Voorbereiding en karakterisering van Nanoliposomes voor de Entrapment van bioactieve hydrofiele bolvormige eiwitten
31 augustus 2019
Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.
De bereiding van liposomale nanocapsules door middel van een extrusietechniek zal stap voor stap worden uitgevoerd in de beknelling van tarin 48 kilodaltons globular in hydrofiele eiwitten gezuiverd uit colocasia esculenta zal worden aangetoond. Alle procedures voor de karakterisering van de nanocapsules omvatten de scanning elektronenmicroscopie en de dynamische lichtverstrooiing zal ook worden gevolgd. Capsulation procedures kunnen worden geconfronteerd met een aantal uitdagingen van de lipiden keuze aan het bereiken van hoge efficiëntie inkapseling, het houden van de bio-activiteit van de in gevangen moleculen.
Protocol dat zal worden beschreven kan een aantal van deze moeilijkheden te overwinnen. Weeg de liposoom componenten af met een analytische balans. Los de lipidecomponenten in chloroform op met behulp van een volumetrische kolf die in een roterende verdamper past om materiaalverlies te voorkomen.
Roer het mengsel op 150 RPM gedurende 15 minuten. Verwijder de chloroform met behulp van een roterende verdamper. Pas de volumetrische kolfmond aan de standaardpositie aan voor de beste efficiëntie, terwijl u in contact komt met het water uit het verwarmingsbad.
Stel de parameters in volgens het beschreven protocol. Verwijder na ongeveer 25 minuten de kolf en gooi het verdampte oplosmiddel op de juiste manier weg. Een dunne en ondoorzichtige film wordt gevormd en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd.
Hydrateer de lipidefilm in een ammoniumsulfaatoplossing die tarin bevat met één milligram per milliliter. Roer het mengsel gedurende 40 minuten en broeden 's nachts op vier graden Celsius. Vervolgens, sonicate de schorsing voor een minuut op 25 graden Celsius, kamertemperatuur.
Om de vesiclegrootte te verkleinen en aggregatie te voorkomen, plaatst u het polycarbonaatmembraan tussen twee voorwettige filtersteunen en plaatst u het in de houder. Steek een lege spuit in het apparaat, vul de andere met een milliliter van de liposomale suspensie, en steek het aan de andere kant. Voer een 12-cyclus extrusie uit door een 2 micrometer polycarbonaat porie membraan.
Duw het monster langzaam van de ene spuit naar de andere. Aan het einde moet de liposomale suspensie duidelijk worden tijdens het excursieproces, als gevolg van groottevermindering. Ongeveer 2 milliliter van het monster kan verloren gaan tijdens deze stap.
Scheid de liposomen door ultracentrifugatie. Weeg eerst het monster in de titanium buis en breng de buizen in balans. Controleer het minimumvolume dat moet worden gevuld en pas indien nodig het volume aan met ammoniumsulfaat.
Plaats de titanium buizen in de zwenkbak. Open de centrifugedeur en plaats de rotor erin. Sluit de centrifugedeur, druk op het vacuüm en wacht tot het vacuüm 200 tot minder dan 20 micron bereikt.
Pas de parameters in het ultracentrifugescherm aan. Druk op terugroepen, controleer de voorwaarden en start de run. Laat na 90 minuten het vacuüm los door op de vacuümknop te klikken en open de centrifugedeur.
Haal de rotor van binnenuit. Houd het ultracentrifugemonster op ijs en scheid vervolgens de supernatant van de pellet, door de buis ondersteboven te draaien, in een wegwerpcentrifuge van 59 mil om de supernatant van de pellet te scheiden. Bewaar het supernatant met het ongeuitkapselde eiwit op vier graden Celsius.
Dit zal worden gebruikt om de inkapselingsefficiëntie te bepalen. De pellet wordt gepresenteerd als een doorschijnende gelei. Hang de pellet en warmte HEPES gebufferde zoutoplossing.
Kijk op het protocol voor meer informatie. Bepaal de inkapseling efficiëntie door peterson's protocol, om lipide interferentie in eiwit kwantificering te voorkomen. Monsters moeten in drievoud worden geanalyseerd.
Verdun in een microfugebuis de lipsomale supernatant of BSA met één milligram per milliliter met water tot een eindvolume van één milliliter. Voeg DOC toe en uit te broeden gedurende 10 minuten. Voeg 1 milliliter van 72% TCA toe en meng goed.
Centrifuge op 3.000 g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant voorzichtig weg door de buis naar beneden af te wenden, op een absorberend papier te leggen en het te laten drogen. Hang de pellet in een milliliter water.
Meng grondig om ervoor te zorgen dat de pellet is opgelost. Breng het monster vervolgens over naar reageerbuizen. Voeg een milliliter reagens A toe, meng en broed gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Voeg 5 milliliter reagens B toe, meng en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Bepaal de absorptie op 750 nanometer en bereken de inkapselingsefficiëntie. De grootte gemiddelde en grootte verdeling wordt bepaald door dynamische lichtverstrooiing.
Breng de liposomale nanovesikels over naar een wegwerpsizing cuvette. Plaats de cuvette in de apparatuur. Stel de parameters van de apparatuur in.
Voor stabiliteitsbepaling, bewaar de liposomen op vier graden Celsius en controleer de grootteverdeling en grootte gemiddeld regelmatig. Liposoom karakterisering door het scannen van elektronenmicroscoop wordt uitgevoerd volgens Murta en Ramasamy in drievoud. Bevestig de glazen deksel slips in de bodem van een petrischaaltje met een tape.
Bedek de hoesjes met Poly-L-lysine. Plaats een nat filterpapier in de petrischaal om vocht en incubeer gedurende een uur te behouden. Spoel af met gedestilleerd water.
Voeg een druppel van het monster en laat het drogen voor een uur, op kamertemperatuur. Om de monsters te repareren, bedek ze met glutaraldehyde, bereid in fosfaatbuffer. Plaats natte filterpapieren in de petrischaal.
Het is belangrijk om de petrischaal te verzegelen. Incubeer op vier graden Celsius gedurende 48 uur. Spoel de afdekking drie keer gedurende vijf minuten per stuk, met dezelfde fosfaatbuffer.
Dehydrateer de monsters als volgt door het wassen in een toenemende ethanol concentratie oplossing van 35% tot absolute ethanol. Droog de monsters chemisch gedurende 10 minuten met hexamethyldisilazane. De hexamethyldisilazane moet zorgvuldig worden gemanipuleerd in een rookkap.
Monsters moeten worden toegestaan om 's nachts te drogen in een desiccator of in de rookkap bij kamertemperatuur. Monteer de gedroogde monsters op een stomp, met een koolstofgeleidende plakband. Sputter de stompen met goud.
Neem SEM-beelden op met een scanning elektronenmicroscoop, SEM, bij lage vacuümmodus en lage spanning, 20 kilovolt. Figuur één beschrijft de nano liposoom voorbereiding. Fosfolipiden, dope, peg en chems, de belangrijkste liposoom bestanddelen, werden eerst opgelost in chloroform om de lipide film te verkrijgen.
De lipide film werd vervolgens gerehydrateerd in een zoutbuffer, met de hydrofiele eiwit, tarin, te vangen, en de incubatie moet worden voorgevormd 's nachts. Vervolgens worden sonicatie en extrusie toegepast om kleine unilamellar adervles te genereren. De ultracentrifugatiestap scheidt liposomale bereiding van vrije lipiden en ongeuitkapselde eiwitten.
Terwijl de supernatant wordt gebruikt voor de bepaling van de beknelling efficiëntie. Nanoliposomen geproduceerd met behulp van de bovengenoemde methode vertonen een grootte verdeling variërend van 51 tot 396 nanometer, en een gemiddelde grootte van 155 nanometer. De voorbereiding is homogeen, aangezien de polidispersity index van 168 is.
Een hoge beknellingsefficiëntie van 83% wordt bereikt als de liposomen worden geëxtrudeerd door een membraan van 2 micrometergrootte. Morfologische nanoliposoom kenmerken werden geëvalueerd door elektronenmicroscopie te scannen. Liposomen moeten uiteindelijk op dezelfde manier worden behandeld als levende cellen, om beelden van betere kwaliteit te verkrijgen.
Fixatie- en droogprocedures zijn belangrijk om de visualisatie te garanderen van kleinere intacte akeltjes die meer dan 20 kilovolt onder vacuümomstandigheden ondersteunen. Figuren 2A en 2B tonen ronde liposomale vesikels in het bereik van 121 nanometer, geanalyseerd op 20 kilovolt. Terwijl de cijfers 2C en 2D, tonen onvoldoende voorbereide monsters.
Mishandelde monsters alleen toegestaan voor de observatie van grotere en of beschadigde akeltjes, die niet kunnen weerstaan vacuüm en of spanning voorwaarden. Protocol beschreven, hier in, toegestaan voor de productie van reproduceerbare agelsjes met een ronde vorm, klein oppervlak, en de gemiddelde grootte van ongeveer 150 nanometer. De methode kan worden gebruikt om complexe en grote moleculen te vangen, als een tetramerisch eiwit, met een hydrofiele corrector.
Deficiënte zelfingtrap is hoger dan 80%, en de lekkage is zeer laag, inferieur aan 1,5%Wanneer de nanocapsules worden opgeslagen op vier Graden Celsius. We hopen dat deze video u zou helpen bij de inkapseling van grote moleculen, zoals teri.
Overzicht
Deze studie demonstreert de bereiding van liposomale nanocapsules waarin het hydrofiele eiwit tarin is ingekapseld met behulp van een dunne lipidefilm-methode. De inkapseling is erop gericht de stabiliteit te verbeteren, de afgifte te controleren en de uitdagingen bij het bereiken van een hoge inkapselingsefficiëntie aan te pakken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Nanotechnologie
- Biotechnologie
- Farmaceutische wetenschappen
Achtergrond
- Liposomale nanocapsules worden gebruikt voor de toediening van geneesmiddelen.
- Inkapseling van eiwitten kan hun stabiliteit en biobeschikbaarheid verbeteren.
- De uitdagingen omvatten de selectie van lipiden en het behoud van de bioactiviteit.
- Dynamische lichtverstrooiing en scanning-elektronenmicroscopie zijn essentiële karakteriseringstechnieken.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het inkapselen van tarine in liposomale nanocapsules.
- Het verbeteren van de stabiliteit en de gecontroleerde afgifte van hydrofiele eiwitten.
- Het bieden van een protocol dat ingaat op veelvoorkomende uitdagingen bij de preparatie van liposomen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van liposomen met behulp van een extrusietechniek.
- Karakterisering via dynamische lichtverstrooiing en scanning-elektronenmicroscopie.
- Bepaling van de inkapselingsefficiëntie volgens het protocol van Peterson.
- Ultracentrifugatie voor het scheiden van liposomen van niet-ingekapselde eiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Een succesvolle inkapseling van tarine is bereikt.
- Karakterisering bevestigde de grootte en stabiliteit van de liposomen.
- De methode vertoonde een hoge inkapselingsefficiëntie.
- Uitdagingen bij de selectie van lipiden zijn effectief aangepakt.
Conclusies
- De methode van de dunne lipidefilm is effectief voor het bereiden van liposomale nanocapsules.
- Inkapseling van hydrofiele eiwitten kan hun therapeutische potentieel verhogen.
- Dit protocol kan worden aangepast voor andere hydrofobe moleculen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
De inkapseling van hydrofiele eiwitten in nanoliposomen pakt belangrijke uitdagingen aan bij de toediening van biologische geneesmiddelen, waaronder stabiliteit, biologische beschikbaarheid en gecontroleerde afgifte. Deze methode ondersteunt vroege targetvalidatie door een reproduceerbare formulering van complexe biomoleculen voor functionele assays mogelijk te maken. De hoge inkapselingsefficiëntie en de lage lekkagesnelheid vergroten de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische ontwikkelingspipelines.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om eiwitfuncties te onderzoeken in een beschermde, biomimetische omgeving om doelmechanismen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde nanovesikels voor consistente assaycondities over verschillende onderzoeksteams heen.
- Voorspellende waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de bioactiviteit van eiwitten tijdens inkapseling en opslag te behouden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert uniforme nanovestikels (gem. 155 nm, PDI 0,168) die geschikt zijn voor high-throughput screeningsplatformen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door extrusie- en ultracentrifugatiestappen die batchvariabiliteit minimaliseren.
- Klaar voor assay: Faciliteert de preparatie van stabiele ligand-receptor interactiesystemen met behulp van ingesloten globulaire eiwitten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Ondersteunt de progressie van ontdekking naar preklinisch onderzoek door de structurele integriteit van tetramere eiwitten te behouden.
- Risicobeperking: Een lage lekkagesnelheid (<1.5% bij 4°C) maakt betrouwbare farmacokinetische modellering en biodistributiemodellering mogelijk.
- Formuleringsbrug: Biedt een schaalbaar nanodragerplatform dat aanpasbaar is voor andere hydrofiele biologics.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-optimalisatie tot preklinische formulering, in het bijzonder voor hydrofiele eiwitten die stabilisatie vereisen.
- Discovery Biology: Maakt functionele tests van ingekapselde lectinen en globulaire eiwitten mogelijk in studies naar pathway-elucidatie.
- Screening: Levert monodisperse nanoliposomen die geschikt zijn voor fluorescentiegebaseerde assays of bindingsassays waarbij een uniforme partikelgrootte vereist is.
- Analytics: Maakt gebruik van dynamic light scattering voor de kwantitatieve grootteverdeling en encapsulatie-efficiëntie via het protocol van Peterson voor nauwkeurige kwantificering.
- Translational Research: Behoudt de integriteit van eiwitten door milde extrusie en koude bewaring, ter ondersteuning van preklinische modellen die zijn afgestemd op biomarkers.
- Enterprise Reuse: Stelt een reproduceerbare SOP vast voor liposomale encapsulatie die toepasbaar is op meerdere eiwitdoelen en projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Een hoge inkapselingsefficiëntie (83%) en minimale lekkage verbeteren de betrouwbaarheid van de gegevens bij studies naar target engagement.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde hydratatie van lipidfilms en extrusie maken schaalbare, GMP-aanpasbare productie mogelijk.
- Strategische waarde: Vermindert uitval door formulatie-uitdagingen in een vroeg stadium van de discovery-pipeline te minimaliseren.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van proteïnekandidaten mogelijk op basis van ontwikkelbaarheid en de haalbaarheid van de formulering.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in technieken voor lipidhandling, sonicatie, extrusie en ultracentrifugatie.
- Afhankelijk van toegang tot een rotatieverdamper, extruder met polycarbonaatmembranen, DLS, SEM en ultracentrifuge.
- Vereist cross-team standaardisatie van lipidverhoudingen, hydratatiebuffers en extrusiecycli voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassing aan andere modellen vereist optimalisatie van de lipidcompositie en de concentratie van de eiwitbelading.
- Praktische beperkingen omvatten potentiële lipid-eiwitinteracties en de noodzaak van analyse in triplicaat om de nauwkeurigheid van de kwantificering te waarborgen.
