long-term maintenance.

Generating and Maintaining Slice Cultures from Human Glioblastoma Tissue

In dit artikel tonen we een methode voor het bereiden van acute hersenslices bij fysiologische temperatuur, met behulp van een conventionele fysiologische oplossing zonder speciale aanpassingen voor het snijden (zoals het toevoegen van sucrose) en zonder intracardiale perfusie van het dier vóór de slice-voorbereiding.

Slice It Hot: Acute volwassen hersenen Snijden in Fysiologische Temperatuur

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) vormen een in vitro model dat de in vivo situatie heel goed simuleert. Hier beschrijven we een op vibratome gebaseerde verbeterd snijden protocol om te verkrijgen van hoge kwaliteit segmenten voor gebruik bij de beoordeling van het neuroprotectieve potentieel van nieuwe stoffen of het biologisch gedrag van de tumorcellen.

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.

Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

Dit protocol beschrijft organotypische culturen op lange termijn van de volwassen menselijke cortex in combinatie met ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopers, die een nieuwe methodologie presenteren om op stamcellen gebaseerde therapieën voor menselijke neurodegeneratieve aandoeningen verder te testen.

Organotypische culturen van volwassen menselijke cortex als een ex vivo model voor menselijke stamceltransplantatie en validatie

Leer een vereenvoudigde methode voor kortetermijnkweek van vrij zwevende hersenschijven uit volwassen menselijk breinweefsel. Deze techniek maakt biochemische en immunohistochemische analyses mogelijk voor onderzoek naar neurodegeneratie.

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

Meer video's verkennen