Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm

We bestudeerden de beschikbaarheid van oplosbaarheid van micrometalen zoals zinkseleen met verschillende chemische vormen of bronnen, zoals we het noemen, in de context van veranderende voersamenstelling. Weeg in een radionuclidesuite ongeveer 0,2 gram gemalen Atlantische zalmvoermonsters af en meng deze met een zinkradiotracer met bekende specifieke activiteit in een monsterbuis van vijf milliliter volume. Bereid zes andere aliquots van de buffer en voeg een van de hier afgebeelde aminozuren toe aan elk om een uiteindelijke molaire concentratie van vijf millimolar te bereiken.

Voeg zoetwater intestinale luminale buffer toe om het monster te voeden. Voeg vervolgens de zoetwater intestinale luminale buffer toe aan de buffer aliquots die de aminozuren bevatten. Sluit de buizen en draai ze op een roterende spinner met 25 RPM gedurende 30 minuten.

Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 1. 157 x g om de oplosbare en niet-oplosbare fracties te scheiden. Gebruik een gammateller om het aantal per minuut van de zinkradiotracer in de oplosbare en niet-oplosbare fracties te meten. Was de van regenboogforel afgeleide darmcellijn tweemaal met één milliliter EDTA-oplossing en hevel de oplossing na elke wasbeurt uit met een pipet.

Behandel de gewassen cellen met 0,25% trypsine-oplossing. Draai de kolf voorzichtig twee minuten onder scherpe hoeken. Voeg vervolgens 10 milliliter L-15 medium met 5% FBS toe om het trypsine te neutraliseren.

Decanteer met behulp van een steriele pipet de resulterende celsuspensie in een conische centrifugebuis aan de onderkant. Centrifugeer bij 130 x G gedurende drie minuten. Bepaal vervolgens met behulp van een hemocytometer de dichtheid van de geoogste cellen door handmatig te tellen.

Zaai de cellen op 24 putplaten met een celdichtheid van 50.000 cellen per milliliter, per put, en incubeer de platen bij 19 graden Celsius onder een normale atmosfeer gedurende 48 uur voorafgaand aan de experimenten. Na het voeren van de vis gedurende 11 dagen en het euthanaseren, verzamel je een gepoold monster van de uitwerpselen van de vis door van de ventrale vin naar de anus te strippen en op een bord te leggen. Gebruik een spatel om de uitwerpselen van de plaat over te brengen in een conische buis van 50 milliliter.

Bewaar de monsters onmiddellijk bij 20 graden Celsius. In deze studie wordt de minerale beschikbaarheid van visvoer beoordeeld met behulp van een aantal complementaire methoden. Representatieve analyse van Atlantisch zalmvoer via de grootte-uitsluitingschromatografie inductief gekoppelde plasmamassaspectrometriemethode, levert gegevens op over de zinkchemische soorten die in de oplosbare fractie worden aangetroffen.

In deze fractie zijn vijf zinkhoudende pieken te zien, elk met een ander molecuulgewicht. De zinkchemische soorten die in de oplosbare fractie worden aangetroffen, kunnen verschillende bronnen hebben, omdat het gebruikte voer zowel mariene als plantaardige ingrediënten bevat en wordt aangevuld. Het molecuulgewichtsbereik van deze soorten suggereert dat deze verbindingen metalloproteïnen kunnen zijn.

Terwijl de oplosbaarheid van aangevuld zink 65 de aanwezigheid van alle geteste aminozuren verhoogt, wordt een hogere oplosbaarheid gevonden met histidine en lysine. Apicale zinkopname in Arteca GC-cellen wordt significant beïnvloed door de aanwezigheid van L-Met of DL-Met bij twee millimolarconcentraties. Bovendien wordt de impact van methionine op de zinkopname negatief beïnvloed door de aanwezigheid van BCH.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat we hebben geprobeerd om verschillende benaderingen te combineren in visuele, analytische en invivo-studies, om elkaar te vergelijken en aan te vullen als het gaat om het bestuderen van de beschikbaarheid van mineralen.