Name: Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer een semi-high-throughput NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers. Deze methode optimaliseert onderzoek naar myosine-inhibitoren zonder gevaarlijke materialen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte en National Institute on drug abuse NS096833 (CAM).

1. voorbereiding van voorraadoplossingen en reagentia
<ol><li>Bereid dithiotreïtol (DTT) stockoplossing door kristallijne DTT in gedestilleerd water op te lossen tot een eindconcentratie van 1000 mm. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Bereid ATP-voorraadoplossing door het oplossen van kristallijne ATP in gedestilleerd water tot een eindconcentratie van 100 mM. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Bereid 10x NADH buffer met 70 mM 3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mm ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, n ′, n′-tetraazijnzuur (EGTA), en 3 mm Nan3. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 1x myosin buffer met 10 mM MOPS en 0,1 mM EGTA. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C. Voeg bovine serumalbumine (BSA) en DTT toe aan een eindconcentratie van 0,1% (w/v%) respectievelijk 1 mM, voor gebruik.</li>
	<li>Bereid 1x actine buffer met 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2en 3 mm Nan3. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C. Voeg BSA en DTT toe aan een eindconcentratie van 0,1% (w/v%) respectievelijk 1 mM, voor gebruik.</li>
	<li>Bereid NADH stockoplossing door het oplossen van kristallijne NADH in 10x NADH buffer tot een uiteindelijke concentratie van 5,5 mM. Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Bereid PEP-voorraadoplossing voor door kristallijne PEP in 10x NADH-buffer op te lossen tot een eindconcentratie van 50 mM. Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Bereid LDH-voorraadoplossing door gelyofiliseerd LDH-poeder op te lossen in een mengsel van glycerol en 10x NADH-buffer (50%: 50%) tot een eindconcentratie van 2000 U/mL. Centrifugeer de oplossing om alle aanwezige onopgeloste eiwitten te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis. Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Bereid de PK stockoplossing door het oplossen van gelyofiliseerd PK poeder in een mengsel van glycerol en 10x NADH buffer (50%: 50%) tot een eindconcentratie van 10000 U/mL. Centrifugeer de oplossing om alle aanwezige onopgeloste eiwitten te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis. Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Reconstitueer de gelyofiliseerd cardiale en skeletspier myosin II monsters door toevoeging van 100 μL gedestilleerd water voor het verkrijgen van 10 mg/ml stamoplossingen overeenkomend met ~ 37,9 μm en ~ 40,8 μM myosine concentraties (monomere), respectievelijk. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor meer informatie.</li>
	<li>Bereid F-actin van konijnen spier aceton poeder zoals beschreven door Pardee en Spudich25.</li>
</ol>2. meten van ATPase-activiteiten en remmende effecten van kleine molecuul remmers
<ol><li>Maak een samengestelde plaat.<ol>
<li>Los verbindingen van belang in kwalitatief hoogwaardig dimethylsulfoxide (DMSO).</li>
		<li>Maak vijftien stappen seriële 1:2 verdunningen vanaf 10 mM samengestelde concentratie in DMSO.</li>
		<li>Breng de monsters over in een 384-goed polypropyleen plaat in drievaten (12,5 μL elk) met behulp van een meerkanaals pipet. Gebruik twee rijen op de samengestelde plaat voor één samengestelde (in plaats van drie kolommen) om het aantal putten mogelijk beïnvloed door de randeffecten te minimaliseren. Gebruik de laatste drie putjes in de tweede rij voor elke verbinding als negatieve controle (alleen DMSO). Gebruik de eerste en laatste rij op de plaat niet voor samengestelde verdunningen.</li>
		<li>Breng pure DMSO over naar de putjes van de eerste rij (gereserveerd voor NADH kalibratie).</li>
		<li>Gebruik de laatste rij voor positieve controle. Opmerking: para-aminoblebbistatin bij een concentratie van 4 mm in DMSO werd hier gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid 4500 μL van 20 μM verdunde actine oplossing voor elke test plaat (384-well Black-Wall polystyreen microplaat) door het verdunnen van de actine stockoplossing in de actine buffer. Meng de oplossing grondig door het pipetteren op en neer 30x met behulp van een 5 mL pipet om viscositeit en heterogeniteit te verminderen door het breken van actine filamenten. Centrifugeer de oplossing om eventueel neergeprecipiteerd eiwit aanwezig te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis.</li>
	<li>Bereid de Master mix met LDH en PK enzymen ("enzym mix"). Combineer voor elke test plaat 171,4 μL LDH-oplossing, 171,4 μL PK-oplossing en 3189,3 μL of 3252,9 μL myosine-buffer voor assays waarbij respectievelijk cardiale of skeletspier myosine II wordt gecombineerd in een conische centrifugebuis van 15 mL. Voeg geen myosin op dit punt om aggregatie en neerslag te voorkomen.</li>
	<li>Bereid de Master mix met alle ondergronden ("substraat mix"). Combineer voor elke plaat 162,1 μL ATP, 162,1 μL PEP en 324,1 μL NADH-oplossing in een conische centrifugebuis van 15 mL. Voeg actine niet toe op dit punt om aggregatie en neerslag te voorkomen.</li>
	<li>Maak zeven stappen seriële 1:2 verdunningen van NADH voor kalibratie vanaf 250 μM.<ol>
<li>Meng 12,3 μL NADH stockoplossing met 257,7 μL myosin buffer in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.</li>
		<li>Aliquot 135 μL myosin buffer in zeven 1,5 mL micro centrifugebuizen.</li>
		<li>Breng 135 μL oplossing van de eerste buis naar de tweede en meng door pipetteren. Herhaal dit tot de 7-ste buis is bereikt.</li>
		<li>Gebruik de laatste buis als no-NADH Control (alleen buffer).</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een pipet met 8 kanalen en breng 20 μL van de NADH-kalibratieoplossingen over in de eerste rij van de test plaat in triplicaten.</li>
	<li>Voeg 68 μL cardiale of 4,2 μL skeletspier myosine II toe aan het enzym mengsel. Vortex kort.</li>
	<li>Met uitzondering van de eerste rij, Doseer met behulp van een geautomatiseerde dispenser 8,4 μL van de bereide myosin-enzym mix in elke put van de test plaat.</li>
	<li>Breng 100 nL van oplossingen van de samengestelde plaat naar de test plaat met enzym mengsel met behulp van een geautomatiseerd vloeistof behandelingssysteem uitgerust met een 100 nL PIN gereedschaps hoofd.</li>
	<li>Schud de test plaat gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 1200 TPM met behulp van een microplaat Shaker.</li>
	<li>Voeg 4.052 μL van de gecentrifugeerde actine-oplossing toe aan de substraat combinatie. Vortex kort.</li>
	<li>Verdeel 11,6 μL van de actin-substraat mix in elke put van de test plaat (behalve de eerste rij) om de enzymatische reactie te starten met behulp van een geautomatiseerde dispenser.</li>
	<li>Schud de test plaat gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 1200 TPM met behulp van een microplaat Shaker.</li>
	<li>Centrifugeer de test plaat bij 101 x g gedurende 30 sec.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de binnentemperatuur van de plaat lezer is gestabiliseerd bij 25 °C. Laad de plaat en schud voor nog eens 30 sec. Deze schud stap is nodig om de vorm van het vloeibare oppervlak in elke put vergelijkbaar te maken en zorgt ervoor dat de plaat de meettemperatuur kan bereiken.</li>
	<li>Record NADH fluorescentie gedurende 30 min het scannen van de plaat in 45 s intervallen. Gebruik een 380 nm, 10 nm bandbreedte excitatie filter en een 470 nm, 24 nm bandbreedte-emissie filter in combinatie met een 425 nm cut-off dichroïde spiegel. Voer de meting uit in de hoge-concentratie modus. Optimaliseer het aantal flitsen, de gain van de detector, de afmetingen van de plaat en de meet hoogte voordat u de assays uitvoert. Opmerking: de uiteindelijke testcondities zijn 300 nM cardiale/20 nM skeletspieren myosine II, 10 μM actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP in een buffer met 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO en 1 mM DTT. Het totale volume is 20 μL/goed. De hoogste uiteindelijke samengestelde concentratie is 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatine in 0,5% DMSO dient als de positieve controle en 0,5% DMSO alleen is de negatieve controle. Alle metingen worden uitgevoerd in triplicaten.</li>
</ol>3. gegevens analyseren
<ol><li>Plot de waargenomen fluorescentie intensiteit tegen de tijd voor elke put.</li>
	<li>Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling en het onderscheppen van de fluorescentie reacties voor elke put te bepalen. De helling is evenredig met de consumptie snelheid van ATP (NADH), terwijl het snijpunt evenredig is aan de NADH-concentratie aan het begin van de meting (t = 0 s).</li>
	<li>Bouw een ijkcurve voor NADH door het aftekenen te plotten verkregen voor de eerste rij van de plaat tegen de concentratie van NADH. Zorg ervoor dat de onderschept lineair afhankelijk zijn van de NADH-concentratie. Opmerking: de onderschept schatten de reële fluorescentie intensiteiten bij t = 0 s met veel meer vertrouwen dan het gemiddelde van de intensiteit van de ruwe fluorescentie op t ≈ 0 s.</li>
	<li>Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling en het onderscheppen van de NADH kalibratie lijn te verkrijgen. Opmerking: het snijpunt beschrijft het fluorescentie-achtergrond signaal (geen NADH aanwezig), terwijl de helling overeenkomt met de geëxtregeerde/theoretische fluorescentie intensiteit van een 1 M NADH-oplossing in dat specifieke experiment.</li>
	<li>Verdeel de helling van de fluorescentie respons verkregen voor de rest van de putjes door de helling van de NADH kalibratie lijn om fluorescentie veranderingen te converteren naar ATP verbruikspercentages.</li>
	<li>Plot de ATP-verbruikspercentages tegen de concentratie van de remmer.</li>
	<li>Om remmende constanten te bepalen, moet u de juiste statistische software gebruiken om de dosis-responsgegevens aan te passen aan de volgende kwadratische vergelijking die overeenkomt met een eenvoudig één-op-één bindend evenwichtsmodel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60017/60017eq01.jpg" style="opacity: 0.9;"> waarbij y het ATP verbruikspercentage is, ymin het ATP verbruiks tarief int de afwezigheid van remmer, ymax is het theoretische ATP verbruikspercentage bij 100% remming, KI is de remmende constante , [E]t en [I]t zijn de totale concentratie van het enzym (myosin) en inhibitor, respectievelijk.</li>
</ol>

<ol><li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li>
<li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+superfamily+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li>
<li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+millennial+myosin+census%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li>
<li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+classification+of+myosins%2C+a+paneukaryotic+whole-genome+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li>
<li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-muscle+myosin+II+in+disease%3A+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li>
<li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Yi+Chuan%22%5BJournal%5D)">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li>
<li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives%3A+Optimization+and+Pharmacological+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li>
<li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li>
<li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li>
<li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li>
<li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first%2C+selective%2C+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li>
<li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
<li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+soluble%2C+non-phototoxic%2C+non-fluorescent+blebbistatin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141(2016).</li>
<li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+%28S%29-3%27-hydroxyblebbistatin+and+%28S%29-3%27-aminoblebbistatin%3A+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li>
<li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+%28S%29-blebbistatin+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li>
<li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li>
<li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li>
<li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA%2B+ATPase+p97%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li>
<li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li>
<li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+an+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305(2016).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li>
<li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li>
<li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li>
<li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+assays+at+equilibrium%3A+validation+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li>
<li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+binding+data%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li>
<li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li>
<li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li>
<li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li>
<li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIFC1%3A+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li>
<li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li>
<li>Datta, A., Brosh, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kritieke stappen in het Protocol
Optimaliseer de plaat indeling door meerdere platen met alleen negatieve controle uit te voeren (ATPase-reactie zonder remmer). Inspecteer de resultaten zorgvuldig op patronen in reactiesnelheden. Deze kunnen bijvoorbeeld voortvloeien uit randeffecten en/of onvolkomenheden in de hydrofiele oppervlaktecoating van "niet-bindende" platen. Als een patroon wordt waargenomen, wijzigt u het plaat type en/of de plaat indeling om de artefacten te minima...

Myosins zijn mechanochemische energie transducers die adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyseren om richtings bewegingen te genereren langs de filamenten van het actine cytoskelet in eukaryoten1,2. Ze hebben zowel structureel als kinetisch aangepast aan hun verschillende intracellulaire functies, zoals het transport van organellen, spiercontractie of de aanmaak van cytoskelet spanning1,2. De myosin superfamilie wordt vertegenwoordigd door ~ 40 myosin genen die behoren tot ~ 12 verschillende myosin klassen in het menselijk genoom3,4. Leden van de myosin klassen spelen verschillende rollen in een zeer diverse set van aandoeningen, zoals verschillende kankers, neurologische aandoeningen, skelet myopathieën, en Hypertrofische cardiomyopathie5,6. Gezien het grote aantal fysiologische en pathologische functies van deze moleculaire motoren, het is niet verwonderlijk dat ze steeds meer worden erkend als drugs doelen voor een verscheidenheid van voorwaarden7. Er is recentelijk aanzienlijke vooruitgang geboekt in de ontdekking van nieuwe myosine-remmers8,9,10 en Activators11, en om de eigenschappen van bestaande te verbeteren12, 13 , 14 , 15.
De Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is al lange tijd gebruikt om de ATPase-activiteit van verschillende enzymen te meten, zoals de sarcoplasmorische reticulum CA2 + pomp ATPase16, de DNA-reparatie ATPase RAD5417, de AAA + ATPase P9718 of de microtubulus motor kinesin19. Bij de assay wordt een ATP-regeneratiecyclus gebruikt. De adenosine difosfaat (ADP) gegenereerd door de ATPase wordt geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK), die transformeert één molecule van fosfoenolpyruvate (PEP) pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH). Dat, op zijn beurt, oxiderende een molecuul van NADH naar NAD. Daarom is de afname van de NADH-concentratie als functie van de tijd gelijk aan de ATP-hydrolysesnelheid. De ATP-regeneratiecyclus houdt de ATP-concentratie bijna constant en de ADP-concentratie laag zolang PEP beschikbaar is. Dit resulteert in lineaire tijd cursussen, waardoor het eenvoudig is om de initiële reactiesnelheden te bepalen en helpt bij het voorkomen van product remming door ADP19. Hoewel de NADH-gekoppelde ATPase-assay al is aangepast aan een 96-well formaat20, maken de hoge reactievolumes (~ 150 μL) het relatief duur vanwege de hoge vraag van reagentia, waardoor het minder vatbaar is voor een snelle screening van grote aantallen Verbindingen. Alternatieve methoden, zoals de Malachiet groene assay19,21, die berust op de opsporing van het fosfaat dat wordt geproduceerd door het ATPase-enzym, bleken geschikter te zijn voor miniaturisatie en screening met hoge doorvoer22 , 23 , 24. een eindpunt test heeft echter meer kans om beïnvloed te worden door verschillende artefacten (hieronder besproken), die onontdekt kunnen blijven bij afwezigheid van voltijdse cursussen.
Hier is de NADH-gekoppelde ATPase-assay geoptimaliseerd voor de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecuul remmers. Skelet en cardiale spier myosine II en de myosin-remmers blebbistatine8, para-aminoblebbistatine13 en para-nitroblebbistatine12 worden gebruikt om de kracht van de test aan te tonen, die gebaseerd is op NADH fluorescentie als uitlezen. Dit protocol is vatbaar voor screening van projecten gericht op elke ADP-producerende enzymen.

<table><tbody><tr><td>384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine 5&prime;-trifosfaat dinatriumzouthydraat)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Aurora FRD-IB Dispenser</td><td>Aurora Discovery, Inc.</td><td>00017425</td><td></td></tr><tr><td>Biomek NXP Multichannel Laboratorium Automatisering Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31841</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Custom synthese</td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine, Protease-Vrij)</td><td>Akron Biotech</td><td>AK1391&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R, gekoeld, met Rotor FA-35-6-30</td><td>Eppendorf</td><td>022620663</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430, niet gekoeld, met Rotor A-2-MTP</td><td>Eppendorf</td><td>022620568</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-formaat; 8-kanaals</td><td>Thermo Scientific</td><td>4672010</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-formaat; 8-kanaals</td><td>Thermo Scientific</td><td>4672080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Ethyleen glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraazijnzuur)</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>LDH (L-Lactaatdehydrogenase uit konijnenspier)</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (Magnesiumchloride hexahydraat)</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 12620-926&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 384 well, PP, klein volume, diep wel, natuurlijk</td><td>Greiner Bio-One</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (3-(N-Morpholino)propaansulfonzuur)</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Myosine Motor Eiwit (volledige lengte) (Rund hartspier)</td><td>Cytoskeleton&nbsp;</td><td>MY03</td><td></td></tr><tr><td>Myosine Motor Eiwit (volledige lengte) (Konijnenskeletspier)</td><td>Cytoskeleton&nbsp;</td><td>MY02</td><td></td></tr><tr><td>NADH (&beta;-Nicotinamide adenine dinucleotide, gereduceerd dinatriumzouthydraat)</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (Natriumazied)</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (Natriumhydroxide)</td><td>&nbsp;Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Optische Filter CFP 470/24nm (Emissie)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5850</td><td>Barcode 240</td></tr><tr><td>Optische Filter Fura2 380/10nm (Excitatie)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5390</td><td>Barcode 112</td></tr><tr><td>Optisch Module: Beta Lactamase</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-4270</td><td>Barcode 418</td></tr><tr><td>OriginPro 2017 software</td><td>OriginLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>para-Aminoblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Custom synthese</td></tr><tr><td>para-Nitroblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Custom synthese</td></tr><tr><td>PEP (Fosfo(enol)pyruvaat monokaliumzout)</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>PK (Pyruaat Kinase uit konijnenspier)</td><td>Sigma</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>Konijnenspier Aceton Poeder</td><td>Pel Freez Biologicals</td><td>41995-2</td><td></td></tr></tbody></table>

een semi-high-throughput adaptatie van de nadh-gekoppelde atpase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymen maken gebruik van de vrije energie opgeslagen in adenosinetrifosfaat om een grote verscheidenheid van endergonische biochemische processen in vivo te katalyseren die niet spontaan zouden optreden. Deze eiwitten zijn cruciaal voor in wezen alle aspecten van het cellulaire leven, met inbegrip van metabolisme, celdeling, reacties op veranderingen in het milieu en beweging. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft een Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase assay die is aangepast aan de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecule ATPase remmers. De assay is toegepast op cardiale en skeletspier myosine II, twee actin gebaseerde moleculaire motor ATPases, als een bewijs van principe. De hydrolyse van ATP is gekoppeld aan de oxidatie van NADH door enzymatische reacties in de assay. Ten eerste wordt de door de ATPase gegenereerde ADP geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK). PK katalyseert de overgang van fosfoenolpyruvate (PEP) naar pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH), wat de oxidatie van NADH parallel katalyseert. Zo is de afname van de ATP-concentratie direct gecorreleerd aan de afname van de concentratie NADH, die wordt gevolgd door verandering in de intrinsieke fluorescentie van NADH. Zolang PEP beschikbaar is in het reactiesysteem, blijft de ADP-concentratie zeer laag, waardoor remming van het ATPase-enzym door zijn eigen product wordt vermeden. Bovendien blijft de ATP-concentratie vrijwel constant, wat lineaire tijdvakken oplevert. De fluorescentie wordt continu bewaakt, waardoor een eenvoudige schatting van de kwaliteit van de gegevens mogelijk is en helpt bij het filteren van mogelijke artefacten (bijvoorbeeld als gevolg van samengestelde neerslag of thermische veranderingen).

De standaardkaart voor screening-experimenten wordt weergegeven in Figuur 1. De eerste en laatste rij zijn gereserveerd voor NADH kalibratie en positieve controle (20 μM para-aminoblebbistatine, 0,5% DMSO), respectievelijk. De resterende rijen (B naar O) worden gebruikt om de remmende activiteit van verbindingen te testen. Hier worden vijftien stappen seriële 1:2 verdunningen vanaf 10 mM samengestelde concentratie in DMSO bereid en overgebracht van d...

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Dit protocol is van toepassing op een breed scala van screening projecten gericht op de ontwikkeling van ATPase remmers, hetzij als sondes voor fundamenteel onderzoek of voor potentiële klinische verbindingen. Deze methode is geoptimaliseerd voor semi-high-throughput screening toepassingen. Het is ook ontworpen om verschillende gemeenschappelijke artefacten te vermijden en het vereist niet de behandeling van gevaarlijke stoffen.In ons laboratorium hebben we deze test gebruikt om nieuwe en specifieke niet-spier myosine II-remmers te ontwikkelen voor de behandeling van methamfetaminegebruiksstoornis. In theorie kan deze methode gemakkelijk worden toegepast op enzymen die ATP produceren. Visuele demonstratie helpt om alle belangrijke technische details te verduidelijken.Om te beginnen, bereid 4,500 microliter van 20 micromolar verdunde actine oplossing voor elke 384-well zwarte polystyreen microplaat door het verdunnen van de geconcentreerde actine voorraad oplossing in actin buffer. Meng de oplossing grondig door 30 keer op en neer te pipetten om actinefilamenten te breken om viscositeit en heterogeniteit te verminderen. Centrifugeer vervolgens de oplossing om eventueel neergeslagen eiwitten te verwijderen.Breng de supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis. Bereid master enzym mix in een 15-milliliter conische centrifuge buis voor elke testplaat door het combineren van 3, 252,9 microliters van myosine buffer voor de test waarbij skeletspier myosine II, 171,4 microliter van LDH oplossing, en 171,4 microliters van PK oplossing. Bereid master substraat mix in een 15-milliliter conische centrifuge buis voor elke plaat door het combineren van 162,1 microliter van ATP, 162,1 microliter pep, en 324,1 microliter van NADH oplossing.Voeg op dit punt geen actin toe om aggregatie en neerslag te voorkomen. Om zeven-staps seriële één-op-twee verdunningen van NADH voor kalibratie te creëren, bereid acht 1.5-milliliter microcentrifugebuizen voor. Meng 12,3 microliter NADH-voorraadoplossing met 257,7 microliter myosinebuffer in de eerste buis om een 250 micromolaroplossing te maken.Dan aliquot 135 microliters van myosine buffer in elk van de resterende zeven buizen. Breng 135 microliter van de oplossing van de eerste buis in de tweede en meng door pipetting. Herhaal dit tot het bereiken van de zevende buis.Gebruik de laatste buis als no-NADH-controle met alleen buffer. Neem altijd positieve en negatieve controles op samengestelde platen en NADH-verdunningen op testplaten op. Deze besturingselementen zijn uiterst belangrijk voor het identificeren van artefacten tijdens gegevensanalyse.Met behulp van een achtkanaals pipet breng je 20 microliter van de NADH-kalibratieoplossingen in drievouden in drievouden in een testplaat. Voeg nu 4,2 microliter skeletspier myosine II toe aan de enzymmix. Vortex kort.Voeg myosine toe aan het enzymmengsel vlak voor het uitdelen. Lange incubatie van verdunde myosineoplossingen kan leiden tot verlies van activiteit als gevolg van neerslag en niet-specifieke binding aan kunststofoppervlakken. Laad het bereide myosineenzymmengsel in een van de monstercontainers van een automatische dispenser.In de plaat, met uitzondering van de eerste rij, 8,4 microliter van de myosine enzym mix in elke put van de testplaat. Plaats vervolgens de testplaat en de samengestelde plaat op de labware positioners van een geautomatiseerd vloeistofbehandelingssysteem dat is uitgerust met een 100 nanoliterpengereedschapkop. Voer vervolgens de juiste methode in de software uit om 100 nanoplegers van oplossingen over te brengen van de voorbereide samengestelde plaat naar de testplaat.Plaats vervolgens de testplaat op een microplate shaker om een minuut te schudden bij kamertemperatuur bij 1.200 tpm. Voeg 4,052 microliters van de centrifuged actineoplossing kort toe aan de substraatmix en vortex. Om de enzymatische reactie te starten, 11,6 microliter actine substraat mix in elke put van de testplaat met behulp van een automatische dispenser, met uitzondering van de eerste rij.Schud op een microplate shaker de testplaat gedurende één minuut bij kamertemperatuur bij 1.200 tpm. Centrifugeren de testplaat op 101 keer g gedurende 30 seconden. Gebruik een 380-nanometer, 10-nanometer band breedte excitatie filter, en 470 nanometer, 24-nanometer band breedte emissiefilter in combinatie met de 425-nanometer cutoff dichroic spiegel voor de testen.Optimaliseer het aantal flitsen, detectoraanwinst, plaatafmetingen en meethoogte voordat u de testen uitvoert. Voer de meting in hoge concentratiemodus uit. Zorg ervoor dat de binnentemperatuur van de plaatlezer gestabiliseerd is bij 25 graden Celsius.Laad de plaat in de plaatlezer en schud nog 30 seconden om de vorm van het vloeibare oppervlak in elke put op elkaar te laten lijken en laat de plaat de meettemperatuur bereiken. Scan de plaat in intervallen van 45 seconden en neem nadh-fluorescentie gedurende 30 minuten op. Met de geëxporteerde gegevens, plot de waargenomen fluorescentie intensiteit tegen de tijd voor elke put.Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling te bepalen en de fluorescentiereacties voor elke put te onderscheppen. De helling is evenredig aan de NADH-verbruikssnelheid die kan worden gebruikt als een zeer goede benadering van het ATP-verbruik. De onderschepping is evenredig aan de NADH-concentratie aan het begin van de meting.Bouw vervolgens een kalibratiecurve voor NADH door de onderscheppingen die voor de eerste rij van de plaat zijn verkregen, in kaart te brengen tegen de concentratie van NADH. De onderscheppingen schatten de echte fluorescentieintensiteiten aan het begin met veel meer vertrouwen dan het gemiddelde van de ruwe fluorescentieintensiteit aan het begin leest. Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling te verkrijgen en de NADH-kalibratielijn te onderscheppen.Hier beschrijft de intercepties het fluorescentieachtergrondsignaal zonder NADH aanwezig, terwijl de helling overeenkomt met de geëxtrapoleerde theoretische fluorescentieintensiteit van een nadh-oplossing van één kies. Om fluorescentieveranderingen om te zetten in atp-consumptietarieven verdelen de helling van de fluorescentierespons die voor de rest van de putten wordt verkregen door de helling van de NADH-kalibratielijn. Zet vervolgens de ATP-consumptiecijfers in kaart tegen de concentratie van de remmer.Gebruik voor het bepalen van de remmende constanten de juiste statistische software die niet-lineaire curvefitting kan gebruiken, zoals Origin 2017. Selecteer niet-lineaire curve fit om de dosis-respons gegevens te passen op een kwadratische vergelijking die overeenkomt met een eenvoudige een-op-een bindend evenwicht model. Y is de ATP-consumptiesnelheid.Y-minimum is het ATP-verbruik bij afwezigheid van remmer. Y-maximum is de theoretische ATP-consumptiesnelheid bij 100%-remming. t en t zijn de totale concentratie van respectievelijk het myosineenzym en de remmer.KI is de remmende constante. In deze studie vertoonden skelet- en hartspier myosine II ATPase-reacties lineaire fluorescentieintensiteitssporen, ongeacht het gebruikte myosine of de aanwezigheid van remmers. Basale en actin-geactiveerde ATPase tarieven toonden lineaire afhankelijkheid van de concentratie van skelet- of hartspier myosine II.A screening venster coëfficiënt of Z-factor van 0,78 aangegeven een betrouwbare test met zeer goed gescheiden positieve en negatieve controles.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin en para-Nitroblebbistatin vertoonden regelmatige dosisresponscurven op of onder hun gerapporteerde oplosbaarheidswaarden. Remmende constanten voor zowel hart- als skeletspier myosine IIs werden bepaald door het aanbrengen van een kwadratische vergelijking die een eenvoudig evenwichtsbindingsmodel aan de gegevens vertegenwoordigt. Fluorescentie intensiteit sporen voor blebbistatine verkregen in een ATPase test met behulp van skeletspier myosine II toonde normaal lineair afnemend signaal, afhankelijk van de hoeveelheid van de aanwezige remmer.Echter, boven de oplosbaarheid van blebbistatine een onverwachte toename van het signaal werd waargenomen waarschijnlijk te wijten aan de vorming van helder florescent blebbistatine kristallen. In het geval van para-Nitroblebbistatine met normale ruwe fluorescentieintensiteitssporen, wijkden de boven oplosbaarheid verkregen reactiepercentages af van de vastgestelde dosisresponscurve als gevolg van neerslag. Met behulp van deze methode hebben we nieuwe, krachtige en selectieve myosineremmers ontwikkeld die in de toekomst kunnen worden gebruikt als wetenschappelijke instrumenten in fundamenteel onderzoek of als directe kandidaten.Het is altijd aanbevolen om een andere ATPase of andere functionele test te gebruiken die specifiek is voor het enzym van belang om onderscheid te maken tussen echte en vals-positieve hits. Alle eiwitten binden plastic oppervlakken. Dit probleem kan de resultaten sterk beïnvloeden, vooral als het eiwit aanwezig is bij lage concentraties.Vermijd altijd onnodige vloeistofbehandeling en gebruik niet-bindende buizen. Alternatieve ATPase-tests vereisen meestal de behandeling van zwavelzuur, giftige stoffen of radioactieve stoffen. De NADH-gekoppelde ATPase-test daarentegen vereist alleen reagentia zonder of zeer lage toxiciteit.

a-semi-high-throughput-adaptation-nadh-coupled-atpase-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Aanhoudende activering van remmende G-eiwit gekoppelde receptoren leidt tot een sensibilisering van adenylylcyclase signalering. Om de essentiële moleculaire pathways identificeren nonbiased stappen noodzakelijk zijn, maar deze strategie vereist de ontwikkeling van een schaalbare celgebaseerde cAMP overgevoeligheid assay. Hierin beschrijven we een overgevoeligheid test voor kleine moleculen en siRNA screening.

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

Kinesins worden gekenmerkt door nucleotide-afhankelijke interactie met microtubuli: een cyclus van ATP omzet gekoppeld met een cyclus van microtubule interactie. We beschrijven hier protocollen om de kinetiek van afzonderlijke nucleotide overgangen in de ATP omzet cyclus van een kinesine met fluorescent gemerkte nucleotiden en gestopte stroming fluorescentie geanalyseerd.

Gebruik van Stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden aan de ATP omzet Cyclus van kinesins Analyseer

De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

NMR-based activiteit assays zijn ontwikkeld om te identificeren en te karakteriseren remmers van twee nucleoside ribohydrolase enzymen. De protocollen worden verstrekt voor aanvankelijke samenstellings analyses bij 500 μM en 250 μM, dosis-reactie analyses voor het bepalen van IC50 waarden, detergent tegen het scherm analyses, sprong-verdunnings tegen het scherm analyses, en analyses in de gehele cellen van E. coli .

NMR-based activiteit assays voor het bepalen van samengestelde remming, IC50 waarden, artefactuele activiteit, en de hele cel activiteit van nucleoside Ribohydrolases

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

SAMHD1 is een deoxynucleosidetrifosfaattrifosfohydrolase met een cruciale rol in de gezondheid en ziekte van de mens. Hier presenteren we een veelzijdige enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest, ingezet in een microplaatformaat met 384 putjes, die de evaluatie van kleine moleculen en nucleotide-analogen als SAMHD1-substraten, activatoren en remmers mogelijk maakt.

Een high-throughput enzymgekoppelde activiteitstest om de interactie van kleine moleculen met het dNTPase SAMHD1 te onderzoeken

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Dit protocol beschrijft een biochemische test met gelverschuiving voor het meten van de activiteit van FEN1 (Flap Endonuclease 1) en de ontwikkeling van remmers.

Op fluorescentie gebaseerde detectie van FEN1-nuclease-activiteit en screening van kleinmoleculaire remmers

Leer een semi-high-throughput NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers. Deze methode optimaliseert onderzoek naar myosine-inhibitoren zonder gevaarlijke materialen.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

Meer video's verkennen