Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen

We schetsen een systeem om de dynamische vorming van chromatinedomeinen te beoordelen. We gebruiken dit systeem om de rekrutering en verspreiding van PRC2-gemedieerde chromatinedomeinen in cellen te volgen. Het proces kan op elk gewenst moment worden onderbroken om de lopende gebeurtenissen te analyseren.

Dit systeem kan worden gericht op dynamische veranderingen in een bepaald cellulair proces te controleren en is dus niet beperkt tot het bijhouden van chromatine domeinvorming. Begin met het ontwerpen van gids RNAs om exon 10 en 11 van een endogene kopie van embryonale ectoderm ontwikkeling, of EED, in de muis embryonale stamcellen met behulp van CRISPR Design Tool te verwijderen. Kloon de gids RNAs in de CRISPR / Cas9 plasmid volgens manuscript aanwijzingen.

In een zes-put plaat formaat, transfect 200, 000 muis embryonale stamcellen, of mESCs, met een microgram van elke gids RNA met behulp van transfectie reagentia volgens de instructies van de fabrikant. Verander de media 24 uur na transfectie. Twee dagen na de transfectie isoleer je GFP-positieve cellen met FACS.

Transfectie efficiëntie varieert van ongeveer 10 tot 30%, dus sorteren rond 500,000 cellen om voldoende GFP-positieve cellen voor beplating te vangen. Plaats de geïsoleerde GFP-positieve cellen in platen van 15 centimeter die voorgecoat zijn met 0,1% gelatine voor kolonieplukken. Laat de cellen in ESC-medium ongeveer een week groeien totdat enkele kolonies zichtbaar zijn, zodat u de media om de twee dagen verandert.

Kies een minimum van 48 kolonies met behulp van een 20-microliter pipet tip te schrapen over de kolonie, terwijl piraterij. Zonder de kolonie in enkele cellen op te breken, breng je deze over naar een Accutase-bevattende 96-put plaat. Broed de kolonies op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten om de cellen te scheiden.

Voeg vervolgens 200 microliters ESC-media toe aan elke put met een multichannel pipet. Meng goed en plaat van de cellen in twee aparte 96-well platen. Gebruik een van de platen voor genotyperen, en houd de andere groeien totdat genotyperen is afgerond.

Haal DNA uit de plaat met behulp van commerciële reagentia en volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Gebruik genotypering primers die de verwijderde site om genotyping PCR uit te voeren met Taq DNA polymerase. Observeer een DNA-product van een lager moleculair gewicht in cellen met een homozygoot deletie ten opzichte van de wild-type cellen.

Ontwerpgids RNA om een snede in de intron te introduceren na exon 9 van EED met behulp van een CRISPR Design Tool, en kloon het in de CRISPR / Cas9 plasmid volgens manuscript aanwijzingen. Ontwerp een donorsjabloon-DNA met de EED cDNA-sequentie na exon 9 en een C-terminal Flag-HA-tag stroomopwaarts van een T2A-GFP-sequentie, allemaal in omgekeerde richting met betrekking tot de endogene gensequentie. Flanker de cassette met een splice-acceptor en een polyadenylation sequentie genesteld tussen heterologe omgekeerde loxP sites, en omvatten ten minste 500 basisparen van homologie armen van elk uiteinde.

Splits de donorsjabloon op in twee segmenten van gBlocks Gene Fragments en monteer ze in een PCR Blunt vector met gibson klonen volgens de instructies van de fabrikant. Transfect 200,000 mESCS met één microgram van het gidsRNA en één microgram van de donorsjablonen in een zesputig plaatformaat. Isoleer vervolgens GFP-positieve cellen met FACS.

Isoleer individuele kolonies voor genotyping volgens manuscriptrichtingen. Gebruik stroomcytometrie om te bevestigen dat de mSE's geen lekkende expressie van GFP hebben en, als ze dat doen, GFP-negatieve cellen isoleren door FACS voordat u met het experiment begint. Breid de cellen uit in vijf platen van 15 centimeter en induceer expressie van wild-type of kooi-mutant EED door het toedienen van 5-micromolar 4-hydroxytamoxifen voor vijf verschillende tijdsduur, variërend van nul uur tot acht dagen.

Verander de media na 12 uur voor behandelingen die langer duren dan dat. Isoleer de met succes gerecombineerde cellen door FACS met behulp van GFP en voer ChIP-seq uit voor H3K27me2 en H3K27me3 om hun tijdelijke afzetting voor chromatine te onderzoeken in reactie op re-expressie van wild-type of kooi-mutant EED. Om de induceerbare reddings- en induceerbare mutantreddingssystemen van het wilde type te valideren, werd westelijke vlek uitgevoerd op hele extracten na inductie van wild-type of kooimutatie EED met 4-hydroxytamoxifen behandeling.

Flow cytometrieanalyse werd gebruikt om de efficiëntie van de T2A-GFP expressie in i-WT-r cellen voor en na de 4-hydroxytamoxixifen behandeling te bevestigen, die de succesvolle flip van de omgekeerde cassette aantoont. ChIP-seq van H3K27me3 werd uitgevoerd na heruitdrukking van wild-type of kooi-mutant EED. De opkomst van H3K27me3 wordt waargenomen op 12 uur na wild-type EED expressie op discrete nucleatie sites en vervolgens op 24 uur op regio's ver van de oorspronkelijke nucleatie sites.

ChIP-seq werd ook gebruikt om de temporele depositie van H3K27me2 te volgen, die lijkt te voorafgaan aan H3K27me3-afzetting. De H3K27me3 foci en hun groei zijn ook gevisualiseerd met fluorescentie microscopie. Na 12 uur van wild-type EED expressie, is er bewijs van H3K27me3 foci vorming.

Deze foci toename in aantal en grootte met 24 uur en uiteindelijk verspreid naar grote regio's van de kern met 36 uur. Het nauwkeurige ontwerp van DNA-constructies is erg belangrijk om het gewenste induceerbare reddingssysteem te genereren. Deze methode kan een tijdelijke en speciale controle van mutaties van eiwitten in muizen.

Op deze manier kan men het effect van mutaties in een specifiek weefsel of in een specifiek ontwikkelingsstadium bepalen. We gebruiken dit systeem momenteel om de dynamische vestiging van een ander chromatinedomein, Polycomb repressief complex 1, te monitoren.