Name: Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Leer hoe je de beschikbaarheid van zink in Atlantische zalmvoeders beoordeelt met analytische, in vitro en in vivo methoden. Deze aanpak helpt onderzoekers bij het optimaliseren van minerale opname in aquacultuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd uitgevoerd in het kader van het project APREMIA (Apparent availability and requirement of minerals in Atlantic salmon, grant no. 244490) gefinancierd door de Noorse Onderzoeksraad.

De voedingsproef in sectie 4 werd uitgevoerd volgens de Noorse (FOR-2015-06 - 18-761) en Europese wetgeving (Richtlijn 2010/63/EU).
1. Evaluatie van chemische Zn-soorten in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer met behulp van een SEC-ICP-MS-methode
<ol><li>Extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5)
	<ol>
<li>Bereid de extractiebuffer voor door een geschikte hoeveelheid tris(hydroxymethyl)aminomethaan op te lossen om de gewenste ionische sterkte (100 mM) te bereiken in ultrapeur H2O.</li>
		<li>Stel de pH van de oplossing in op pH 8,5 met de HCl-oplossing en controleer de pH-verandering met een pH-meter.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van voedermonsters OPMERKING: Het gebruikte voedermonster is geformuleerd op basis van commercieel voer voor Atlantische zalm, dat eiwitbronnen bevat die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% viseiwit, 10% visolie, 68% plantaardig eiwit en 12% plantaardige olie). Zinksulfaat werd aangevuld met het voer.<ol>
<li>Maal het voermonster met de hand met behulp van een stamper en een vijzel.</li>
		<li>Zeef het voedingsmonster om ervoor te zorgen dat de extractie wordt uitgevoerd in een voedingsfractie met een vergelijkbare deeltjesgrootte (van 850 μm tot 1,12 mm).</li>
		<li>Ga verder met het uitvoeren van de Zn-extractie.</li>
	</ol></li>
	<li>Zinkextractie uit een voedermonster
	<ol>
<li>Weeg ongeveer 0,5 g voer in drievoud af in conische buisjes van 15 ml.</li>
		<li>Voeg de extractiebuffer (5 ml van 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) toe aan de monsters.</li>
		<li>Pak de monsters in een rotator (20 rpm) bij 4 °C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Scheid de oplosbare en niet-oplosbare fracties door centrifugering gedurende 10 minuten bij 3000 x g.</li>
		<li>Gebruik een wegwerpspuitfilter van 0,45 μm om de oplosbare fractie te filteren.</li>
		<li>Breng de gefilterde monsters over naar schone buizen.</li>
		<li>Voer de Zn-speciatieanalyse uit in de oplosbare fracties met SEC-ICP-MS, zoals beschreven in stap 1.6. OPMERKING: Een samenvatting van de procedure voor Zn-extractie uit een voedermonster wordt beschreven in figuur 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Mobiele fase oplossing (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5)
	<ol>
<li>Bereid de mobiele faseoplossing voor het oplossen van 6,057 g tris(hydroxymethyl)aminomethaan in 1 l 3% MeOH-oplossing (v/v).</li>
		<li>Stel de pH van de oplossing in op 7,5 met de HCl-oplossing en controleer de pH-verandering met een pH-meter.</li>
		<li>Filter de mobiele fase-oplossing door een membraanfilter van 0,45 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Moleculaire gewichtskalibratie van het SEC-kolomscheidingsbereik
	<ol>
<li>Kalibreer het scheidingsbereik door een kalibratie van het molecuulgewicht uit te voeren. OPMERKING: In deze studie werden thyroglobuline (660 kDa), Zn/Cu superoxide dismutase (32 kDa), myoglobine (17 kDa) en vitamine B12 (1,36 kDa) gebruikt.</li>
		<li>Bereid elk van de normen voor met een bekende concentratie in ultrapijn H2O.</li>
		<li>Bereid een hplc-injectieflacon (high-performance liquid chromatography) voor door 250 μl standaard aan een injectieflacon toe te voegen.</li>
		<li>Laad de injectieflacons met standaarden op de volgorde van de monsters.</li>
		<li>Voer de molecuulgewichtkalibratie uit aan het begin en aan het einde van de analytische sequentie en controleer 127I (thyroglobuline), 66Zn (Zn / Cu superoxide dismutase), 57Fe (myoglobine) en 59Co (vitamine B12). OPMERKING: De kalibratie van het molecuulgewicht wordt gelijktijdig uitgevoerd met de Zn-speciatieanalyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Zinkspeciatie analyse met SEC-ICP-MS OPMERKING: De Zn-soortanalyse volgens de SEC-ICP-MS-methode is ontwikkeld op basis van elders beschreven principes10,11 en verdere optimalisatie is uitgevoerd voor de analyse van een Atlantisch zalmvoer7.<ol>
<li>Voer de Zn-speciatieanalyse uit op de oplosbare fracties met behulp van een kolom met grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en een HPLC in combinatie met inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (ICP-MS).</li>
		<li>Bereid een HPLC-injectieflacon door 250 μL oplosbare fractie aan een injectieflacon toe te voegen.</li>
		<li>Voor de analyse, spike alle monsters met 0,5 μL vitamine B12. Deze stap maakt het mogelijk om te corrigeren voor retentietijden verschuivingen, monitoring 59Co.</li>
		<li>Verdun de oplosbare fractie met extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) en pas aan tot een eindvolume van 1 ml.</li>
		<li>Bereid de volgorde van de monsters in willekeurige volgorde voor.</li>
		<li>Stem de ICP-MS af volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Volg de instrumentinstellingen voor de HPLC en ICP-MS die de Zn-speciatieanalyse uitvoeren (zie tabel 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. In vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer
OPMERKING: Het gebruikte voedermonster is geformuleerd op basis van commercieel voer voor Atlantische zalm, dat eiwitbronnen bevat die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% vismeel, 10% visolie, 68% plantaardige ingrediënten en 12% plantaardige olie).
<ol><li>Maal de Atlantische zalmvoermonsters gedurende 10 s bij 3000 tpm met behulp van een messenmolen en bewaar bij 4 °C tot verdere analyse.</li>
	<li>Weeg ~0,2 g van de in stap 2.1 gemalen voedingsmonsters en voeg Zn radiotracer(65Zn) van bekende specifieke activiteit toe in een monsterbuis met een volume van 5 ml (met een dop). LET OP: Deze procedure moet worden uitgevoerd in een radionuclidesuite. De persoon die deze stap uitvoert, moet worden getraind en gecertificeerd om radio-isotopen te verwerken. De veiligheids- en voorzorgsmaatregelen die door de stralingsveiligheidsadministratie van het instituut worden geadviseerd, moeten strikt worden gevolgd.</li>
	<li>Bereid vervolgens de zoetwater intestinale luminale bufferoplossing zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Weeg voor zoutoplossing A 11,65 g NaNO3,0,55 g KNO3 en 0,4 g MgSO4af. Los de zouten op in ultrapaat H2O en pas aan tot een eindvolume van 60 ml.</li>
		<li>Weeg voor zoutoplossing B 0,31 g Ca(NO3)2· 4 H2O. Los de zouten op in ultrapaat H2O en stel het in op een eindvolume van 10 ml.</li>
		<li>Gebruik 500 mM HEPES stockoplossing als zoutoplossing C.</li>
		<li>Weeg voor zoutoplossing D 1,2 g MgCl2af, los het zout op in ultrapure H2O en pas het aan tot een eindvolume van 20 ml.</li>
		<li>Voor zoutoplossing E weegt u 0,9 g MgSO4,lost u het zout op in ultrapruim h2O en past u het aan tot een eindvolume van 20 ml.</li>
		<li>Bereid pyruvaatoplossing door 0,55 g CH3COCOONa op te lossen in 10 ml ultrapaat H2O.</li>
		<li>Los 0,9 g galactose (C6H12O6) op in ultrapeur H2O.</li>
		<li>Los goed op met behulp van een magneetroerder en steriliseer zoutoplossingen A, B, D en E door autoclaveren, en oplossing C, pyruvaat en galactose door filtratie door een spuitfilter van 200 μm.</li>
		<li>Na bereiding van de verschillende stamoplossingen, om 100 ml werkoplossing van de buffer te bereiden, mengt u de bovengenoemde bereide oplossingen in de volgende verhouding: 6,8 ml zoutoplossing A, 4,14 ml B, 5 ml C, 2,5 ml D, 1,5 ml E en 1,14 ml pyruvaat en galactose. Maak het volume aan tot 100 ml met gedeioniseerd water. OPMERKING: De bovenstaande buffer vertegenwoordigt nu de ionische samenstelling van het darmlumen dat wordt aangetroffen in zoetwaterzalmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid zes andere aliquots van de buffer beschreven in stap 2.6 en voeg een van de volgende aminozuren (cysteïne, methionine, glycine, histidine, lysine en arginine) toe om een uiteindelijke molaire concentratie van 5 mM te bereiken.</li>
	<li>Voeg de luminale buffer van de zoetwateringinlaat (reactievolume = 3 ml; pH 7,4) toe aan het voedingsmonster.</li>
	<li>Herhaal stap 2.5 met de in 2.4 beschreven buffers (in aanwezigheid van verschillende aminozuren bij een concentratie van 5 mM).</li>
	<li>Sluit de buizen en laat ze 30 minuten bij 25 tpm in een roterende spinner draaien.</li>
	<li>Scheid de oplosbare en niet-oplosbare fracties door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 1157 x g.</li>
	<li>Gebruik een gammateller om de tellingen per minuut (cpm) van 65 Znin de oplosbare en niet-oplosbare fracties te meten.</li>
	<li>Bereken het aandeel van de radio-isotopen van Zn (65Zn) aanwezig in de oplosbare en niet-oplosbare fracties.</li>
</ol>3. Evaluatie van de opname van chemische Zn-soorten met behulp van een in vitro darmmodel (RTgutGC)
<ol><li>RTgutGC-cellenkweek OPMERKING: Alle werkmaterialen die in deze stap worden gebruikt, moeten steriel zijn.<ol>
<li>Laat de bevroren RTgutGC-cellen voorzichtig herleven in een waterbad op 20 °C.</li>
		<li>Pipetteer voorzichtig de oplossing die de cellen bevat en suspenseer ze in 10 ml L15-medium met 10% foetaal runderserum (FBS). OPMERKING: 10% FBS wordt alleen gebruikt voor het doen herleven van de bevroren cellen. Voor de volgende passage wordt FBS gebruikt bij 5%. De samenstelling van FBS kan variëren tussen batches, dus het is raadzaam om zoveel te kopen en op voorraad te hebben als nodig is van een enkele batch om inter-batch variaties in de serumsamenstelling te voorkomen.</li>
		<li>Voeg de celsuspensie toe aan 75 cm2 celkweekkolven en incubeer in een incubator bij 19 °C onder normale atmosfeer.</li>
		<li>Controleer de cellen en wanneer confluent (80% confluentie, visueel beoordelen door de dichtheid van het celoppervlak onder een microscoop te onderzoeken), splits de cellen in nieuwe kolven (daaropvolgende passage) of oogst om te gebruiken in experimenten. OPMERKING: Een voorbeeld van de RTgutGC-cellen 1 uur en 1 week na het zaaien in de celkweekkolven is weergegeven in figuur 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Celoogst en voorbereiding op blootstellingsexperimenten
	<ol>
<li>Was de cellen tweemaal met 1 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing. Na elke wasbeurt hevelt u de EDTA-oplossing uit met behulp van een steriele zuigbuis.</li>
		<li>Behandel de cellen met trypsine (0,7 ml trypsine, in 0,25% in fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS]).</li>
		<li>Draai de kolf voorzichtig onder scherpe hoeken om de trypsine over het oppervlak van de kolf te verspreiden.</li>
		<li>Blijf 2 minuten draaien, terwijl de cellen loskomen.</li>
		<li>Voeg na een voorzichtige draaiing gedurende 2 minuten 10 ml L15/FBS-medium toe om trypsine te neutraliseren.</li>
		<li>Decanteer de resulterende celsuspensie in een conische bodemcentrifugebuis met behulp van een steriele pipet en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 130 x g.</li>
		<li>Bepaal de dichtheid van de geoogste cellen door handmatig te tellen met behulp van hemocytometer.</li>
		<li>Voeg het vereiste volume L15/FBS-medium toe om een celdichtheid van 5 x 104 cellen/ml te bereiken.</li>
		<li>Zaai de cellen op 24-well platen door 1 ml celsuspensie per put te pipetteren om de uiteindelijke celdichtheid van 5 x 104 cellen / put te bereiken. OPMERKING: Gebruik bij voorkeur pipetten met meerdere doseerdoseringen om variatie te minimaliseren en de tijd te verkorten.</li>
		<li>Plaats de gezaaide platen in een incubator onder normale atmosfeer bij 19 °C gedurende 48 uur voorafgaand aan de experimenten. OPMERKING: Trypsine te bewaar bij -20 °C; EDTA-oplossing en L15/FBS-media bij 4 °C. Stel de temperatuur van alle werkoplossingen en media vlak voor gebruik in op 19 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van blootstellingsmedia OPMERKING: Deze stap moet onder de zuurkast worden uitgevoerd onder aseptische en steriele omstandigheden.<ol>
<li>Bereid L15/ex door 6,8 ml zoutoplossing A (stap 2.3.1), 1,14 ml B (stap 2.3.2), 5 ml C (stap 2.3.3) en 1,14 ml pyruvaat (stap 2.3.6) en galactose (stap 2.3.7) te mengen. Maak het volume aan tot 100 ml met gedestilleerd water van steriele celkweekkwaliteit.</li>
		<li>Bereid FW door 6,8 ml zoutoplossing A (2.3.1), 4,14 ml B (2.3.2), 5 ml C (2.3.3), 2,5 ml D (2.3.4), 1,5 ml E (2.3.5) en 1,14 ml pyruvaat (2.3.6) en galactose (2.3.7) te mengen. Maak het volume aan tot 100 ml met steriel gedestilleerd water van celkweekkwaliteit.</li>
		<li>Kwantificeer de concentraties van ionen in de blootstellingsmedia met behulp van ICP-MS zoals elders beschreven12. OPMERKING: Ionische concentraties geanalyseerd in de mediapreparaten zijn weergegeven in tabel 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Zink (65Zn) instroom assays
	<ol>
<li>Zaai de RTgutGC-cellen op 24-well platen (5 x 104 cellen/put) in volledig L15/FBS medium.</li>
		<li>Incubeer gedurende 48 uur in een incubator met een normale atmosfeer bij 19 °C.</li>
		<li>Pas alle experimentele mediapreparaten aan op pH 7,4 met behulp van 0,5 M NaOH in de aan- of afwezigheid van L-methionine (L-Met) of DL-methionine (DL-Met) bij een concentratie van 2 mM. OPMERKING: De pH-aanpassing van de in punt 3.4.3 beschreven buffers moet opnieuw worden uitgevoerd voordat de cellen in stap 3.4.5 worden behandeld.</li>
		<li>Verwijder na het voltooien van de incubatietijd het medium uit de putten en spoel grondig met PBS.</li>
		<li>Voeg de pH-aangepaste FW experimentele media toe en laat 20 minuten acclimatiseren.</li>
		<li>Stel de RTgutGC-cellen bloot aan nominale concentraties van 3,07, 6,14, 12,27 en 24,55 μM 65Zn(II) (als ZnCl2; ~4 kBq/ml) in de in stap 3.4.3 beschreven media.</li>
		<li>Houd de cellen onmiddellijk daarna gedurende 15 minuten in de couveuse bij 19 °C.</li>
		<li>Nadat de incubatie van 15 minuten voorbij is, aspirateer je het cultuursupernatant en verwijder je het uit de put.</li>
		<li>Spoel de cellen met ijskoud FW-medium (met 200 μM Zn, pH 7,4) en blus vervolgens door de buffer van 5 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA) (pH 7,4) gedurende 5 minuten toe te voegen om zich te ontdoen van geadsorbeerde 65Zn(II).</li>
		<li>Stel de cellen bloot aan de bovenstaande mediapreparaten in de aan- of afwezigheid van 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] heptaan-2-carbonzuur (BCH), een aminozuurtransportremmer.</li>
		<li>Herhaal na de blootstellingsperiode van 15 minuten stap 3.4.8 en 3.4.9.</li>
		<li>De RtgutGC-cellen worden als monolaag aan de onderkant van de putten gehecht. Verteer de cellen met behulp van 0,2% heet natriumdodecylsulfaat (SDS) reinigingsmiddel (100 μL / put). OPMERKING: De SDS-oplossing moet vóór gebruik gedurende 1 uur in een waterbad van 90 °C worden geplaatst.</li>
		<li>Adem het cel digestaat op en herstel het in een buis van 1,5 ml.</li>
		<li>Meet de radioactiviteit van de celverteert met behulp van een gammateller. OPMERKING: De tellingen per minuut (cpm) moeten worden gecorrigeerd voor radioactief verval, achtergrondactiviteit en worden onderworpen aan specifieke activiteitsberekeningen volgens de formules beschreven door Glover en Hogstrand13.</li>
		<li>Om de eiwitconcentratie van de cellen te kwantificeren, homogeniseert u de cellen met 500 μL van 0,5 M NaOH.</li>
		<li>Gebruik een Bradford-testkit om de eiwitconcentratie in het celmonster te meten, met runderserumalbumine (BSA) als standaard. OPMERKING: Zodra de eiwitconcentratie is gekwantificeerd, kan de snelheid van Zn-opname door RTgutGC-cellen worden uitgedrukt als pmolen Zn min-1 mg-1 eiwit.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Schijnbare beschikbaarheid van dieet Zn in Atlantische zalm (Salmo salar)
OPMERKING: De Atlantische zalmvoeders zijn geformuleerd op basis van commerciële voeders, die eiwitbronnen bevatten die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% viseiwit, 10% visolie, 68% plantaardig eiwit en 12% plantaardige olie). Twee voeders werden aangevuld met een anorganische bron (Zn-sulfaat) of een organische bron (Zn-chelaat van glycine) om een Zn-concentratie van 150 mg/kg voer te bereiken. Bovendien werd Yttriumoxide (feed grade) met 0,01% aan het voer toegevoegd als inerte marker om de schijnbare beschikbaarheidscoëfficiënt te kunnen berekenen.
<ol><li>Acclimatiseer de Atlantische zalm (SalmoBreed-stam, leeftijd 1 + jaar, groepen van gemengd geslacht) in hun respectieve tanks totdat de vissen gewend zijn aan de experimentele omstandigheden.</li>
	<li>Beoordeel de acclimatisatie van de Atlantische zalm door hun dagelijkse voeropname te controleren. OPMERKING: Deze proef werd uitgevoerd in drievoudstanks, dus in totaal werden zes tanks gebruikt. Tijdens de voedingsproef was de watertemperatuur 11,9 ± 0,3 °C en de verzadiging van opgeloste zuurstof 101 ± 5%.</li>
	<li>Voer de vis gedurende 11 dagen met experimentele feeds.</li>
	<li>Euthanaseer de vis door overdosis met behulp van 6 ml tricaine methaansulfaat stamoplossing per liter water.</li>
	<li>Verzamel een gepoold monster van uitwerpselen van de vis uit dezelfde tank in een plaat door striping van de ventrale vin naar de anus.</li>
	<li>Verwijder de uitwerpselen van de plaat met een spatel in een conische buis van 50 ml en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C. OPMERKING: De monsters werden bij -20 °C bewaard tot verdere analyse.</li>
	<li>Vries de uitwerpselenmonsters gedurende 72 uur bij -80 °C.</li>
	<li>Homogeniseer het ontlastingsmonster handmatig tot een fijn poeder met behulp van een stamper en mortel.</li>
	<li>Bepaal de concentratie van Zn en Yttrium in de voeder- en ontlastingsmonsters met behulp van een ICP-MS (zoals elders beschreven9).</li>
	<li>Bepaal de schijnbare beschikbaarheidscoëfficiënt (AAC, %) met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59862/59862eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilisation+of+feed+resources+in+production+of+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway.</a> Aquaculture. 448, 365-374 (2015).</li>
<li>Prabhu, P. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+dietary+supply+of+microminerals+as+a+premix+in+a+complete+plant+ingredient-based+diet+to+juvenile+rainbow+trout+%28Oncorhynchus+mykiss%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).</a> Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).</li>
<li>Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+biochemistry%3A+from+a+single+zinc+enzyme+to+a+key+element+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+nutrition%22%5BJournal%5D)">Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life.</a> Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).</li>
<li>Hogstrand, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogstrand%2C+C+%22Fish+Physiology%22">Fish Physiology</a>. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).</li>
<li>Baeverfjord, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mineral+nutrition+and+bone+health+in+salmonids%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Mineral nutrition and bone health in salmonids.</a> Reviews in Aquaculture. , (2018).</li>
<li>Maage, A., Julshamn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+zinc+status+in+juvenile+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+by+measurement+of+whole+body+and+tissue+levels+of+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc.</a> Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).</li>
<li>Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+of+zinc+in+fish+feed+by+size+exclusion+chromatography+coupled+to+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+%E2%80%93+Using+fractional+factorial+design+for+method+optimization+and+mild+extraction+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions.</a> Journal of Chromatography B. , (2018).</li>
<li>Prabhu, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+uptake+in+fish+intestinal+epithelial+model+RTgutGC%3A+Impact+of+media+ion+composition+and+methionine+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Trace+Elements+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation.</a> Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).</li>
<li>Silva, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+availability+of+zinc%2C+selenium+and+manganese+as+inorganic+metal+salts+or+organic+forms+in+plant-based+diets+for+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar).</a> Aquaculture. 503, 562-570 (2019).</li>
<li>Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+iron%2C+zinc%2C+sulfur+and+phosphorus+speciation+analysis+of+barley+grain+tissues+using+SEC-ICP-MS+and+IP-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS.</a> Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).</li>
<li>Lothian, A., Roberts, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standards+for+Quantitative+Metalloproteomic+Analysis+Using+Size+Exclusion+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Minghetti, M., Schirmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+media+composition+on+bioavailability+and+toxicity+of+silver+and+silver+nanoparticles+in+fish+intestinal+cells+%28RTgutGC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC).</a> Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).</li>
<li>Glover, C. N., Hogstrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+modulation+of+in+vivo+intestinal+zinc+absorption+in+freshwater+rainbow+trout%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout.</a> Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).</li>
<li>Ekman, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEkman%2C+R+%22Mass+spectrometry%3A+Instrumentation%2C+interpretation%2C+and+applications.+Wiley+Series+on+Mass+Spectrometry%22">Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry</a>. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).</li>
<li>Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+Size-Exclusion+Chromatography+for+the+Analysis+of+Protein+Biotherapeutics+and+Their+Aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).</li>
<li>Krezel, A., Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+inorganic+chemistry+of+zinc+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The biological inorganic chemistry of zinc ions.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nutrient+Requirements+of+Fish+and+Shrimp%22">Nutrient Requirements of Fish and Shrimp</a>. , The National Academies Press. (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De intestinale absorptie van Zn lijkt te worden beïnvloed door de chemische vorm van de Zn-soort13. In dit verband maakte het gebruik van de in dit artikel beschreven protocollen het mogelijk om achtereenvolgens de chemische en biologische aspecten te bestuderen die ten grondslag liggen aan de 'beschikbaarheid' van Zn in Atlantische zalm.
Deze studie rapporteerde het gebruik van een Zn-soortanalysemethode. De SEC-ICP-MS-methode leverde kwalitatieve gegevens op over het molecuulgewicht van chemische Zn-soorten die aanwezig zijn in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer. Dit werd bereikt door vergelijking van de retentietijden van de moleculaire gewichtskalibratiestandaarden (d.w.z. thyroglobuline (660 kDa), Zn/Cu superoxide dismutase (32 kDa), myoglobine (17 kDa) en vitamine B12 (1,36 kDa)) met de retentietijden van Zn-bevattende pieken. Een uitdaging gevonden in de Zn-soortanalyse was de identificatie van de onbekende chemische Zn-soort als gevolg van een gebrek aan analytische normen. In SEC is de scheiding van de moleculen gebaseerd op hun grootte ten opzichte van de poriën in de stationaire fase. In principe zullen grotere moleculen sneller reizen, eerst elueren, en kleinere moleculen zullen langzamer reizen, latereluteren 14. Bijgevolg kan elke Zn-bevattende piek verschillende verbindingen bevatten met een vergelijkbaar molecuulgewicht15. Dit draagt ook bij aan de uitdaging om onbekende chemische Zn-soorten te identificeren. Bovendien werden verschillende milde extractiecondities getest voor extractie van Zn. De geëxtraheerde Zn was laag (~10%). Milde extractieomstandigheden werden toegepast om de chemische Zn-soorten intact te houden, maar dit kan de extractie-efficiëntie in gevaar hebben gebracht7.
In de in vitro oplosbaarheidstest gaf de oplosbaarheid van aangevuld Zn (als radio-isotoop 65ZnCl2) aan dat de aminozuren, met name histidine en lysine, de oplosbaarheid van Zn verhoogden (figuur 5). Het rechtstreeks gebruik van voedermonsters voor in vitro oplosbaarheidstests onder gesimuleerde gastro-intestinale omstandigheden is gebaseerd op de wetenschap dat verandering in Zn-speciatie pH-afhankelijk is16. Zure omstandigheden aan het begin van het maagdarmkanaal kunnen echter leiden tot enige verandering in de soortvorming die onomkeerbaar kan zijn (bijv. ZnO -> ZnCl2, in aanwezigheid van HCl onder zure omstandigheden in de maag). Niettemin is de Zn-bron die hier wordt gebruikt ZnSO4 en waarvan de oplosbaarheid werd verbeterd door aminozuren in het medium. De volgende vraag die beantwoord moest worden was: kan de toegenomen oplosbaarheid vertaald worden naar beschikbaarheid? De RTgutGC darmcellijn werd gebruikt om deze vraag te bestuderen. In de context van minerale voeding bij dieren is de term 'beschikbaarheid' moeilijk te definiëren en kan deze differentieel worden gereguleerd in de cellen (in vitro) in vergelijking met een dier (in vivo). Vandaar dat de term 'opname' werd gebruikt als het ging om de in vitro evaluatie met behulp van intestinale cellijn. De cellijn leverde nuttige informatie op over de Zn-opnamemechanismen in het darmepitheel, dat deel uitmaakt van het complexe regulerende proces dat de beschikbaarheid van mineralen bij dieren regelt. De RTgutGC-cellen ontlokten een beter vermogen tot apicale opname van Zn in de aanwezigheid van een aminozuur (d.w.z. methionine; Figuur 6). De schijnbare beschikbaarheid in vivo verschilde echter niet significant tussen anorganische en organische Zn-bronnen in Atlantische zalm. In de in vivo beschikbaarheidsstudie werd de Zn-bronvergelijking gemaakt bij Zn-niveaus in de voeding die de bekende Zn-behoeften van Atlantische zalm17, totale Zn-concentratie van 150 mg / kg voer overschreden. De verschillen in beschikbaarheid worden beter gevisualiseerd wanneer de geteste voedingsniveaus in het lineaire dynamische bereik vallen voordat het dier verzadiging bereikt. In de huidige in vivo studie is het mogelijk dat de Atlantische zalm goed verzadigd was door het waargenomen verschil in Zn-absorptie tussen de gebruikte bronnen.
Samenvattend leverde de eerste methode kwalitatieve informatie op over verschillende chemische Zn-soorten die worden aangetroffen in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer; de tweede methode, in vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn werd verbeterd in aanwezigheid van aminozuurliganden; de derde methode bevestigde dat verbeterde oplosbaarheid door aminozuren de opname in het darmepitheel kan verbeteren; omgekeerd heeft de vierde methode geen verschillen gevonden in de beschikbaarheid van Zn van anorganische of biologische bron tot Atlantische zalm. Tot slot, hoewel niet in overeenstemming met de in vivo bevindingen, leverden de in vitro protocollen wel interessante inzichten op in het begrijpen van de verschillende componenten van de beschikbaarheid van Zn.

Vismeel en visolie werden traditioneel gebruikt in Atlantisch zalmvoer. Deze ingrediënten worden echter steeds vaker vervangen door plantaardige ingrediënten1. De bovengenoemde verschuiving in de samenstelling van het voer heeft geleid tot een lage beschikbaarheid via de voeding en een toegenomen behoefte aan verbetering van de beschikbaarheid van mineralen in Atlantische zalmvoeders, met name zink (Zn)2. De verminderde beschikbaarheid kan het gevolg zijn van een verandering in het Zn-gehalte, de chemische Zn-soort en/of antinutritionele factoren die aanwezig zijn in de voedermatrix. In dit scenario is een nieuwe reeks additieven ontstaan die algemeen als 'organische bronnen' worden beschouwd, met het potentieel om een beter beschikbare bron van voedingsmineralen voor vissen te zijn. Daarom is het belangrijk om de fundamentele chemie en fysiologie te begrijpen die de beschikbaarheid van mineralen en hun bronnen voor vissen regelen. Zink is een essentieel sporenelement voor alle levende organismen3. De rol van Zn als signaalmolecuul is beschreven op zowel paracellulair als intracellulair niveau in vissen4. Bij Atlantische zalm is Zn-deficiëntie in verband gebracht met skeletafwijkingen en verminderde activiteit van verschillende Zn-metallo-enzymen5,6.
Deze studie beschrijft een systematische benadering om de beschikbaarheid van Zn te begrijpen door het te categoriseren in vier verschillende compartimenten van gevarieerde chemische en biologische complexiteit. De betrokken methoden worden beschreven in vier secties, zoals te zien is in figuur 1:(1) evaluatie van Zn chemische soorten in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer met behulp van een grootte-uitsluiting chromatografie-inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (SEC-ICP-MS) methode7; 2) in vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer; (3) evaluatie van de opname van Zn-chemische soorten door middel van een in vitro darmmodel (RTgutGC)8; en (4) kennelijke beschikbaarheid van Zn in Atlantische zalm (Salmo salar)9. Soortgelijke protocollen kunnen worden ontwikkeld voor andere mineralen (bijv. Mangaan, selenium, koper) die van nutritioneel belang zijn voor aquacultuurvissoorten.

<table><tbody><tr><td>0.45 &micro;m spuitfilter</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;m membraanfilter</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % foetaal bovien serum</td><td>Eurobio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter</td><td>LKB Wallac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 wells platen (Falcon, TPP microplates)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10048760</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobicyclo(2.2.1)heptaan-2-carbonzuur</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A7902</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 celkweekkolven (Falcon, TPP weefselkweekkolven)</td><td>TPP Techno Plastic Products AG&nbsp;</td><td>90075</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf Centrifuge 5702</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>30089</td><td></td></tr><tr><td>DL-methionine</td><td>Alfa Aesar</td><td>59-51-8</td><td></td></tr><tr><td>D-methionine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M9375</td><td></td></tr><tr><td>Experimentele visvoeders</td><td>Skretting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Guard column, TSKgel SWxl Type (7 &mu;m deeltjesgrootte)</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>53319</td><td></td></tr><tr><td>HPLC gekoppeld aan een 7500ce ICP-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck</td><td>1.00317</td><td></td></tr><tr><td>Meelmolen</td><td>GM 300, Retsch Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>&nbsp;21083027</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>23128</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>LiChrosolv, HPLC-kwaliteit, Merck&nbsp;</td><td>1.06035</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water (18.2&nbsp;M&Omega;&nbsp;cm)&nbsp;</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myoglobine&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>NexION 350D ICP-MS</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter&nbsp;</td><td>inoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zout (PBS)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>RTgutGC cellen&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Verkregen uit de collectie van Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Zwitserland</td></tr><tr><td>SEC kolom, TSKgel G3000SWxl</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeef roestvrij staal (850?&mu;m - 1.12?mm)</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Superoxide dismutase&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>S7571</td><td></td></tr><tr><td>Thyroglobuline&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T1001</td><td></td></tr><tr><td>Tricainemethanesulfonaat</td><td>PharmaQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine in 0,25% in fosfaat-bufferzoutsavooi</td><td>Biowest</td><td>L0910</td><td></td></tr><tr><td>Versene EDTA-oplossing</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>Vitamine B12</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>Zinkchelaat van glycine</td><td>Phytobiotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfaat</td><td>Vilomix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in atlantische zalm

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Het beoordelen van de beschikbaarheid van micromineralen in de voeding is een grote uitdaging in de minerale voeding van vissoorten. Dit artikel beoogt een systematische aanpak te beschrijven die verschillende methodologieën combineert om de beschikbaarheid van zink (Zn) in Atlantische zalm(Salmo salar)te beoordelen. Gezien het feit dat verschillende chemische Zn-soorten aanwezig kunnen zijn in een Atlantisch zalmvoer, werd verondersteld dat de beschikbaarheid van Zn wordt beïnvloed door de chemische Zn-soorten die in het voer aanwezig zijn. In deze studie gaat het eerste protocol dus over hoe de verschillende chemische Zn-soorten uit het voer kunnen worden geëxtrahuteerd en geanalyseerd door een grootte-uitsluiting chromatografie-inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (SEC-ICP-MS) -methode. Vervolgens werd een in vitro methode ontwikkeld om de oplosbaarheid van Zn in de voeding in Atlantische zalmvoeders te evalueren. Het derde protocol beschrijft de methode om de impact van het veranderen van de samenstelling van Zn chemische soorten op de opname van Zn in een visinaal epitheelmodel te bestuderen met behulp van een regenboogforel darmcellijn (RTgutGC). Samen werden de bevindingen van de in vitro methoden vergeleken met een in vivo studie naar de schijnbare beschikbaarheid van anorganische en organische bronnen van Zn aangevuld met Atlantische zalmvoeders. De resultaten toonden aan dat verschillende chemische soorten Zn in voeders kunnen worden gevonden en dat de efficiëntie van een organische Zn-bron sterk afhangt van het aminozuur ligand dat wordt gebruikt om Zn te cheleren. De bevindingen van de in vitro methoden hadden minder correlatie met die uitkomst van de in vivo studie. Niettemin leverden in vitro protocollen die in dit artikel worden beschreven cruciale informatie op over de beschikbaarheid van Zn en de beoordeling ervan in visvoeders.

Evaluatie van chemische Zn-soorten in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer met behulp van een SEC-ICP-MS-methode De SEC-ICP-MS-methode levert gegevens op over de chemische Zn-soorten die worden aangetroffen in de oplosbare fractie van het Atlantische zalmvoer. Figuur 4 illustreert het chromatografische profiel van Zn in de oplosbare fractie. Dit chromatogram werd verkregen met behulp van de SEC-ICP-MS methode. Vijf Zn bevattende pieken werden gevonden in de oplosbare fracties van het Atlantische zalmvoer. Elke piek heeft een ander molecuulgewicht; piek één (~ 600 kDa), piek twee en piek drie (van 32 tot 17 kDa), piek vier (van 17 tot 1,36 kDa) en piek vijf (> 1,36 kDa). Piek vier was het meest overvloedig, gevolgd door respectievelijk piek twee, drie, vijf en één. De chemische Zn-soorten die in de oplosbare fractie worden aangetroffen, kunnen verschillende bronnen hebben omdat het gebruikte voer zowel mariene als plantaardige ingrediënten en aangevulde vorm (d.w.z. Zn-sulfaat) bevat. Het molecuulgewichtsbereik van de chemische Zn-soort suggereerde dat deze verbindingen metalloproteïnen zouden kunnen zijn.
In vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer De oplosbaarheid van aangevuld 65Zn nam toe in aanwezigheid van aminozuren. Alle geteste aminozuren verhoogden de oplosbaarheid van aangevuld 65 Zn.Methionine, glycine, cysteïne, histidine en lysine verbeterden de oplosbaarheid van 65Zn; hogere oplosbaarheid werd gevonden met histidine en lysine(figuur 5).
Evaluatie van de opname van Zn-soorten met behulp van een in vitro darmmodel (RTgutGC) Apicale zinkopname in RTgutGC-cellen werd significant beïnvloed door de aanwezigheid van L-Met of DL-Met bij 2 mM-concentraties. Bovendien werd de impact van methionine op de opname van Zn in RTgutGC-cellen negatief beïnvloed door de aanwezigheid van BCH (een aminozuurtransportsysteemblokker), in vergelijking met cellen die niet met BCH zijn behandeld(figuur 6).
Schijnbare beschikbaarheid van dieet Zn in Atlantische zalm (Salmo salar) In praktische voeders voor Atlantische zalm was de schijnbare beschikbaarheid van Zn hetzelfde bij aanvulling met een anorganische bron (Zn-sulfaat) of een organische bron (Zn-chelaat van glycine). De geschatte waarden voor de schijnbare beschikbaarheid van Zn (%, n = 3) in Atlantische zalm waren 31% ± 12% bij suppletie met een anorganische bron (Zn-sulfaat) en 31% ± 3% bij aanvulling van een organische bron (Zn-chelaat van glycine).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig1.jpg"> Figuur 1: Een samenvatting van de systematische aanpak om de beschikbaarheid van mineralen te beoordelen met behulp van complementaire methoden. Deze benadering werd gebruikt om de beschikbaarheid van zink in Atlantische zalm te bestuderen, waaronder Zn-soortvorming, Zn-oplosbaarheid in het darmmilieu, Zn-opname door darmcellen en Zn schijnbare beschikbaarheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig2.jpg"> Figuur 2: Een samenvatting van de procedure voor Zn-extractie uit een voedermonster. Zink wordt gewonnen uit een voedingsmonster met behulp van milde extractieomstandigheden. De extractie wordt gevolgd door Zn-soortvormingsanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig3.jpg"> Figuur 3: Een voorbeeld van de RTgutGC-cellen 1 h (links) en 1 week (rechts) na het zaaien in de celkweekkolven. Klik hier voor een grotere versie van deze <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig3large.jpg" target="_blank">figuur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig4.jpg"> Figuur 4: Een chromatogram met de Zn-bevattende pieken van de oplosbare fractie van Atlantisch zalmvoer en geanalyseerd door SEC-ICP-MS. De drie replicaties worden gekenmerkt door de blauwe, rode en zwarte lijnen. Een moleculaire gewichtskalibratie werd uitgevoerd met thyroglobuline (660 kDa, monitoring 127I), Zn/Cu superoxide dismutase (32 kDa, monitoring 66Zn), myoglobine (17 kDa, monitoring 57Fe), vitamine B12 (1,36 kDa, monitoring 59Co); Piek 1 (P1): ~600 kDa, retentietijd (RT) 8,2 min; Piek 2+3 (P2+3): van 32 tot 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Piek 4 (P4): van 17 tot 1,36 kDa, RT 16,3 min; Piek 5 (P5): > 1,36 kDa, Rt 23,2 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig5.jpg"> Figuur 5: De impact van aminozuren op de in vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). Gegevens werden geanalyseerd door middel van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door dunnet's meervoudige vergelijkingstest, waarbij het gemiddelde van elke AA-groep werd vergeleken met dat van de controlegroep (geen AA). De sterretjes geven het significantieniveau van ANOVA aan (P-waarden < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) en < 0,0001 (****)). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig6.jpg"> Figuur 6: De invloed van methionine en een aminozuurtransportremmer (2-Aminobicyclo [2.2.1] heptaan-2-carbonzuur, BCH, 10 mM). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). Gegevens werden geanalyseerd via tweerichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest met p < significantieniveau van 0,05. Post-hoc verschillen tussen groepen worden weergegeven als superscriptletter boven de balken; balken met verschillende superscripten zijn statistisch verschillend (p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>HPLC-instellingen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kolom</td>
			<td>SEC-kolom (30 cm x 7,8 mm, deeltjesgrootte 5 μm) + beschermkolom (deeltjesgrootte 7 μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalibratiebereik</td>
			<td>1,0 × 104 - 5,0 × 105 Da</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mobiele fase</td>
			<td>50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Debiet</td>
			<td>0,7 ml min−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injectie volume</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICP-MS-instellingen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Voorwaarts vermogen</td>
			<td>1550 W</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plasma gasstroom</td>
			<td>15,0 l min−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dragergasstroom</td>
			<td>0,86 l min−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Make-up gasstroom</td>
			<td>0,34 l min−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verblijftijd</td>
			<td>0,1 s per isotoop</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isotopen gemonitord</td>
			<td>
127 I, 66Zn, 59Co, 57Fe</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Een overzicht van instrumentinstellingen voor de HPLC en ICP-MS.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Chemische samenstelling (mM)</td>
			<td>L15/ex</td>
			<td>Experimenteel medium (L15/FW)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumnitraat</td>
			<td>155</td>
			<td>155</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaliumnitraat</td>
			<td>6.2</td>
			<td>6.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesiumsulfaat</td>
			<td>3.8</td>
			<td>19.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Calciumnitraat</td>
			<td>1.5</td>
			<td>5.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesiumchloride</td>
			<td>-</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumpyruvaat</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Galactose</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.1</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ionische sterkte</td>
			<td>178</td>
			<td>258</td>
		</tr>
<tr height="36">
<td>Ionische samenstelling (mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Calcium, Ca2+ *
</td>
			<td>1,6 ± 0,1</td>
			<td>5,3 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesium, Mg2+ *
</td>
			<td>3,9 ± 0,3</td>
			<td>32,5 ± 0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalium, K+ *
</td>
			<td>8,2 ± 1,2</td>
			<td>8,6 ± 1,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium, Na+ *
</td>
			<td>160 ± 3</td>
			<td>157 ± 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitraat, NO3- **
</td>
			<td>164</td>
			<td>172.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfaat, SO4- **
</td>
			<td>3.8</td>
			<td>18.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chloride, Cl- **
</td>
			<td>1.5</td>
			<td>31.5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. De chemische en ionische samenstelling van de experimentele media getest.

In dit artikel wordt in detail een systematische aanpak uitgelegd om de beschikbaarheid van micromineralen in Atlantische zalm te beoordelen. De methodologie omvat instrumenten en modellen met toenemende biologische complexiteit: (1) chemische soortanalyse, (2) in vitro oplosbaarheid, (3) opnamestudies in cellijnen en (4) in vivo visstudies.

Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

We bestudeerden de beschikbaarheid van oplosbaarheid van micrometalen zoals zinkseleen met verschillende chemische vormen of bronnen, zoals we het noemen, in de context van veranderende voersamenstelling. Weeg in een radionuclidesuite ongeveer 0,2 gram gemalen Atlantische zalmvoermonsters af en meng deze met een zinkradiotracer met bekende specifieke activiteit in een monsterbuis van vijf milliliter volume. Bereid zes andere aliquots van de buffer en voeg een van de hier afgebeelde aminozuren toe aan elk om een uiteindelijke molaire concentratie van vijf millimolar te bereiken.Voeg zoetwater intestinale luminale buffer toe om het monster te voeden. Voeg vervolgens de zoetwater intestinale luminale buffer toe aan de buffer aliquots die de aminozuren bevatten. Sluit de buizen en draai ze op een roterende spinner met 25 RPM gedurende 30 minuten.Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 1. 157 x g om de oplosbare en niet-oplosbare fracties te scheiden. Gebruik een gammateller om het aantal per minuut van de zinkradiotracer in de oplosbare en niet-oplosbare fracties te meten. Was de van regenboogforel afgeleide darmcellijn tweemaal met één milliliter EDTA-oplossing en hevel de oplossing na elke wasbeurt uit met een pipet.Behandel de gewassen cellen met 0,25% trypsine-oplossing. Draai de kolf voorzichtig twee minuten onder scherpe hoeken. Voeg vervolgens 10 milliliter L-15 medium met 5% FBS toe om het trypsine te neutraliseren.Decanteer met behulp van een steriele pipet de resulterende celsuspensie in een conische centrifugebuis aan de onderkant. Centrifugeer bij 130 x G gedurende drie minuten. Bepaal vervolgens met behulp van een hemocytometer de dichtheid van de geoogste cellen door handmatig te tellen.Zaai de cellen op 24 putplaten met een celdichtheid van 50.000 cellen per milliliter, per put, en incubeer de platen bij 19 graden Celsius onder een normale atmosfeer gedurende 48 uur voorafgaand aan de experimenten. Na het voeren van de vis gedurende 11 dagen en het euthanaseren, verzamel je een gepoold monster van de uitwerpselen van de vis door van de ventrale vin naar de anus te strippen en op een bord te leggen. Gebruik een spatel om de uitwerpselen van de plaat over te brengen in een conische buis van 50 milliliter.Bewaar de monsters onmiddellijk bij 20 graden Celsius. In deze studie wordt de minerale beschikbaarheid van visvoer beoordeeld met behulp van een aantal complementaire methoden. Representatieve analyse van Atlantisch zalmvoer via de grootte-uitsluitingschromatografie inductief gekoppelde plasmamassaspectrometriemethode, levert gegevens op over de zinkchemische soorten die in de oplosbare fractie worden aangetroffen.In deze fractie zijn vijf zinkhoudende pieken te zien, elk met een ander molecuulgewicht. De zinkchemische soorten die in de oplosbare fractie worden aangetroffen, kunnen verschillende bronnen hebben, omdat het gebruikte voer zowel mariene als plantaardige ingrediënten bevat en wordt aangevuld. Het molecuulgewichtsbereik van deze soorten suggereert dat deze verbindingen metalloproteïnen kunnen zijn.Terwijl de oplosbaarheid van aangevuld zink 65 de aanwezigheid van alle geteste aminozuren verhoogt, wordt een hogere oplosbaarheid gevonden met histidine en lysine. Apicale zinkopname in Arteca GC-cellen wordt significant beïnvloed door de aanwezigheid van L-Met of DL-Met bij twee millimolarconcentraties. Bovendien wordt de impact van methionine op de zinkopname negatief beïnvloed door de aanwezigheid van BCH.Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat we hebben geprobeerd om verschillende benaderingen te combineren in visuele, analytische en invivo-studies, om elkaar te vergelijken en aan te vullen als het gaat om het bestuderen van de beschikbaarheid van mineralen.

assessing-mineral-availability-fish-feeds-using-complementary-methods

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een nieuwe methode voor het verminderen van variabiliteit bij het blootstellen van vissen aan geneesmiddelen wordt uitgelegd. Vissen die werden blootgesteld aan verschillende patronen van ethanolblootstelling bleken veranderde angstniveaus te hebben tijdens ontwenning in een licht/donker scototaxisch onderzoek.

Een nieuwe methode van de Drug aan Multiple zebravis ( Danio rerio) En de kwantificering van Terugtrekking

Dit bioassay maakt gebruik van een model roofvissen aan de aanwezigheid van het voeden-afschrikmiddel metabolieten van organische extracten van de weefsels van mariene organismen in de natuurlijke concentraties met behulp van een qua voedingswaarde vergelijkbaar voedsel matrix beoordelen.

Een vis van borstvoeding Laboratory Bioassay de Antipredatory activiteit van secundaire metabolieten te beoordelen vanuit de weefsels van mariene organismen

Integratie van microalgencultivatiek met industrieel rookgas zal uiteindelijk zware metalen en andere anorganische verbindingen in de groeimedia introduceren. Deze studie presenteert een procedure die wordt gebruikt om het eindlot en de impact van zware metalen en anorganische verontreinigingen op de groei van Nannochloropsis salina gekweekt in fotobioreactoren te bepalen.

Kwantificering van zware metalen en andere anorganische contaminanten op de productiviteit van microalgen

Hier presenteren we een eenvoudig te volgen protocol om een succesvol hydrocultuursysteem op te zetten voor studies naar plantenvoeding. Dit protocol is uitvoerig getest op Arabidopsis en kan eenvoudig worden aangepast aan andere plantensoorten om specifieke voedingsbehoeften of de invloed van niet-essentiële elementen op plantengroei en -ontwikkeling te bestuderen.

Hydrocultuur: Een veelzijdig systeem om Nutrient Toewijzing en Plant Responses to beschikbaarheid van voedingsstoffen en de blootstelling aan giftige elementen Studie

Zebravissen ontwikkelen zich tot een waardevol model voor de verwerking van voedingslipiden en metabole ziekten. Beschreven worden protocollen van lipide-rijke larvale voeders, live beeldvorming van voedingsfluorescente lipide-analoga en kwantificering van voedselinname. Deze technieken kunnen worden toegepast op een verscheidenheid aan screenings-, beeldvormings- en hypothesegestuurde onderzoekstechnieken.

Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname

Dit protocol beschrijft het gebruik van sump swabs en slib analyse van zebravis systemen, die tot verhoogde detectie in vergelijking met het exclusieve gebruik van sentinels leidt te detecteren ziekteverwekkers zoals Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en  Pseudocapillaria tomentosa. Een systeem om te controleren van P. tomentosa eieren in quarantaine wordt ook voorgesteld.

Milieu Screening van Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish systemen

Gekweekte primaire of gevestigde cel lijnen worden vaak gebruikt om fundamentele biologische en mechanistische vragen als een eerste aanpak aan te pakken voor het gebruik van dierlijke modellen. Dit protocol beschrijft hoe u hele cel extracten en subcellulaire fracties voor de studies van zink (Zn) en andere sporenelementen met atomaire absorptiespectroscopie voor te bereiden.

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

De verhoogde snelheid van farmaco- en toxicokinetische analyses van metalen en op metaal gebaseerde verbindingen in zebravissen kan voordelig zijn voor milieu- en klinische vertaalstudies. De beperking van onbekende blootstelling aan water werd overwonnen door sporenmetaalanalyse uit te voeren op verteerd zebravisweefsel met behulp van inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie.

Dosisopname van op platina en ruthenium gebaseerde samengestelde blootstelling bij zebravissen door inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie met bredere toepassingen

Dit protocol beschrijft de bereiding van Zn2+-beperkte media, kweekvaten en zaaikulturen om Zn2+-beperkte ribosomen in mycobacteriën te produceren. Sporen van Zn2+ leiden tot Zn2+-beperkte groei en we beschrijven morfogene eigenschappen die als bio-indicatoren worden gebruikt om Zn2+-beperking in vitro te verifiëren in het modelbacterie, Mycobacterium smegmatis, en de humane pathogeen M. tuberculosis.

Gebruik van Mycobacterium smegmatis als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën

Deze studie presenteert een gelatine-gebaseerde voedingsmethode die precieze, niet-invasieve orale toediening van geneesmiddelen op basis van lichaamsmassa bij volwassen zebravissen mogelijk maakt. Het protocol toont betrouwbare voeracceptatie aan en, als bewijs van het principe, succesvolle levering van MK-801, wat resulteerde in de verwachte gedragseffecten.

Een eenvoudige en precieze voergebaseerde benadering van orale medicijnafgifte bij vissen

Leer hoe je de beschikbaarheid van zink in Atlantische zalmvoeders beoordeelt met analytische, in vitro en in vivo methoden. Deze aanpak helpt onderzoekers bij het optimaliseren van minerale opname in aquacultuur.

Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm

Meer video's verkennen