Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish
28 januari 2020
Genbewerkingstechnologieën hebben onderzoekers in staat gesteld om zebravissen mutanten te genereren om de genfunctie relatief eenvoudig te onderzoeken. Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van parallelle embryogenotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen bij zebravissen. Deze onbevooroordeelde aanpak zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in fenotypische analyses op basis van in situ hybridisatie.
De gevolgen van mutaties op genexpressie worden vaak kwalitatief beoordeeld door in situ hybridisatie en over het algemeen visueel gescoord, wat subjectief is en bevooroordeeld is door de verwachtingen van de onderzoeker. Deze methode biedt een meer consistente manier om in situ experimenten te vergelijken door beeldintensiteiten te kwantificeren en verwijdert die bias. Dit kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere modelsystemen die in situ hybridisatie gebruiken als lezer van een genexpressie.
Begin met het beeldvorming van de in situ hybridisatie-of ISH-bevlekte embryo's. Bereid een glyceroloplossing voor en meng deze om te homogeniseren. Breng de embryo's met een Pasteur pipet van drie milliliter naar de glyceroloplossing en laat ze minstens vijf minuten rusten.
Bereid en label voldoende PCR-buizen om de ISH-glas-in-loodbryo's na beeldvorming over te brengen en gebruik vervolgens een Pasteurpipet van drie milliliter om 100% glycerol aan de onderkant van de put van een glazen depressieschuif toe te voegen. Breng een enkel ISH-gebrandschilderd embryo over naar de glazen schuif en oriënteer het onder een stereomicroscoop die is uitgerust met een digitale camera en vloer- en bovenverlichting. Pas met het eerste embryo de verlichtings- en belichtingstijd aan bij de gewenste vergroting.
Beeld zoveel embryo's als nodig is en label elke afbeelding met een uniek nummer. Breng na beeldvorming elk embryo over naar een PCR-buis met hetzelfde nummer en desnoods de overtollige glycerol uit de PCR-buizen. Om het DNA te extraheren, voeg 40 tot 75 microliter van een alkalische lyse buffer zoals HoTSHOT aan elke buis.
Incubeer de buizen op 95 graden Celsius gedurende ongeveer 30 minuten en vervolgens afkoelen tot vier graden Celsius. Voeg een gelijk volume van neutralisatie buffer en ga verder met genotyperen voor de mutatie van belang. Als u afbeeldingsanalyse wilt uitvoeren, selecteert en opent u de afbeelding in Fiji en keert u deze om door op Bewerken te klikken en vervolgens om te keren en converteert u het afbeeldingstype naar 8-bits door op het tabblad Afbeelding te klikken, Tekst te selecteren en 8-bits te selecteren.
Selecteer het gereedschap veelhoek en teken handmatig het gebied van belang of ROI op de afbeelding rond het gebied dat het ISH-signaal bevat dat moet worden gemeten. Druk op T om de ROI Manager te openen en selecteer de regio van belang en klik vervolgens op Meten. Kopieer de gemiddelde waarde van het venster Resultaten naar een spreadsheet.
Als u de achtergrondintensiteit wilt meten, verplaatst u de ROI naar een gebied in het embryo zonder kleuring en klikt u op Toevoegen in de ROI-manager. Selecteer het achtergrondgebied en klik op Meten en nota vervolgens de gemiddelde intensiteitswaarde in de spreadsheet. Verkrijg de gemiddelde pixelintensiteit van het NC2-hybridisatiesignaal door de gemiddelde intensiteit van de achtergrond af te trekken van die van het gekleurde gebied.
Nadat u de gemiddelde pixelintensiteit van elk monster hebt bepaald, wijst u aan elk monster een genotype toe. Als het genotype niet kan worden bepaald, sluit u het monster uit van een latere analyse. Sorteer de gemiddelde monsterintensiteitswaarden op basis van genotype en ga verder met statistische tests.
Het nut van deze techniek is aangetoond op ISH voor dnmt3bb. 1 in embryo's van een runx1 heterozygoot incross. Een daling van dnmt3bb.
1 expressie werd gedetecteerd in runx1 homozygoot mutanten, terwijl heterozygoot embryo's geen significante verschillen vertoonden in dnmt3bb. 1 uitdrukking. Bij een poging om het effect van lmo4 mutatie op runx1 expressie te bepalen, liet deze analyse geen significante verschillen in expressie zien tussen wilde type en homozygoot lmo4 mutanten.
Echter, een kleine daling van runx1 expressie werd gedetecteerd door single embryo qPCR. In ongeveer 0,4% van de runx1-gesonde embryo's, de ISH had een hoge achtergrond die resulteerde in een negatief aantal toen het werd afgetrokken van het signaal. In dergelijke gevallen werden de embryo's uitgesloten van analyse.
Vier verschillende regio's op de embryo's zijn getest om achtergrondcorrecties te optimaliseren. Hoewel er een relatief stabiel verschil in intensiteit van de ROI in een van de achtergrondgebieden, R3 toonde altijd een hogere intensiteit dan de ROI en mag niet worden gebruikt voor achtergrondcorrectie. R1 en R4 bleken de meest geschikte gebieden voor achtergrondcorrectie.
Het is belangrijk om de beste omstandigheden voor de beeldvorming te vinden en ze ongewijzigd te houden tijdens het experiment. We raden ook aan om de pixelintensiteit te kwantificeren voordat we aan elk monster een genotype toewijzen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor parallelle embryonale genotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen in zebravissen. Door gebruik te maken van deze onbevooroordeelde benadering kunnen onderzoekers een grotere nauwkeurigheid in fenotypische analyses bereiken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Genbewerkingstechnologieën vergemakkelijken de generatie van zebravismutanten.
- In situ hybridisatie is een gangbare methode voor het beoordelen van genexpressie.
- Traditionele scoringsmethoden kunnen bias en subjectiviteit introduceren.
- Deze studie beoogt een consistentere en kwantitatieve aanpak te bieden.
Doel van de studie
- Om de nauwkeurigheid van fenotypische analyses bij zebravissen te verbeteren.
- Om een gestandaardiseerde methode te bieden voor het genotyperen van embryo's.
- Om in situ hybridisatiesignalen objectief te kwantificeren.
Gebruikte methoden
- Het afbeelden van ISH-gekleurde embryo's met een stereomicroscoop.
- Het bereiden van glyceroloplossingen voor embryo-overdracht.
- Het gebruik van alkalische lysisbuffer voor DNA-extractie.
- Het gebruik van Fiji-software voor beeldanalyse en kwantificering.
Belangrijkste resultaten
- Een afname in de expressie van dnmt3bb.1 aangetoond bij runx1 homozygote mutanten.
- Geschikte gebieden voor achtergrondcorrectie geïdentificeerd voor beeldanalyse.
- Geen significante verschillen in expressie aangetoond tussen wildtype en lmo4 homozygote mutanten.
- Een betrouwbare methode geleverd voor het toewijzen van genotypen op basis van pixelintensiteit.
Conclusies
- De methode verhoogt de betrouwbaarheid van de genexpressieanalyse.
- Het kan worden aangepast voor gebruik in andere modelsystemen.
- Het handhaven van consistente beeldvormingscondities is essentieel voor nauwkeurige resultaten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Kwantitatieve in situ hybridisatie-analyse vermindert de subjectiviteit bij de beoordeling van genexpressie, waardoor de betrouwbaarheid van gegevens voor doelwitvalidatie in zebravismodellen wordt verbeterd. Deze benadering ondersteunt mechanistische risicoreductie door een onbevooroordeelde correlatie tussen genotype en fenotypische expressiepatronen mogelijk te maken. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door gestandaardiseerde, reproduceerbare metingen over monsters met gemengde genotypen te leveren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door onbevooroordeelde kwantificering van ruimtelijk beperkte genexpressiesignalen.
- Operationele waarde: Biedt een consistente workflow voor het vergelijken van mutant- en wild-typefenotypen zonder waarnemingsbias.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door significante expressieveranderingen te onderscheiden van achtergrondruis in genetische modellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door baseline-expressieprofielen vast te stellen.
- Reproduceerbaarheid: Standaardiseert protocollen voor beeldacquisitie en -analyse om variabiliteit tussen experimenten te minimaliseren.
- Kwantitatieve output: Genereert meetbare pixelintensiteitsgegevens die geschikt zijn voor statistische vergelijking tussen behandelingsgroepen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Handhaaft consistentie van ontdekking tot preklinische validatie door het gebruik van objectieve fenotypische read-outs.
- Afstemming van Biomarkers: Faciliteert de correlatie van veranderingen in genexpressie met de genotypische status voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Risicogebaseerde Besluitvorming: Maakt datagestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door het aantal fout-positieven in targetvalidatiestudies te verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door genotypische bevestiging te koppelen aan kwantitatieve fenotypische beoordeling, wat de identificatie van lead-verbindingen ondersteunt via mechanische risicoreductie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door kwantitatieve mRNA-distributiegegevens te leveren om genfuncties in ontwikkelingspaden te verduidelijken.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via reproduceerbare beeldvormings- en analysecondities voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Levert kwantitatieve intensiteitsmetingen en waarden gecorrigeerd voor achtergrondruis, waardoor statistische vergelijking van experimentele condities mogelijk wordt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingsresultaten met preklinische continuïteit door een consistente fenotypische scoring over verschillende modelsystemen te waarborgen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor genotypering en kwantificering dat toepasbaar is op meerdere genen en mutantlijnen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in genexpressiedata te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor embryo-handling en beeldanalyse.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door objectieve gegevens te leveren voor kapitaalallocatie in programma's in vroege fasen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door echte biologische effecten te onderscheiden van technische variabiliteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met zebravissenembryo's, microscopie en basisgenotyperingstechnieken.
- Afhankelijk van stereomicroscopie met digitale beeldbewerkingsmogelijkheden en Fiji-software voor analyse.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de beeldcondities, belichtingstijden en regio's voor achtergrondcorrectie.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende zebravissenstammen en ontwikkelingsstadia.
- Bevat praktische beperkingen zoals de optimalisatie van achtergrondcorrectie en de uitsluiting van monsters met onbepaalde genotypen of hoge achtergrondruis.
