Name: De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer de detectie van 5-hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en muizenhersenen via immunofluorescentie en DNA dot-blot. Deze methode onthult 5hmC-dynamiek tijdens neuronale differentiatie en epigenetische regulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

XL werd deels gesteund door de nationale sleutel R & D-programma van China (2017YFE0196600), en de National Natural Science Foundation of China (Grant NOS. 31771395, 31571518). Q.S. werd gesteund door de National Key Research and Development Program van China (2017YFC1001703) en de belangrijkste onderzoeks-en ontwikkelingsprogramma van de provincie Zhejiang (2017C03009). W.X. werd gesteund door de Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY18H020002) en Science Technology Department van de provincie Zhejiang (2017C37057).

Alle dier procedures zijn goedgekeurd door het Dierenethische Comité van de Zhejiang University.
1. de cultuur van volwassen neurale stamcellen en neuronen
<ol><li>Isoleer volwassen neurale stamcellen uit het voor brein van een volwassene (8-10 week oud) C57/BL6 mannelijke muis zoals eerder beschreven31,32.</li>
	<li>Cultuur volwassen neurale stamcellen in DMEM/F-12 medium bevattende 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 supplement, 1% antibioticum-antimycotic, en 2 mM L-glutamine in een 5% CO2 incubator bij 37 °c. Induceren van de differentiatie van volwassen neurale stamcellen met 1 μm retinoïnezuur en 5 μm Forskolin voor 48 h zoals eerder beschreven31,32.</li>
	<li>Isoleer neuronen van de embryonale dag 17 (E17) hippocampi van de muis en cultuur met neurobasal medium bevattende 0,25% L-glutamine, 0,125% GlutaMax en 2% B27 supplement in een 5% CO2 incubator bij 37 °c zoals eerder beschreven33.</li>
</ol>2. transcardial perfusie van de muis
<ol><li>Bereid een dag voor het experiment 10% chloraalhydraat, 4% Paraformaldehyde (PFA) en fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Anesthetiseer een volwassen mannelijk of vrouwelijk C57 BL/6J muis met 10% Chloraalhydraat (50 mg/kg, i.p.), en zorg ervoor dat het dier diep verdoerd is door het controleren van de lichaams reactie. Bevestig elke ledemaat met plakband op een plastic bord (in een face-up positie).</li>
	<li>Snijd de huid en dan de spier met chirurgie schaar. Open de thoracische holte met een chirurgische schaar. Stel het hart bloot en knip een klein deel van het rechter Atrium af met een fijne chirurgische schaar.</li>
	<li>Parfuseer de muis met een 10 mL wegwerpbare, gesteriliseerde spuit van de linker ventrikel met koude PBS (ongeveer 30 mL per volwassen muis).</li>
	<li>Parfumeer de muis met 4% PFA (ongeveer 30 mL in 10 minuten per volwassen muizen) totdat het stijf is.</li>
	<li>Open de schedel van de muis met bot Tang. Verwijder de hersenen en breng in 5 mL van 4% PFA in een centrifugebuis van 15 mL voor na fixatie bij 4 °C. Opmerking: Reinig het chirurgische gebied nadat de operatie is voltooid.</li>
	<li>Ten minste 24 uur later, breng de hersen monsters over in een 30% sucrose-oplossing voor volledige uitdroging bij 4 °C.</li>
</ol>3. Brain snijden
<ol><li>Insluiten van de hersenen monsters in optimale snijtemperatuur Compound (OCT) in een kleine container, en afkoelen bij-20 °C gedurende ten minste 1 uur.</li>
	<li>Sectie hersenen monsters met een dikte van 20-40 μm met een cryostaat microtoom.</li>
	<li>Verzamel secties in PBS en bewaar deze bij 4 °C.</li>
</ol>4. immunofluorescentie kleuring
<ol><li>Pak de secties met de beoogde hersengebieden en zet ze in een 24-put plaat met PBS. Voor gekweekte cellen op een dekslip, ga direct naar stap 4,2.</li>
	<li>Wassen met PBS op de shaker bij kamertemperatuur 10 min. Herhaal dit twee keer.</li>
	<li>Verwijder PBS en behandel met voorverwarmde 1 M HCl gedurende 30 minuten bij 37 °C. Opmerking: Bereid 1 M HCl voor met toevoeging van 1 mL zoutzuur (36-38%) in 10 mL water in een chemische afzuigkap. Verwarm 1 M HCl in de incubator bij 37 °C.</li>
	<li>Was de monsters met PBS gedurende 5 min. Herhaal dit twee keer.</li>
	<li>Blok monsters met PBS met 3% normaal geiten serum en 0,1% Triton X-100 voor 1 uur op de shaker bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incuberen delen met specifieke primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C op de shaker. Opmerking: Gebruik de volgende primaire antilichamen: polyklonale konijn-antilichamen anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000), monoklonaal antilichaam anti-NeuN van de muis (1:500).</li>
	<li>Neem de monsters, en verder inbroed bij kamertemperatuur 1 uur.</li>
	<li>Was de monsters met PBS gedurende 10 min. Herhaal dit twee keer.</li>
	<li>Inincuberen met secundaire antilichamen overeenkomend met de primaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op de shaker. Bedek de plaat met aluminium. Opmerking: Gebruik de volgende secundaire antilichamen: Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG (1:500), Alexa Fluor 568 geit anti-muis IgG (1:500). Contrits-kernen met 4 ′ -6-diamidino-2-fenylindole (DAPI).</li>
	<li>Was de monsters met PBS gedurende 10 minuten op de shaker. Herhaal dit twee keer.</li>
	<li>Monteer de hersen secties op de dia's, voeg de juiste hoeveelheid anti fade-montage medium (rond 100-150 μL) toe en dek af met een hoogwaardig afdekglas. Zegel met nagellak.</li>
	<li>Neem beelden met een reguliere of confocale fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>5. genomische DNA-isolatie
<ol><li>Euthanize een volwassen C57 BL/6J muis (mannelijk of vrouwelijk) door cervicale dislocatie en verwijder de hersenen.</li>
	<li>Dissect de hippocampus, cortex en cerebellum weefsels op een ijsgekoelde schotel. Grind weefsels met een weefsel slijper in 1 mL DNA lysisbuffer en overdracht in een schone micro centrifugebuis. Voeg 250 μg proteïnase K toe per 600 μL lysisbuffer. Voor celpellets, voeg direct lysisbuffer, proteïnase K, en meng grondig. Opmerking: DNA-lysisbuffer voorbereiden: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl in 100 mM tris-HCl, pH 8,5. Was en autoclaaf de weefsel slijper voor het experiment.</li>
	<li>De tweede dag, voeg ongeveer 50 μg RNase A per monster voor ten minste 12 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg een gelijk volume fenol toe: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) en meng volledig.</li>
	<li>Centrifugeer bij 20.817 x g gedurende 15 minuten en verwijder het supernatant in een nieuwe microcentrifuge buis.</li>
	<li>Voeg 600 μL chloroform toe aan het supernatant om DNA te precipderen en meng grondig.</li>
	<li>Centrifugeer bij 20.817 x g gedurende 15 minuten en verwijder het supernatant in een andere nieuwe buis.</li>
	<li>Voeg 500 μL isopropanol toe aan het supernatant en meng grondig.</li>
	<li>Centrifugeer bij 20.817 x g gedurende 15 minuten en verwijder het supernatant volledig.</li>
	<li>Was de neerslag met 1 mL 70% ethanol, centrifugeer bij 20.817 x g gedurende 1 minuut en verwijder het supernatant volledig. Eenmaal herhalen.</li>
	<li>Droog de DNA-pellet volledig.</li>
	<li>Los DNA-pellet met tris-HCl-buffer (pH 8,5) op naar de juiste concentratie.</li>
</ol>6. DNA dot Blot
<ol><li>Bereid de oplossingen voor: 2 M NaOH, tris-HCl buffer (pH 8,5), 6x zoute Natriumcitraat (SSC).</li>
	<li>Maak het monster mengsel als tabel 1.</li>
	<li>Denature DNA monsters bij 100 °C gedurende 10 min, en afkoelen op ijs.</li>
	<li>Snijd de juiste maat van het nylon membraan (bijv. Hybond-N +) en spoel af met 6x SSC.</li>
	<li>Plaats het membraan op een dot-Blot-apparaat en maak verbinding met de vacuümpomp. Spot 6 μL mengsel per stip op het membraan.</li>
	<li>Hybridize gedurende 30 minuten bij 80 °C en Blokkeer het monster membraan met vetvrije melk in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 1 uur.</li>
	<li>Incuberen met primair antilichaam bij 4 °C 's nachts. Opmerking: het volgende primaire antilichaam: polyklonale konijn anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000).</li>
	<li>Op de tweede dag, incuberen de monster membranen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. was met TBS gedurende 10 min. Herhaal deze Wash twee keer meer.</li>
	<li>Inbroed het membraan met anti-konijn secundair antilichaam (1:5000) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen met TBS voor 10 min. Herhaal deze Wash twee keer meer.</li>
	<li>Visualiseer de chemiluminescentie signalen en kwantificeer signaal intensiteiten.</li>
</ol>

<ol><li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li>
<li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li>
<li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li>
<li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+active+DNA+demethylation%3A+mechanism%2C+function+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li>
<li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li>
<li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li>
<li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Geneticset%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li>
<li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li>
<li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer%27s+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li>
<li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+DNA+methylation%3A+mechanisms%2C+genomics%2C+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905(2013).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903(2017).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li>
<li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).</li>
<li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

Er bestaan geen concurrerende financiële belangen.

Epigenetische modificaties spelen essentiële rollen tijdens de ontwikkeling van de hersenen, rijping, en functie. Als een stabiele marker voor DNA-modificatie, reageert Dynamic 5-hmC op gedrags aanpassing, neuronale activiteit, en is positief gecorreleerd met genexpressie; Dus, het is betrokken bij de normale functie van de hersenen en neurologische aandoening4. Om zijn functie in cellen en weefsels te verkennen, is het noodzakelijk om het bestaan van 5-hmC te detecteren en het niveau voor en na d...

Epigenetische modificaties, waaronder DNA modificatie, Histon modificatie en RNA modificatie, is aangetoond dat het spelen van essentiële functies in diverse biologische processen en ziekten1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. voor een lange tijd, DNA-methylatie (dat wil zeggen, 5-methylcytosine (5-mC)) is gezien als een zeer stabiele epigenetische marker en kan niet verder worden gewijzigd in het genoom. Onlangs, het is gebleken dat 5-mC kan worden geoxideerd tot 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) door TET (ten-elf translocaties) familie-eiwitten, met inbegrip van TET1, TET2, en TET38,9. Verdere studies tonen aan dat 5-HMC kan dienen als een stabiele marker en spelen biologische rollen door het reguleren van genexpressie4,10,11,12.
De huidige bewijzen geven aan dat 5-HMC sterk is verrijkt in neuronale weefsels/cellen ten opzichte van andere soorten weefsels in zoogdieren, en vertoont dynamische kenmerken tijdens neuronale ontwikkeling13,14. In het neuronale systeem, 5-hmC gemedieerde epigenetische modificaties spelen een belangrijke rol bij het reguleren van neurale stamcellen, neuronale activiteit, leren en geheugen, en is betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen met inbegrip van Rett syndroom, autisme, Alzheimer ziekte, de ziekte van Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Er zijn verschillende benaderingen voor het opsporen van 5-HMC in cellen en weefsels14,21,22,23,24. Hier beschrijven we twee methoden om het bestaan van 5-hmC te detecteren en het wereldwijde niveau van 5-hmC te kwantificeren: immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot. Deze twee methoden zijn handig en gevoelig, en zijn met succes gebruikt in eerdere studies25,26,27,28,29,30. De belangrijkste stappen van deze twee methoden zijn DNA-denaturatie. Voor immunofluorescentie kleuring van 5-hmC is pre-behandeling van monsters met 1 M HCl vereist. Voor 5-hmC dot-Blot wordt DNA-denaturatie uitgevoerd met NaOH-oplossing. Deze twee methoden samen met de volgende generatie sequencing zijn zeer nuttig hulpmiddelen voor het onderzoeken van de functie van 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop software</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>anti-5-hydroxymethylcytosine</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat microtome</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Nylon membrane (Hybond&trade;-N+ )</td><td>Amersham Biosciences</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

de detectie van 5-hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

In het genoom van zoogdieren zijn meerdere DNA-modificaties geïdentificeerd. Van die, 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine-gemedieerde Epigenetische mechanismen zijn intensief bestudeerd. 5-hydroxymethylcytosine toont dynamische kenmerken tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling van de hersenen, speelt een regelgevende functie in genexpressie, en is betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen. Hier beschrijven we de gedetailleerde methoden, waaronder immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot om 5-hydroxymethylcytosine in gekweekte cellen en hersenweefsels van de muis te detecteren.

Om de verdeling van 5-hmC in de hippocampus van volwassen muizen te onthullen, hebben we immunofluorescentie uitgevoerd met antilichamen tegen neuronale cellen (NeuN) en 5-hmC. In de hippocampus, 5-hmC co-gelokaliseerd goed met neuronale cel marker NeuN (Figuur 1a-H), suggereren een verrijking van 5-HMC in neuronen.
Om de dynamiek van 5-hmC tijdens neuronale ontwikkeling te bepalen, werd eerst een dot-Blot uitgevoerd met DNA-monsters geïsoleerd va...

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels, met behulp van immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot-methoden.

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Hier presenteren we een protocol om 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels te detecteren met behulp van immunofluorescentie, de nieuwe methode en de DNA dot-vlek. 5-hydroxymethylcytosine, d.w.z. 5hmC, verzacht epigenetische modificatie, speelt belangrijke functie bij het reguleren van genexpressie en betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen.Eigenlijk kunnen onze methoden worden gebruikt om 5hmC in meerdere cellen en weefsels te detecteren. Het is handig en kan worden uitgevoerd met gemeenschappelijke apparatuur in het lab. Begin met het plaatsen van de muis gezicht omhoog op een plastic bord en de vaststelling van elke ledemaat met plakband.Gebruik chirurgische schaar te snijden door de huid en spieren, en open de borstholte. Bloot het hart en afgesneden een klein deel van het rechter atrium met fijne chirurgische schaar. Met behulp van een 10-milliliter wegwerp, gesteriliseerde spuit, doorsloop de muis uit de linker ventrikel met koude PBS.Vervolgens, doorsnede de muis met 4%PFA totdat het stijf is. Open vervolgens de schedel met bots tangen en verwijder de hersenen. Plaats de hersenen in een 15-milliliter centrifuge buis gevuld met vijf milliliter van 4%PFA en bewaar het op vier graden Celsius.Na 24 uur, breng de hersenen in een 30% sacharose oplossing en laat het op vier graden Celsius voor volledige uitdroging. Voorafgaand aan de sectie, ingebed de hersenen in optimale snijtemperatuur verbinding en afkoelen tot min 20 graden Celsius gedurende ten minste een uur. Sectie hersenmonsters met een dikte van 20 tot 40 micrometer met behulp van een cryostat microtome.Verzamel secties in PBS en bewaar op vier graden Celsius. Pak de hersendelen van belang en zet ze in een 24-well plaat met PBS. Was secties met PBS op een shaker gedurende 10 minuten.Verwijder de PBS en behandel met voorverwarmd eenkievel zoutzuur bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Zoutzuur is corrosief en bereid het alsjeblieft voor in het chemische ruim. Was vervolgens de monsters drie keer met PBS gedurende vijf minuten en blokkeer ze met PBS met 3% normaal geitenserum en 0,1% Triton X-100.Laat de monsters op een shaker op kamertemperatuur gedurende een uur. Voeg specifieke primaire antilichamen toe aan de secties en broed 's nachts bij vier graden Celsius op een shaker. De volgende dag, neem de monsters uit en laat ze op kamertemperatuur voor een uur.Was de monsters drie keer met PBS en voeg secundaire antilichamen toe. Bedek de plaat met aluminium en laat het op kamertemperatuur gedurende een uur tijdens het schudden. Na de incubatie, was de monsters drie keer met PBS en monteer ze op dia's.Voeg 100 tot 150 microliter anti-fade montagemedium toe, bedek met een premium cover glas en sluit af met nagellak. Beeld de hersensecties met een gewone of confocale microscoop. Om genomisch DNA te isoleren, begin met het ontleden van de hippocampus, cortex en cerebellumweefsels op een ijsgekoelde schotel.Voeg een milliliter DNA-lysebuffer toe en maal de weefsels. Breng het monster over in een schone microcentrifugebuis en voeg 250 microgram proteinase-K toe voor elke 600 microliter lysisbuffer. Voeg vervolgens ongeveer 50 microgram RNase A per monster toe en broed gedurende ten minste 12 uur bij 37 graden Celsius.Voeg na de incubatie een gelijk volume fenolchloroforme isoamylalcohol toe en meng grondig. Centrifuge het mengsel volgens manuscriptrichtingen en breng supernatant aan een nieuwe buis over. Voeg 600 microliters chloroform toe aan de supernatant, meng grondig en centrifuge volgens de handschriftaanwijzing.Breng de supernatant over naar een nieuwe buis en voeg 500 microliter isopropanol toe. Meng grondig en centrifuge opnieuw om het DNA neer te zetten. Na de centrifugatie, gooi de supernatant, en was de DNA-pellet met 70% ethanol volgens manuscript aanwijzingen.De lucht droogt de DNA-pellet volledig en los deze op in de Tris-HCl buffer. Bereid voorafgaand aan de start de vereiste oplossingen voor en monstermengsel volgens de hand van manuscriptaanwijzingen. Ontplaner het DNA-monster door het gedurende 10 minuten te verwarmen tot 100 graden Celsius en plaats het vervolgens op ijs.Snijd de juiste grootte van een nylon membraan en spoel het af met 6X SSC. Plaats het membraan op een dot-vlek apparaat en sluit de vacuümpomp. Spot zes microliter stippen op het membraan en verhybrial gedurende 30 minuten bij 80 graden Celsius.Blokkeer vervolgens het monstermembraan met vetvrije melk en tris-gebufferde zoutoplossing, of TBS, gedurende een uur. Voeg het polyklonale konijn anti-5-hydroxymethylcytosin antilichaam toe aan het membraan en incubbate 's nachts bij vier graden Celsius. De volgende dag, laat het monster membraan op kamertemperatuur voor een uur, dan was het membraan drie keer met TBS.Het membraan 30 minuten uitbroeden met het anti-konijn secundaire antilichaam en vervolgens drie keer wassen met TBS. Visualiseer de chemiluminescentiesignalen en kwantificeer de intensiteit ervan. Dit protocol kan worden gebruikt om 5-hydroxymethylcytosine, of 5hmC, te visualiseren in de hippocampus van volwassen muizen.Immunofluorescentie met antilichamen tegen neuronale cellen, de 5hmC blijkt dat er een verrijking van 5hmC in neuronen. Dynamiek van 5hmC tijdens de neuronale ontwikkeling kan worden bepaald met een dot-blot test van DNA-monsters geïsoleerd van zich vermenigvuldigen en gedifferentieerde volwassen neurale stamcellen. Globale niveaus van 5hmC aanzienlijk toenemen tijdens differentiatie en het niveau van 5hmC in neuronen is hoger dan in neurale stamcellen.De belangrijkste stap van deze methode is om ervoor te zorgen dat volledige denaturatie van DNA-monsters.

the-detection-5-hydroxymethylcytosine-neural-stem-cells-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit kan gebruikt worden om te analyseren en te kwantificeren 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een spe cifieke locus. De kit onderscheidt vijf-mC van 5-HMC door de toevoeging van glucose aan de hydroxylgroep van 5-HMC via een enzymatische reactie gebruik te maken van β-glucosyltransferase (T4-BGT). Bij het 5-HMC vindt plaats in het kader van CCGG, deze wijziging zet een splitsbare MspI site om een ​​niet-splitsbare site.

Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel

Beschreven is een twee stappen proces labeling met β-glucosyltransferase (β-GT) een azide-glucose dragen aan 5-HMC, gevolgd door een klik chemie biotine linker gemakkelijk en dichtheid onafhankelijk verrijking brengen. Deze efficiënte en specifieke etiketteringsvoorschriften methode maakt het mogelijk verrijking van 5-HMC met extreem lage achtergrond en high-throughput epigenomisch mapping vinden plaats via next-generation sequencing.

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Toediening van twee analogen van thymidine, Edu en BrdU, bij zwangere muizen maakt de analyse van de celcyclus en in neurale voorlopercellen in de embryonale hersenen van muizen. Deze werkwijze is nuttig om de effecten van genotoxische stress, zoals ioniserende straling, tijdens de hersenontwikkeling bepalen.

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Hier beschrijven we een gevoelige immunochemische methode voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten op basis van het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking.

Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie

Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Het doel van dit verslag is om te beschrijven van het protocol voor robuuste immunohistochemische detectie van epigenetische markers, 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) bij de ontwikkeling en postmitotic muis netvlies.

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

De methylated RNA immunoprecipitation assay is een antilichaamgebaseerde methode die wordt gebruikt om te verrijken voor gemethyleerde RNA-fragmenten. In combinatie met diepe sequencing leidt het tot de identificatie van transcripties met de m5C-wijziging.

Gemethyleerde RNA ImmunoprecipatieTest voor studie m5C Modificatie in Arabidopsis

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo's.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Leer de detectie van 5-hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en muizenhersenen via immunofluorescentie en DNA dot-blot. Deze methode onthult 5hmC-dynamiek tijdens neuronale differentiatie en epigenetische regulatie.

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

Meer video's verkennen