Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry
19 februari 2020
Dit artikel introduceert monsterbereidingsmethoden voor een unieke real-time analytische methode op basis van de omgevingsmassaspectrometrie. Deze methode stelt ons in staat om real-time analyses uit te voeren van de biologische moleculen in vivo zonder speciale voorbehandelingen.
Dit is dus unieke omgevingsmassaspectrometrie, bijzonder geschikt voor het analyseren van biologische monsters, zowel in vitro als in vivo. Aangezien dit niet regelmatig een speciale voorbehandeling van monsters vereist, zoals celsordening, fractionering en concentratie, kan het een monster analyseren met minimaal verlies van biologische componenten, vooral die welke als zeer kleine hoeveelheid bestaan. Deze techniek stelt u in staat om de grondstoffen direct te analyseren in een minuut door massaspectrometrie.
Snelheid is niethinderend in robuustheid van het systeem, belangrijkste voordelen die inherent zijn aan deze techniek. Het enige wat je hoeft te doen is om gewoon voor te bereiden silica, 10 milligram weefsels monster, en 10 microliter van vermenigvuldigen. En stop ze in wegwerpcartridge.
Het is ingesteld op de PESI-MS machine, en je krijgt het resultaat in een paar minuten. Door de juiste massaspectrometer te kiezen, u de moleculaire identiteit annoteren. Om te beginnen haalt u het lever- of nierweefsel uit de vriezer.
Op een kurkplaat, snijd het weefsel monster tot een ongeveer twee bij twee bij twee millimeter met behulp van een scalpel of mes. U het monster ook met de Trepan eruit slaan en de lengte van de kolom tot twee millimeter bijsnijden. Als het weefsel is besmet met bloed, was kort met ijskoude fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
Plaats ongeveer 10 milligram van de snede of geponst monster in een plastic microbuis en voeg 100 microliter van 50% ethanol. Gebruik een micropestle om het monster te homogeniseren. Plaats vervolgens met de pipetman 10 microliter van het homogenaat in de put van de cartridge van de massaspectrometer.
Plaats de cartridge in de ionisatiekamer van de Direct Probe Ionisatie Mass Spectrometer en installeer de roestvrije steel naald sonde die zal worden gebruikt voor de monster ionisatie. Sluit het deksel van de kamer stevig om de veiligheidsinrichting automatisch te activeren. Start de boordcomputer door op het startpictogram te klikken om te analyseren, met behulp van de panelen op het scherm, een spanning van 2,3 kilovolt op de naald aan te brengen om de elektrospray te genereren en ervoor te zorgen dat de frequentie van de naald drie hertz is.
Wacht 30 seconden tot de meting is voltooid. Gooi na het meten van elk monster de patroon en de naald in een biohazard disposeer. Om de massaspectra te analyseren, opent u de software die is gekoppeld aan de massaspectrometer.
Klik op het L-C-D-bestand in het browservenster van het gegevensbestand van de software. U kiest voor een enkele piek van het massaspectrumvenster en geeft automatisch een E-I-C weer. Controleer de T-I-C en E-I-C en klik op het gemiddelde spectrumpictogram om het tijdsvenster voor het genereren van het massaspectrum te selecteren.
Exporteer de massaspectrale tekstgegevens. Om lichaamsvloeistoffen te analyseren, moet u tot 10 microliter van het serummonster opstellen en het in een microbuis van 1,5 milliliter afgeven. Voeg 190 microliter van 50% ethanol toe aan de buis en doe vervolgens twee minuten vortex bij kamertemperatuur.
Om alle rode bloedcellen te elimineren, centrifugeren de vloeistof op 15,000 keer G gedurende een tot vijf minuten bij vier graden Celsius. Breng 10 microliter van het supernatant in de put van de cartridge en ga verder meten op de massaspectrometer zoals voorheen. Dit protocol toont monstervoorbereiding voor PESI-MS op vast monster, vloeibaar monster en levend dier.
Menselijke niercelcarcinoom vertoont karakteristieke pieken van neutrale lipiden. Er waren relatief sterke pieken in de spectra bij de massa-lading verhouding van 900 van menselijke niercelcarcinoma weefsel dat niet werden geïdentificeerd in het omringende niet-kankerweefsel. Deze pieken vertegenwoordigen voornamelijk triacyl glycerol.
Voorbeeld van gegevens die zijn verkregen in normale leverweefsels, afgebeeld de neoplastische laesie van een patiënt met chronische hepatitis en levercirrose. Menselijk serum van drie individuen werd geanalyseerd met behulp van PESI-MS, er waren duidelijke verschillen in de spectrale patronen tussen de individuen. Voor de metabolische veranderingen in 5-FdU geïnjecteerd intraveneously in het staartvat van een muis, zeer snelle en gevoelige detectie van 5-FdU met natrium adduct werd bereikt in de lever in situ.
Als de diepte van de naald tip van de site van het weefsel, speelt de belangrijkste rol in ionisatie die de succesvolle gegevensverwerving leest, zorg ervoor dat de instructies te volgen. Je de moleculaire soorten identificeren door in de commerciële database te kijken. Dit is een manier om het moleculaire mechanisme van de ziekte te kwalificeren.
Veel onderzoekers zijn geïnteresseerd geraakt in de toepassing van deze techniek voor het voorspellen van de welvaart van de ziekte en het is prognose. Vooral met behulp van Ricket biopsie. Zorg ervoor dat je niet geprikt wordt door de sondenaald.
Dit kan eenvoudig worden vermeden met een specifiek instrument voor het verwijderen van de naald uit de machine.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel introduceert een unieke methode voor ambient massaspectrometrie voor real-time analyse van biologische monsters in vivo. Deze techniek maakt analyse van ruw weefselmateriaal mogelijk zonder speciale voorbehandelingen, waardoor het verlies van biologische componenten wordt geminimaliseerd.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Massaspectrometrie
- Biologische Analyse
- Analytische Chemie
Achtergrond
- Omgevingsmassaspectrometrie is geschikt voor zowel in vitro als in vivo analyse.
- De methode vereist geen uitgebreide voorbehandeling van de monsters.
- Het maakt de analyse van monsters mogelijk met minimaal verlies van biologische componenten.
- Snelle analyse is een belangrijk voordeel van deze techniek.
Doel van de studie
- Om een methode te presenteren voor real-time analyse van biologische moleculen.
- Om de efficiëntie van het analyseren van ruwe weefselmaterialen aan te tonen.
- Om de voordelen van het gebruik van ambient massaspectrometrie te belichten.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van silica- en weefselmonsters.
- Gebruik van wegwerpcartridges voor monsteranalyse.
- Directe analyse van biologische monsters via massaspectrometrie.
- Snelle verwerking van monsters binnen één minuut.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een snelle analyse mogelijk zonder significant verlies van componenten.
- Het is effectief voor het analyseren van monsters met zeer kleine hoeveelheden biologisch materiaal.
- Het demonstreert robuustheid en betrouwbaarheid bij real-time analyse.
- Het faciliteert de studie van biologische moleculen in hun natuurlijke toestand.
Conclusies
- Ambient massaspectrometrie is een waardevolle tool voor biologische analyse.
- De techniek bevordert het begrip van biologische processen.
- Het biedt een snelle en efficiënte methode voor real-time analyse.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Probe electrospray ionisatie massaspectrometrie (PESI-MS) maakt real-time moleculaire analyse van biologische monsters mogelijk met minimale voorbehandeling, wat snelle targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. De techniek vereist slechts 10 mg weefsel of 10 µL serum, waardoor het geschikt is voor preklinische monsters met een laag volume en het verlies van biologische componenten wordt verminderd. Deze mogelijkheid verhoogt het voorspellend vertrouwen bij lead-identificatie door directe in situ data over metabolieten en drugdynamiek uit levende systemen te leveren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door neutrale lipiden en metabolieten direct te detecteren uit vaste weefsels, zoals niercelcarcinoom.
- Operationele waarde: Vereist minimale monsterpreparatie—slechts homogenisatie van weefsel in 50% ethanol—waardoor de complexiteit en variabiliteit van de workflow worden verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de kwalificatie van moleculaire mechanismen via matching met commerciële databases, wat helpt bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe analyse van menselijk bloedserum mogelijk na eenvoudige ethanolprecipitatie en centrifugatie, wat screening op biomarkers in vloeistoffen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van wegwerpcartridges en probes van roestvrij staal, wat standaardisatie waarborgt en het risico op kruiscontaminatie vermindert.
- Schaalbaarheid: Faciliteert een snelle doorlooptijd van monsters — resultaten binnen enkele minuten — wat de gereedheid voor high-throughput screening ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt real-time tracking van de dynamiek van metabolieten of geneesmiddelen in specifieke organen van levende dieren mogelijk, zoals de detectie van 5-FdU in de lever van muizen.
- Mechanistische risicoreductie: Levert in situ moleculaire gegevens zonder weefselvernietiging, waardoor de fysiologische context behouden blijft voor een betere translatie van preklinische naar klinische resultaten.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Detecteert met ziekten geassocieerde spectrale patronen (bijv. neoplastische laesies in een cirrotische lever) om go/no-go-beslissingen te onderbouwen.
Integratie van pipeline en workflow
PESI-MS past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege biologie tot leadidentificatie en biedt snelle, kwantitatieve moleculaire read-outs die hypothesetesten en assay-gereedheid ondersteunen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door weefselspecifieke moleculaire signaturen (bijv. triacylglycerol in carcinoom) te detecteren zonder fractionering.
- Screening: Maakt analyse van assay-klare vloeistoffen en weefsels mogelijk via gestandaardiseerde monsterintroductie op basis van cartridges.
- Analytica: Genereert massaspectrale gegevens (m/z-pieken, EIC, TIC) voor kwantitatieve vergelijking tussen condities en individuen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie door drugmetabolieten in vivo te monitoren, zoals intraveneuze 5-FdU in de staartvin van muizen.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Maakt gebruik van herbruikbare hardware (probe, kamer) met wegwerpartikelen, wat standaardisatie over verschillende projecten heen mogelijk maakt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door directe moleculaire gegevens uit intacte biologische systemen te leveren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde monstervoorbereiding (10 mg weefsel, 10 µL serum, 50% ethanol) en vaste instellingen voor spanning/frequentie (2,3 kV, 3 Hz).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door snelle detectie van metabolieten/geneesmiddelen in ziektemodellen mogelijk te maken.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering via detectie van ziektespecifieke pieken (bijv. m/z 900 bij carcinoom) die afwezig zijn in controles.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het bedienen van een massaspectrometer, inclusief de bereiding van oplosmiddelen (50% ethanol) en het gebruik van een centrifuge voor serumverwerking.
- Vereist een massaspectrometer met directe probe-ionisatie, voorzien van een compatibel cartridgesysteem en een roestvrijstalen naaldprobe.
- Vereist standaardisatie van monsterbehandeling tussen teams—waaronder weefselsnijden, homogenisatie en overdracht van het supernatant—om dataconsistentie te waarborgen.
- Houd rekening met de diepte van de naaldpunt als een kritische variabele die de ionisatie-efficiëntie en datakwaliteit bij in vivo toepassingen beïnvloedt.
- Beperkt tot monsters die compatibel zijn met ambientale ionisatie; matrixeffecten kunnen optimalisatie vereisen voor complexe biovloeistoffen.
