Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish
January 28th, 2020
Genbewerkingstechnologieën hebben onderzoekers in staat gesteld om zebravissen mutanten te genereren om de genfunctie relatief eenvoudig te onderzoeken. Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van parallelle embryogenotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen bij zebravissen. Deze onbevooroordeelde aanpak zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in fenotypische analyses op basis van in situ hybridisatie.
De gevolgen van mutaties op genexpressie worden vaak kwalitatief beoordeeld door in situ hybridisatie en over het algemeen visueel gescoord, wat subjectief is en bevooroordeeld is door de verwachtingen van de onderzoeker. Deze methode biedt een meer consistente manier om in situ experimenten te vergelijken door beeldintensiteiten te kwantificeren en verwijdert die bias. Dit kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere modelsystemen die in situ hybridisatie gebruiken als lezer van een genexpressie.
Begin met het beeldvorming van de in situ hybridisatie-of ISH-bevlekte embryo's. Bereid een glyceroloplossing voor en meng deze om te homogeniseren. Breng de embryo's met een Pasteur pipet van drie milliliter naar de glyceroloplossing en laat ze minstens vijf minuten rusten.
Bereid en label voldoende PCR-buizen om de ISH-glas-in-loodbryo's na beeldvorming over te brengen en gebruik vervolgens een Pasteurpipet van drie milliliter om 100% glycerol aan de onderkant van de put van een glazen depressieschuif toe te voegen. Breng een enkel ISH-gebrandschilderd embryo over naar de glazen schuif en oriënteer het onder een stereomicroscoop die is uitgerust met een digitale camera en vloer- en bovenverlichting. Pas met het eerste embryo de verlichtings- en belichtingstijd aan bij de gewenste vergroting.
Beeld zoveel embryo's als nodig is en label elke afbeelding met een uniek nummer. Breng na beeldvorming elk embryo over naar een PCR-buis met hetzelfde nummer en desnoods de overtollige glycerol uit de PCR-buizen. Om het DNA te extraheren, voeg 40 tot 75 microliter van een alkalische lyse buffer zoals HoTSHOT aan elke buis.
Incubeer de buizen op 95 graden Celsius gedurende ongeveer 30 minuten en vervolgens afkoelen tot vier graden Celsius. Voeg een gelijk volume van neutralisatie buffer en ga verder met genotyperen voor de mutatie van belang. Als u afbeeldingsanalyse wilt uitvoeren, selecteert en opent u de afbeelding in Fiji en keert u deze om door op Bewerken te klikken en vervolgens om te keren en converteert u het afbeeldingstype naar 8-bits door op het tabblad Afbeelding te klikken, Tekst te selecteren en 8-bits te selecteren.
Selecteer het gereedschap veelhoek en teken handmatig het gebied van belang of ROI op de afbeelding rond het gebied dat het ISH-signaal bevat dat moet worden gemeten. Druk op T om de ROI Manager te openen en selecteer de regio van belang en klik vervolgens op Meten. Kopieer de gemiddelde waarde van het venster Resultaten naar een spreadsheet.
Als u de achtergrondintensiteit wilt meten, verplaatst u de ROI naar een gebied in het embryo zonder kleuring en klikt u op Toevoegen in de ROI-manager. Selecteer het achtergrondgebied en klik op Meten en nota vervolgens de gemiddelde intensiteitswaarde in de spreadsheet. Verkrijg de gemiddelde pixelintensiteit van het NC2-hybridisatiesignaal door de gemiddelde intensiteit van de achtergrond af te trekken van die van het gekleurde gebied.
Nadat u de gemiddelde pixelintensiteit van elk monster hebt bepaald, wijst u aan elk monster een genotype toe. Als het genotype niet kan worden bepaald, sluit u het monster uit van een latere analyse. Sorteer de gemiddelde monsterintensiteitswaarden op basis van genotype en ga verder met statistische tests.
Het nut van deze techniek is aangetoond op ISH voor dnmt3bb. 1 in embryo's van een runx1 heterozygoot incross. Een daling van dnmt3bb.
1 expressie werd gedetecteerd in runx1 homozygoot mutanten, terwijl heterozygoot embryo's geen significante verschillen vertoonden in dnmt3bb. 1 uitdrukking. Bij een poging om het effect van lmo4 mutatie op runx1 expressie te bepalen, liet deze analyse geen significante verschillen in expressie zien tussen wilde type en homozygoot lmo4 mutanten.
Echter, een kleine daling van runx1 expressie werd gedetecteerd door single embryo qPCR. In ongeveer 0,4% van de runx1-gesonde embryo's, de ISH had een hoge achtergrond die resulteerde in een negatief aantal toen het werd afgetrokken van het signaal. In dergelijke gevallen werden de embryo's uitgesloten van analyse.
Vier verschillende regio's op de embryo's zijn getest om achtergrondcorrecties te optimaliseren. Hoewel er een relatief stabiel verschil in intensiteit van de ROI in een van de achtergrondgebieden, R3 toonde altijd een hogere intensiteit dan de ROI en mag niet worden gebruikt voor achtergrondcorrectie. R1 en R4 bleken de meest geschikte gebieden voor achtergrondcorrectie.
Het is belangrijk om de beste omstandigheden voor de beeldvorming te vinden en ze ongewijzigd te houden tijdens het experiment. We raden ook aan om de pixelintensiteit te kwantificeren voordat we aan elk monster een genotype toewijzen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor parallelle embryo genotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen in zebravissen. Door gebruik te maken van deze onbevooroordeelde aanpak, kunnen onderzoekers een grotere nauwkeurigheid bereiken in fenotypische analyses.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Genbewerkingstechnologieën vergemakkelijken het genereren van zebravismutanten.
- In situ hybridisatie is een veelgebruikte methode voor het beoordelen van genexpressie.
- Traditionele scoremethoden kunnen vooringenomenheid en subjectiviteit introduceren.
- Dit onderzoek heeft tot doel een meer consistente en kwantitatieve aanpak te bieden.
Doel van het onderzoek
- Om de nauwkeurigheid van fenotypische analyses in zebravissen te verbeteren.
- Om een gestandaardiseerde methode voor embryo genotypering te bieden.
- Om in situ hybridisatiesignalen objectief te kwantificeren.
Gebruikte methoden
- Beeldvorming van ISH-gekleurde embryo's met behulp van een stereomicroscoop.
- Bereiden van glyceroloplossingen voor embryooverdracht.
- Gebruik van alkalische lysisbuffer voor DNA-extractie.
- Gebruik van Fiji-software voor beeldanalyse en kwantificering.
Belangrijkste resultaten
- Demonstreerde een afname in dnmt3bb.1 expressie in runx1 homozygote mutanten.
- Identificeerde geschikte achtergrondcorrectiegebieden voor beeldanalyse.
- Toonde geen significante verschillen in expressie tussen wildtype en lmo4 homozygote mutanten.
- Bijdroeg een betrouwbare methode voor het toewijzen van genotypen op basis van pixelintensiteit.
Conclusies
- De methode verbetert de betrouwbaarheid van genexpressieanalyse.
- Het kan worden aangepast voor gebruik in andere modelsystemen.
- Het handhaven van consistente beeldvormingsomstandigheden is cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
