Geïntegreerde cel manipulatie platform in combinatie met de single-probe voor massaspectrometrie analyse van drugs en metabolieten in enkele schorsing cellen

Aangezien deze methode cellen van oplossing analyseert, kan het worden gebruikt om cellen in een dichtbijgelegen inheemse omgeving te bestuderen. Dit omvat de analyse van door de patiënt afgeleide celmonsters. Deze techniek vereist weinig tot geen monstervoorbereiding van cellen.

Daarom kunnen we individuele cellen online analyseren onder omgevingsomstandigheden, waardoor we cellulaire heterogeniteit kunnen verkennen. Deze techniek kan worden toegepast om vloeibare biopten uit verschillende ziektetoestanden te bestuderen, omdat het verschillende soorten cellen kan analyseren die rechtstreeks zijn geïsoleerd uit patiëntmonsters. Om enkele boring glazen buizen om te zetten in een taps toelopende sonde met een scherpe punt, plaats eerst een enkele boring glazen buis in de klemmen van een verticale pipet houder, centreren van het glas met betrekking tot de verwarmingsspoel en draai aan om de buis vast te zetten op zijn plaats.

De verwarmingsspoel bestaat uit een 18-meters nikkel chroomweerstanddraad die 2,5 keer rond een metalen staaf is opgerold. Stel de glazen buizen met temperatuurprogramma 19,5 in. Zet de solenoïde zuiger op vier.

Activeer de solenoïde om de glazen buizen te trekken. Deze stap maakt twee sondes gesmolten aan de punt. Gebruik truien om ongeveer een millimeter van het puntje van elke sonde te snijden, waardoor een opening van ongeveer 10 micron in diameter ontstaat bij de sondepunt.

Om de glazen sonde te buigen voor een eenvoudige koppeling aan de ICMP, stelt enkele sonde SCMS zich op. Stel eerst een getrokken glassonde in de microforge. Plaats de top ongeveer drie millimeter boven de platina verwarmingsdraad.

Zet vervolgens het vuur op de platinadraad op 30% van de maximale temperatuur. Buig de sonde ongeveer 45 graden van de oorspronkelijke positie. Plaats de geverteerde microinjector in twee celmanipulatiesystemen op een gemotoriseerde tafel voor eenvoudige koppeling met de massaspectrometer.

Als u het apparaat voor de selectie van de glazen cel wilt instellen, plaatst u de sonde voor de selectie van de glazen cel in de metalen houder van de microinjector door de lange schuif in de capillaire houder te plaatsen en de schroef aan te draaien om de sonde op zijn plaats te krijgen. Plaats de sondetips schuin parallel aan de verwarmde plaat. Beveilig de metalen houder van de micro-injector in het celmanipulatiesysteem.

Plaats vervolgens de sonde tip in de buurt van het midden van de omgekeerde microscoop licht. Zet de glazen schuif met de enkele sonde in de armklem van het celmanipulatiesysteem. Sluit het oplosmiddel dat capillair aan een geleidende unie verstrekt door het capillair in de koker van de plastic ferrule te plaatsen en de vinger aan te draaien.

Sluit de andere kant van de geleidende unie aan op een capillair dat is aangesloten op een spuit die het bemonsteringsmiddel bevat door de capillaire in de mouw te plaatsen en de fitting aan te spannen. Gebruik acetonitril met 0,1%mierenzuur als bemonsteringsoplosmiddel in deze experimenten. Zet de spuit vast in de spuitpomp op de massaspectrometer.

Plaats de nanoelectrospray ionisatie of nano ESI zender ongeveer een millimeter aan de opening van de uitgebreide ionen transfer buis. Gebruik het celmanipulatiesysteem om de ruimtelijke bewegingen van de enkele sonde te regelen en de nano ESI-zender centraal voor de uitgebreide ionenoverdrachtsbuizen te plaatsen. Pipette de cellen van de celcultuurkolf in een 15 milliliter centrifugebuis.

Draai de cellen op 400 keer G in 37 graden Celsius gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Resuspend de cellen in vier milliliter RPMI medium met de drug verbinding bij de gewenste behandeling concentratie. Pas de experimentele parameters voor de massaspectrometer aan.

Selecteer onder de kop scanmodus van de instrumentsoftware de optie Scan definiëren. Gebruik een resolutie van 60.000 bij M over Z 400, één microscan maximale injectietijd van 100 milliseconden en automatische versterkingscontrole. Selecteer onder spuitpomp de stroomsnelheid van 150 nanoliters per minuut.

Selecteer NSI-bron en breng een spanning van ongeveer 4,5 kilovolt aan. Zet de omgekeerde microscoop op 40 keer vergroting geselecteerd voor zowel de bovenste plaat en onderste lens. Sluit deze aan op de USB-poort van een laptop om live videofeeds vast te leggen.

Zet de verwarmde plaat aan en zet deze in op 37 graden Celsius. Ga op de computer naar het tabblad gegevens verwerven en selecteer continu onder verkregen tijd. Om het monster voor te bereiden op analyse, pipet twee tot drie van het monster in het deksel van een kleine petrischaal.

Plaats het monster in het midden van het licht van de omgekeerde microscoop bovenop de verwarmde plaat. Bereid de sonde voor de selectie van de glascel voor op analyse. Gebruik het celmanipulatiesysteem om de sonde te verplaatsen, zodat de bovenkant onder het omgekeerde microcsope in hetzelfde vlak als de cellen is gericht.

Gebruik het celmanipulatiesysteem om de testpunt voor celselectie naar een gerichte cel te verplaatsen voor analyse. Dit proces wordt gecontroleerd met behulp van de omgekeerde microscoop. Draai voorzichtig het handvat van de microinjector om de positie van de minerale olie in de slang aan te passen.

Een zachte zuigkracht wordt geleverd door de microinjector om de beoogde cel te beveiligen om de cel selectie sonde tip. Gebruik het celmanipulatiesysteem om de cel op de celselectiesondepunt naar de enkele sondetip te verplaatsen met behulp van een digitale microscoop die is gericht op de enkele sondetip om dit proces te controleren. Onbehandelde K-562-cellen worden gebruikt om de experimentele methode vast te stellen.

In een typisch SCMS-experiment kunnen duidelijke veranderingen van massaspectra worden waargenomen van het overbrengen van een cel tijdens de detectie van cellulaire inhoud en na het beëindigen van de meting. Drie veelvoorkomende cellulaire lipidepieken, waaronder PC 34:4, PC 36:4 en PC 38:5, worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de cel met succes wordt overgedragen en mobiele inhoud wordt gedetecteerd. De identiteit van veel pc's in het massabereik van 750 tot 850 wordt bevestigd met MSMS op onbehandelde celmonsters.

Met behulp van de ICMP single probe MS set-up werden Gemcitabine, Taxol en OSW1 gedetecteerd na incubatie met K-562 cellen. Deze resultaten suggereren deze methode kan worden gebruikt om intracellulaire lipiden, drugs en metabolieten te bestuderen op het niveau van de eencellige cellen van cellen in oplossing in een bijna inheemse omgeving. Vergeet niet om de glascelselectiesonde veilig in de universele pipethouder te plaatsen, zodat de zuigkracht adequaat kan worden toegepast.

Deze methode kan ook worden toegepast op patiënt afgeleide monsters om verschillen tussen cellulaire metabolieten te onderscheiden van een verscheidenheid van celtypen, die ons in staat stelt om een beter begrip van deze ziektetoestanden te krijgen. Na het ontwikkelen van deze methode, kunnen we mogelijk de kwantificering van geneesmiddelenverbindingen op het niveau van eencellige implementeren. Bij het werken met cellen is het belangrijk om over passende persoonlijke beschermingsmiddelen te beschikken, waaronder een labjas en handschoenen.

Extra oogslijtage kan worden gebruikt bij het werken met glas.