Name: Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Leer een zuiveringsmethode voor menselijk S100A12 en ion-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulatie. Deze techniek levert zuiver, endotoxinevrij eiwit op voor functionele assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gesteund door subsidies van het intramurale Innovative Medical Research Program van Muenster University Medical Faculty (KE121201 to C.K.) en de German Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 tot D.F.).

Opmerking: Zie aanvullende tabel 1 voor de bereiding van buffers en voorraadoplossingen.
1. eiwit expressie in E. coli
<ol><li>
Klonen
	<ol>
<li>Kloon tag-vrije Human S100A12 (referentie sequentie van NCBI: NP_ 005612.1) in bacteriële expressie vector pET11b. Om het eiwit uit te drukken, Transformeer de constructie in E. coli BL21 (DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultuur
	<ol>
<li>Bereid een starter cultuur voor door het inoculeren van een enkele kolonie in 5 mL groeimedium (LB bouillon met 100 μg/mL ampicileen) in een 14 mL ronde bodem buis. Incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 220 rpm. Breng 2 − 4 mL van de overnachtings cultuur over in 400 mL groeimedium in een Erlenmayer kolf van 2 L en inbroed de kweek bij 37 °C met schudden bij 220 rpm. Opmerking: De initiële dichtheid van de hoofd cultuur moet een optische dichtheid zijn bij 600 nm (OD600) = 0,1.</li>
		<li>Bewaak de OD600 tijdens de groei. Induceren van eiwit expressie door toevoeging van 1 M Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tot een eindconcentratie van 1 mM bij OD600 = 0,5 − 0,6. Inincuberen bij 37 °C en 220 rpm voor extra 4 uur. Opmerking: Over het algemeen wordt een OD600 van 0,6 bereikt na 1,5 − 2,5 uur bij 37 °c.</li>
		<li>Bereid 50 mL sonicatie buffer door 50 mM Tris, 50 mM NaCl en 1 mM ethyleendiamine tetraazijnzuur (EDTA) in 40 mL gedeïoniseerd water op te lossen. Pas de pH aan met HCl tot 8,0 en maak tot 50 mL. Voeg proteaseremmer toe (1 tablet per 50 mL oplossing) en equilibreren de buffer tot 4 °C.</li>
		<li>Breng de bacteriecultuur over in geschikte centrifuge flessen en oogst de cellen op 3.200 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c. Gooi de supernatant weg en regeer de pellet in 25 mL ijskoude ultrasoonapparaatbuffer. Houd de cellen voortaan op ijs. Opmerking: Resuspendeerde cellen kunnen bij-20 °C worden bewaard voor kortstondig en bij-80 °C voor de lange termijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonicatie/Lysis
	<ol>
<li>Soniceren de cellen gedurende 6 cycli van 30 s op ijs. Na elke cyclus, rust cellen voor 30 − 60 s om de cellen te beschermen tegen oververhitting.</li>
		<li>Breng de celsuspensie over in een voorgekoelde 50 mL hogesnelheidcentrifugeer buis en centrifugeer in een vaste hoekrotor bij 15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c. Decaner het geclearde lysaat dat de oplosbare cytosolische eiwitten bevat in een verse 50 mL Tube en gooi de pellet weg.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. eiwit zuivering
<ol><li>Chromatografie met anion-uitwisseling
	<ol>
<li>Dialyse<ol>
<li>Bereid anion-uitwisselings chromatografie (AIEX) buffer A door 20 mM Tris, 1 mM EDTA en 1 mM ethyleenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA) op te lossen in gedeïoniseerd water en de pH op 8,5 met HCl aan te passen. Voor dialyse bereiden 2 x 5 L en chromatografie 2x 1 L AIEX buffer A. Opmerking: Het dialysaat-volume moet ongeveer 100 keer het sample volume zijn. Alle buffers die voor chromatografie worden gebruikt, moeten worden gefilterd (0,45 μm of kleiner) en ontgast (bijv. door ultrasoon bad of vacuüm ontgassing).</li>
			<li>Geknipte dialyse slang (de cut-off van het molecuulgewicht [MWCO]: 3,5 kDa) in een passende lengte met extra ruimte voor lucht om het drijfvermogen boven de roterende roerstaaf te verzekeren. Opmerking: Glycerol behoudt het membraan en moet vóór gebruik worden verwijderd.</li>
			<li>Om de viscositeit van de geclearde eiwit oplossing uit stap 1.3.2 te verlagen, Verdun de oplossing met 25 mL AIEX buffer A om de daaropvolgende toepassing in de chromatografie kolom te vergemakkelijken. Bevestig de eerste sluiting op de slang, laad het monster in het membraan en bevestig de tweede sluiting ten minste 1 cm van het bovenste uiteinde van de slang.</li>
			<li>Plaats de 5 L-container met AIEX-buffer A op een roer plaat, voeg een roerstaaf toe en het membraan gevuld met eiwit oplossing. Pas de snelheid aan om het monster te roteren door interferentie met de roterende roer stang te voorkomen. Dialyze voor 12 − 24 uur bij 4 °c, vervang vervolgens de dialysaat buffer (aiex buffer A) door een verse voorgekoelde bereiding en blijf gedurende ten minste 4 extra uren. Breng de dialyzed proteïne-oplossing over naar een buis van 50 mL en filtreer door een filtereenheid van 0,45 μm. Opmerking: Opslag mogelijk.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Chromatografie</li>
		<li>Start het vloeistofchromatografie systeem (FPLC) met algemeen onderhoud, verbind kolom buffers AIEX A en AIEX B (AIEX buffer A met 1 M NaCl) en de anion-uitwisselings hars met kolom. Raadpleeg tabel 1 voor algemene chromatografische parameters. Opmerking: buffers, kolommen en FPLC-apparatuur moeten op dezelfde temperatuur worden gebracht voordat de uitvoering wordt gestart (Zie chromatografische parameters in tabel 1, tabel 2, tabel 3, tabel 4en tabel 5).</li>
		<li>Evenwichts de kolom met aiex-buffer A, laad het monster vervolgens op de kolom en elueer de eiwitten met een lineair verloop van 0% tot 100% hoogzout buffer (aiex B). Raadpleeg tabel 2 voor een gedetailleerd methode protocol.</li>
		<li>Verzamel 2 mL fracties tijdens de elutie en analyseer 10 μL van elke fractie op een Coomassie-gekleurd 15% natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE). Pool de fracties met S100A12 eiwit voor dialyse. Opmerking: Het molecuulgewicht van S100A12 is 10.575 da.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcium-afhankelijke hydrofobe-interactie chromatografie (HIC)
	<ol>
<li>Dialyse<ol>
<li>Dialyseer de eiwit oplossing tegen 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5 volgens de procedure beschreven in punt 2.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Chromatografie<ol>
<li>Bereid 1 L chromatografie buffer HIC A door het oplossen van 20 mM Tris, 140 mM NaCl en 25 mM CaCl2 in gedeïoniseerd water en pas de pH op 7,5. Voor HIC buffer B, los 20 mM Tris, 140 mM NaCl en 50 mM EDTA op. Stel de pH in op 7,0 en filter en Degas de buffers. Voeg CaCl2 toe aan het monster tot een eindconcentratie van 25 mm en filtreer door 0,45 μm. EQUILIBRATE hic buffers en sample tot 4 °c (kolomtemperatuur).</li>
			<li>Start het vloeistofchromatografie systeem met algemeen onderhoud, verbind kolom buffers HIC A en B en de kolom. Zie tabel 3 voor verdere chromatografische parameters.</li>
			<li>Evenwichts de kolom, laad het monster en verleng het blok ' niet-afhankelijke monster ' totdat het UV-signaal opnieuw Baseline niveau bereikt. Begin dan met elutie met een calciumchelator die buffer bevat (EDTA). Raadpleeg tabel 4 voor een gedetailleerd methode protocol. Opmerking: Eerdere experimenten hebben aangetoond dat een overmaat calcium gunstig lijkt te zijn voor de binding van S100A12 aan de chromatografie hars.</li>
			<li>Verzamel piek fracties van 2 mL en analyseer 10 μL van elke fractie op een Coomassie-bevlekt 15% SDS-PAGE. Zwembad zuivere S100A12 fracties en dialyze tegen Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0) zoals beschreven in punt 2.1.1. NB: de extinctiecoëfficiënt van monomerische S100A12 is 2980 M-1 cm-1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. detectie en verwijdering van endotoxine
<ol><li>
Detectie van endotoxine
	<ol>
<li>Om de endotoxine besmetting te bepalen, meet u de concentraties van verdund eiwit uit stap 2.2.2.4. (bijv. 1:10 en 1:100 in HBS) met behulp van een enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)-gebaseerde, fluorescerende endotoxine detectie test (tabel met materialen). Voer deze test uit door het Protocol van de fabrikant te volgen. Opmerking: Gebruik vers bereide HBS-oplossingen opgelost in ultrapuur gedeïoniseerd water om (nieuwe) endotoxine verontreiniging door de buffer te voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verwijdering van endotoxine en concentratie van eiwitten
	<ol>
<li>Laad 15 mL monster op een centrifugale filter unit 50 kDa en centrifugeer ongeveer 10 minuten bij 3.200 x g en 10 °C. Breng de doorstroom in een nieuw vat (op ijs) en centrifugeer de 50 kDa filter buis zo vaak als nodig. Was het filtermembraan tweemaal met HBS om zoveel mogelijk eiwitten na elke stap te herstellen.</li>
		<li>Concentreer de S100A12-bevattende doorstroming met behulp van een 3 kDa-centrifugale filter totdat het volume tot een vijfde wordt teruggebracht tot een tiende van het initiële laadvolume (centrifugeren bij 3.200 x g, 10 °c gedurende ongeveer 30 minuten). Vul het filter zo vaak als nodig in, spoel het membraan en breng de geconcentreerde oplossing over naar een nieuwe buis na elke vulling. Gooi de doorstroming weg. Filter opnieuw via 50 kDa zoals hierboven beschreven. Opmerking: Tijdens deze procedure is het verlies van eiwitten opmerkelijk (tot 50%), maar het resterende eiwit preparaat is volledig uitgeput van LPS. Deze methode levert ongeveer 10 − 15 mg eiwit uit 400 mL cultuur.</li>
		<li>Stel de eiwit oplossing in op 1 mg/mL met endotoxine vrije HBS en meet het LPS-gehalte zoals beschreven in stap 3.1.1. In het geval dat de eiwit oplossing nog steeds niet wordt getest als LPS-vrij (< 0.1 EU/mL), Elimineer restant verontreinigingen met behulp van een endotoxine verwijderings hars. Opmerking: Met een eiwitconcentratie van 1 mg/mL is besmetting van 0,1 EU/mL LPS gelijk aan ongeveer 0,01 PG LPS/μg eiwit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. chemische crosslinking en Oligomer scheiding
<ol><li>
Chemische crosslinking
	<ol>
<li>Bereid zeer zuivere (endotoxine-vrije) stockoplossingen van 1 M CaCl2 en 100 mm zncl2 in ultrapuur gedeïoniseerd water (tabel met materialen). Gebruik deze buffer, vers gemaakt, voor de volgende stap.</li>
		<li>Incubeer 10 mL gezuiverde endotoxine vrije S100A12 (concentratie 1 mg/mL in HBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) met 25 mM CaCl2 voor dimeric/tetrameric, of 25 mm CACL2 en 1 mm zncl2 voor HEXAMERIC/tetrameric S100A12 Oligomeren.</li>
		<li>Bereid als door het oplossen van 8 mg BS3 in 500 μL endotoxine-vrij water direct voor gebruik (8 mg als voor 10 ml Ion-spiked eiwit oplossing is gelijk aan een uiteindelijke concentratie van 1,4 mm). Meng als en monster door pipetteren en inbroed voor extra 30 min bij RT. Quench de reactie door 1 M Tris-HCl toe te voegen, pH 7,5 tot een eindconcentratie van 50 mm en filtreer door 0,45 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Grootte-uitsluitings chromatografie
	<ol>
<li>Het kruikoppelde monster wordt op 12 − 15 °C (kolomtemperatuur) en start het vloeistofchromatografie systeem met algemeen onderhoud. Verbind kolom buffer (HBS) en de kolom voor grootte uitsluiting. Raadpleeg tabel 5 voor gedetailleerde informatie.</li>
		<li>Evenwichts de kolom in HBS, laad monster en verzamel piek fracties (1 − 2 mL) tijdens de run. Analyseer deze fracties op een 4 − 20% gradiënt SDS-PAGE en pool fracties met grote banden van het gewenste proteïne complex. Opmerking: Hydrolyse van NHS-Ester reagentia, zoals BS3 in waterige oplossingen, resulteert in een sterke extinctie bij 280 nm. Ongebonden als (moleculair gewicht: 572 g/mol) afdempt aan het einde van de run en resulteert in een sterke piek.</li>
		<li>Concentreer de oplossingen met behulp van centrifugale filter units met MWCOs van 10 kDa (dimer), 30 kDa (Tetramer) of 50 kDa (hexamer). Bepaal de endotoxine contaminatie zoals beschreven in punt 3,1. Verwijder indien nodig resterende LP'S met een endotoxine verwijderings hars volgens de aanbevelingen van de fabrikant (tabel van de materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. functionele testen op monocyten
<ol><li>Bereiding van monocyten
	<ol>
<li>Isoleer monocyten van menselijke Buffy jassen door dichtheidsgradiënt centrifugeren en daaropvolgende monocyt verrijking met behulp van een magnetische kraal separatie Kit (tabel van materialen). Opmerking: Dit protocol zal resulteren in ongeveer 5 − 7 x 107 monocyten (één buffycoat) met een zuiverheid van 83 − 95%. Aangezien het aantal, maar ook de responsiviteit van de cellen sterk afhangt van de donor, moet het protocol mogelijk worden opgeschaald (afhankelijk van het aantal vereiste aantallen).</li>
		<li>Voor dichtheids centrifugeren wordt de separatieoplossing (dichtheid = 1,077 g/mL) naar RT en breng 20 mL over in 50 mL centrifugebuizen (2 tubes per buffy coat). Verdun bloed uit de menselijke buffy coat met de gebufferde zoutoplossing van Hank (HBSS) tot een totaal volume van 60 mL en laag 30 mL van dit mengsel voorzichtig bovenop het scheidings medium. Centrifugeer bij 550 x g voor 35 min bij RT. Schakel de centrifuge-rem uit.</li>
		<li>Na centrifugeren bevinden de mononucleaire perifere bloedcellen (PBMCs) zich direct bovenop het scheidings medium. Breng deze cellen over in een nieuwe centrifugebuis van 50 mL, maak tot 50 mL met HBSS en centrifugeer bij 170 x g gedurende 10 minuten. aspireren van de supernatant en hervatten van de celpellet in een klein volume van HBSS door pipetteren.</li>
		<li>Vul de buis tot 50 mL en centrifugeer bij 290 x g gedurende 10 min. aspireren de supernatant opnieuw, Redigeer de cellen in HBSS (50 ml) en centrifuge bij 170 x g gedurende 10 min. Tel de cellen en hervat ze in Celscheidings buffer (tabel met materialen < /C9 >) tot een concentratie van 5 x 107 cellen/ml. Opmerking: In plaats van HBSS kan fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) worden gebruikt voor het wassen van de cellen.</li>
		<li>Voor monocyt-isolatie van PBMCs gebruikt u een magnetische negatieve cel isolatie kit en volgt u het Protocol van de fabrikant. Graaf monocyten en respenderen in monocyt medium (rpmi 1640, 15% warmte-geïnactiveerd foetaal kalf serum [FCS], 4 mm L-glutamine, 100 U/ml penicillaire/streptomycine) tot een concentratie van 2 x 106 cellen/ml.</li>
		<li>Cultuur monocyten, Coat cultuur gerechten (bijv. 100 mm) met een hydrofobe, gasdoorlatbare film, geschikt voor suspensie cellen (tafel van materialen). Steriliseer de platen met UV-licht gedurende ongeveer 30 min. Breng de cellen over naar deze kweek platen en laat ze 's nachts rusten bij 37 °C en 5% CO2. Opmerking: Gebruik 15 − 25 mL celsuspensie per gecoate schaal.</li>
	</ol></li>
	<li>Monocyt stimulatie
	<ol>
<li>Stimulatie met S100A12 (wild type) Opmerking: Om onbehandelde S100A12 (eindproduct uit punt 2.2.2) van kruisgebonden eiwitten te onderscheiden, wordt S100A12 in het volgende aangeduid als "wild type".<ol>
<li>Breng de uitgerust cellen over in een centrifugale buis van 50 mL en centrifugeer bij 350 x g gedurende 10 minuten. aspireren de supernatant en reactiveren van de celpellet in stimulatie medium (rpmi 1640, 5% Heat-GEÏNACTIVEERD FCS, 4 mm L-glutamine, 100 U/ml penicillaire/ streptomycine) bij een concentratie van 2 x 106 cellen/ml.</li>
			<li>Gebruik voor stimulatie 24 goed geveerde platen en voeg 250 μL celsuspensie per goed toe (0,5 x 106 cellen/goed). Voeg 50 μg/mL Polymyxine B toe aan de beoogde putjes, gevolgd door ofwel LPS in verschillende concentraties (25, 50, 100 en 200 PG/mL) of wild type S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/mL). Verder, breng het eiwit ofwel onbehandeld of hitte-gedenatureerd (99 ° c, 10 min) in verschillende concentraties aan de cellen. Opmerking: Een korte hittebehandeling denaturen S100A12 eiwit, maar heeft minder tot geen effect op LPS.</li>
			<li>Incuberen de platen gedurende 4 uur bij 37 °C en 5% CO2. Oogst de cellen door het overbrengen van de celsuspensie van elke put naar 1,5 mL reactie buisjes. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 min. Breng de supernatanten over naar verse buisjes en meet de tnfα-afgifte in verschillende verdunningen (bijv. 1:2, 1:5, 1:10) met een humane tnfα-ELISA-kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Stimulatie met S100A12 oligomeren<ol>
<li>Bereid en zaad uit monocyten in 24 goed geveerde platen zoals hierboven beschreven. Stimuleer cellen door S100A12 oligomeren uit stap 4.2.3 toe te voegen. in verschillende molaire concentraties (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM). Opmerking: Om de capaciteiten van de verschillende oligomeren te vergelijken om monocyten te stimuleren, werden oligomeren toegepast op de cellen in vergelijkbare molaire concentraties.</li>
			<li>Inbroed voor 4 uur bij 37 °c en 5% Co2, oogst de cellen en meet de tnfα-afgifte in de supernatanten zoals hierboven beschreven.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li>
<li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation%3A+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li>
<li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron%28ii%29+binding+to+human+calprotectin%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+human+%28S100A8%2FS100A9%292+heterotetramer%2C+calprotectin%2C+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Ca2%2B+and+Zn2%2B+are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11(2009).</li>
<li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha%2C+S100a+%28alpha+beta%29%2C+and+S100b+%28beta+beta%29+protein%3A+Zn2%2B+regulates+Ca2%2B+binding+on+S100b+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li>
<li>Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C%2C+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li>
<li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li>
<li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis%3A+a+central+cell+surface+receptor+for+S100%2Fcalgranulin+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li>
<li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li>
<li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li>
<li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells%3A+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li>
<li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Strategies+for+Protein+Purification.+Handbook%22">Strategies for Protein Purification. Handbook</a>. , Freiburg, Germany. (2010).</li>
<li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+Purification%2C+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li>
<li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li>
<li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li>
<li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+removal+from+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li>
<li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li>
<li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+Ca2%2B-bound+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li>
<li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+-+Sartorius+Stedim+Biotech%22">Application Note - Sartorius Stedim Biotech</a>. , (2010).</li>
<li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li>
<li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha%2FNF-kappa+B+and+ERK1%2F2+pathways+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li>
<li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol beschrijven we tag-vrije bacteriële expressie van menselijke S100A12 en de zuivering ervan, evenals scheiding in verschillende ionen-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulatie. Vergeleken met gepubliceerde literatuur over S100A12 proteïne zuivering8,23,24, het gebruik van hoge CACL2 (25 mm) in hydrofobe-interactie chromatografie is onze kennis uniek. Verschillende protocollen die concentraties va...

S100A12 is een calcium bindend eiwit dat voornamelijk wordt geproduceerd door menselijke granulocyten. Het eiwit wordt overgedruct tijdens (systemische) ontsteking en de serumspiegels, met name bij (auto) ontstekingsziekten zoals systemische juveniele idiopathische artritis (sJIA), familiaire mediterrane koorts (FMF) of ziekte van Kawasaki (KD) kan informeren over ziekteactiviteit en respons op de therapie. Afhankelijk van patroonherkenning receptoren (PRRs) zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), het aangeboren immuunsysteem kan worden geactiveerd door pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) zoals lipopolysacchariden (LPS) of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs; ook wel ' alarmin ' genoemd). DAMPs zijn endogene moleculen zoals cellulaire eiwitten, lipiden of nucleïnezuren1. Vocht-functies zijn goed beschreven voor de leden van de calgranulin proteïne familie, S100A8/A9 en S100A122, die ook worden gerapporteerd om te werken als divalente metalen Ion-chelerende antimicrobiële peptiden3,4, 5,6. Afhankelijk van de beschikbare ionensterkte kan S100A12, net als andere leden van de S100-familie, verschillende homomultimers regelen en tot voor kort was de impact van S100A12-oligomerisatie op PRR-interactie, in het bijzonder TLR4, onbekend.
Het eiwit monomere vorm (92 aminozuren, 10,2 kDa) bestaat uit twee EF-hand Helix-lus-Helix structuren verbonden door een flexibele linker. De C-Terminal EF-hand bevat het klassieke CA2 +-bindende motief, terwijl de N-terminale EF-hand een S100 eiwit-specifieke verlengde LUSSTRUCTUUR (' pseudo-EF-hand ') vertoont en een gereduceerde CA2 +-affiniteit onthult. CA2 +-binding door S100A12 kan leiden tot een belangrijke conformationele verandering in het C-terminus van de eiwitten, wat resulteert in blootstelling van een hydrofobe pleister op elk monomeer en vormt de door dimerisatie-interface. Zo is de kleinste Kwartaire structuur, gevormd door S100A12, onder fysiologische omstandigheden, een niet-covalente dimeer (ongeveer 21 kDa) waarin individuele monomeren in anti parallelle oriëntatie zijn. Wanneer gerangschikt als dimer, wordt S100A12 gerapporteerd aan onttrokken Zn2 + en andere divalente metaalionen, bijvoorbeeld Cu2 + met hoge affiniteit7. Deze ionen worden gecoördineerd op de S100A12 dimeer-interface door aminozuren H15 en D25 van een subeenheid en H85, evenals H89 van de anti-paralleling andere subeenheid8,9,10. Terwijl eerdere studies voorstellen datZn 2 +-loaded S100A12 de eiwit organisatie kan induceren in homo-tetramers (44 kDa) en resulteert in een verhoogdeca 2 +-affiniteit11,12, recente metaal titratie studies6 suggereren CA2 +-binding door S100A12 om de eiwit affiniteit te verhogen tot Zn2 +. Zodra de S100A12 EF-handen volledig bezet zijn door CA2 +, wordt extra CA2 + verondersteld te binden tussen dimers, triggering hexamer vorming (ongeveer 63 kDa). De architectuur van de hexamerische Kwartaire structuur verschilt duidelijk van die van de Tetramer. Er wordt voorgesteld dat de tetrameer-interface wordt verstoord om nieuwe dimer-dimer-interfaces te geven die de voordelen van hexamer-formatie10hebben. S100A12 wordt bijna uitsluitend uitgedrukt door menselijke Granulocyten, waar het ongeveer 5% van alle cytosolische eiwitten13vormt. In zijn VOCHTIGE functie werd S100A12 historisch beschreven als agonist van de multi-ligand receptor voor geavanceerde glycation end-producten (RAGE), dan genoemd extracellulaire nieuw geïdentificeerde RAGE-bindende proteïne (EN-RAGE)14. Hoewel we eerder meldden biochemische S100A12-binding aan zowel woede en TLR415, we onlangs aangetoond menselijke monocyten om te reageren op S100A12 stimulatie op een TLR4-afhankelijke manier16. Dit vereist arrangement van S100A12 in zijn CA2 +/Zn2 +-geïnduceerde hexameer Kwartaire structuur16.
Hier beschrijven we een zuiverings procedure voor recombinant humaan S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulaties16,17. Dit is gebaseerd op een tweestapschromatografie strategie, die in eerste instantie een anion-uitwisselings kolom bevat om het eiwit te isoleren en te concentreren en bulk verontreinigingen te verwijderen (bijv. endotoxinen/lipopolysacchariden)18. Ionenwisselingschromatografie harsen scheiden eiwitten op basis van verschillende netto oppervlakte heffingen. Voor zure eiwitten zoals S100A12 (isoelektrisch punt van 5,81), een buffersysteem met een pH van 8,5 en een sterke anionenwisselingshars leidt tot een goede scheiding. Gebonden eiwitten werden geellueerd met een hoogzout buffer gradiënt. Met een toename van Ionische kracht negatieve ionen in de elutie buffer concurreren met eiwitten voor ladingen op het oppervlak van de hars. Eiwitten individueel Elueer afhankelijk van hun netto-lading en in het resultaat daarvan, de buffers beschreven hierin laten toe om te isoleren en te concentreren de overexpressie S100A12 eiwit. Als gevolg van negatief geladen groepen in lipopolysacchariden, deze moleculen binden ook aan anion-uitwisseling harsen. Echter, hun hogere nettolading resulteert in latere elutie in de toegepaste hoogzout gradiënt. De tweede stap van de zuiverings procedure is ingevoerd voor polijst doeleinden. Dit maakt gebruik van het calcium bindings vermogen van S100A12 en verwijdert achtergebleven onzuiverheden op een hydrofobe-interactie kolom. Calcium binding van S100A12 leidt tot een conformationele verandering en een blootstelling van hydrofobe vlekken op het oppervlak van het eiwit. Op die voorwaarde communiceert S100A12 met het hydrofobe oppervlak van de hars. Bij calcium-chelaat door EDTA wordt deze interactie omgekeerd. In aanwezigheid van ionen, met name calcium en zink, regelt S100A12 de homomerische oligomeren. Om de structuur functie relaties van de verschillende oligomeren te bestuderen, stabiliseerde men dimeric, tetramere en hexameer recombinant S100A12 met een chemische als en scheidde de complexen op een grootte-uitsluitings chromatografie kolom. Tot slot, om de functionaliteit en biologische activiteit van het gezuiverde eiwit en de ionen-geïnduceerde oligomeren te analyseren, kan de cytokine-afgifte van S100A12 en LPS gestimuleerd monocyt worden vergeleken.
Verschillende methoden voor het zuiveren van S100A12 zijn tot nu toe beschreven. Jackson et al.19publiceerde bijvoorbeeld een protocol met zuivering via een anion-uitwisselings kolom en een daaropvolgende grootte-uitsluitings chromatografie. Het polijsten van zuivering op een kolom met grootte uitsluiting leidt tot goede resultaten, maar ― vanwege bijvoorbeeld beperkte laadvolumes ― is minder flexibel in schaalbaarheid. Een andere aanpak, gepubliceerd door Kiss et al.20, beschrijft de zuivering van gelabelde eiwitten via ni2 + affiniteits kolom als de eerste zuiveringsstap, gevolgd door enzymatische splitsing om de tag en verdere zuiveringsstappen te verwijderen. In tegenstelling tot de avooropgestelde studies19,20, wordt het geproduceerde eiwit zoals beschreven in dit protocol bepaald voor experimenten met immuuncellen. Daarom is restant endotoxine besmetting van bacteriële cultuur een uitdaging. Hoewel er tot dusver verschillende benaderingen voor de verwijdering van endotoxine zijn beschreven, is er geen uniforme methode die even goed werkt voor een bepaalde eiwit oplossing21,22.
Kortom, ons protocol combineert de voordelen van een tagvrije expressie in een bacterieel systeem met efficiënte endotoxine verwijdering en hoge opbrengst van zuivere eiwitten.

<table><tbody><tr><td>pET11b vector</td><td>Novagen</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3) competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>100x Non-essential amino acids</td><td>Merck</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25% HCl</td><td>Carl Roth</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4&minus;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td><td>BioRad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td>Magnetic negative cell isolation kit</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>Endotoxin detection assay</td></tr><tr><td>Endotoxin-Free Ultra Pure Water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-011-A</td><td>Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers</td></tr><tr><td>EndoTrap red</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>Endotoxin removal resin</td></tr><tr><td>FBS (heat-inactivated)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Carl Roth</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (high quality, endotoxin testet)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranosid)</td><td>Carl Roth</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Merck</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5</td><td>Merck</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, human</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td>Separation solution (density gradient centrifugation)</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Merck</td><td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>Phenyl Sepharose High Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1082-01</td><td>Resin for hydrophobic interaction chromatography</td></tr><tr><td>Polymyxin B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Resin for anion-exchange chromatography</td></tr><tr><td>RoboSep buffer</td><td>Stemcell</td><td>20104</td><td>Cell separation buffer (section 5.1.4)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Merck</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Carl Roth</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Carl Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Zinc chloride</td><td>Carl Roth</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro;m syringe filter</td><td>Merck</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 mL roundbottom tubes</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2 L Erlenmyer flask</td><td>Carl Roth</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>24 well suspension plates</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>5 L measuring beaker</td><td>Carl Roth</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Culture dish (100 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis Tubing Closures</td><td>Spectrum</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>EasySep magnet 'The Big Easy`</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector tubes 5 mL</td><td>Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Lumox film, 25 &micro;m, 305 mm x 40 m</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>Film for monocyte culture plates</td></tr><tr><td>Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa)</td><td>Spectrum</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Steritop filter unit</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C Incubator (with shaking)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA purifier UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC System</td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (with rotor A-4-81)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Fixed angle rotor</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence reader</td><td>Tecan</td><td>infinite M200PRO</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

zuivering van de menselijke s100a12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulatie

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

In dit protocol beschrijven we een methode om humaan calcium bindende proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren te zuiveren van de Escherichia coli -cultuur voor immuuncelstimulaties. Dit protocol is gebaseerd op een tweestapschromatografie strategie, die bestaat uit eiwit voorzuivering op een anion-uitwisselings chromatografie kolom en een daaropvolgende polijst stap op een hydrofobe-interactie kolom. Deze strategie produceert S100A12 eiwit van hoge zuiverheid en rendement tegen beheersbare kosten. Voor functionele assays op immuuncellen vereist uiteindelijke restant endotoxine besmetting zorgvuldige controle en verdere reinigingsstappen om endotoxine vrij eiwit te verkrijgen. De meerderheid van de endotoxine verontreinigingen kan worden uitgesloten door een anion-uitwisselings chromatografie. Om rest verontreinigingen uit te putten, beschrijft dit protocol een verwijderings stap met centrifugale filters. Afhankelijk van de beschikbare Ion-sterkte S100A12 kan regelen in verschillende homomultimers. Om de relatie tussen structuur en functie te onderzoeken, wordt dit Protocol verder beschreven Ion-behandeling van S100A12 eiwit, gevolgd door chemische crosslinking te stabiliseren S100A12 oligomeren en hun daaropvolgende scheiding door grootte-uitsluiting Chromatografie. Ten slotte beschrijven we een cel-gebaseerde assay die de biologische activiteit van het gezuiverde eiwit bevestigt en LPS-vrije voorbereiding bevestigt.

Na pre-zuivering op de AIEX-kolom (Figuur 1a-C) en daaropvolgende calcium-afhankelijke hic (Figuur 2a, B) werd zeer zuivere eiwitten verkregen (figuur 2c). Bovendien onthulde metingen van endotoxine succesvolle LPS verwijdering. De LPS-inhoud na AIEX werd gemeten in een 1:10-verdunning boven de detectiegrens van de Assay, d.w.z. boven 500 EU/mL. Na de eerste filtratie door een 50 kDa filter unit wer...

Dit protocol beschrijft een zuiveringsmethode voor recombinant tag-vrij calcium bindend proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor humane monocyt stimulatie testen.

Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Dit protocol beschrijft een volledige zuiveringsprocedure voor het menselijk calciumbindingeiwit, S100A12, en in het bijzonder voor het verschillende ionen-geïnduceerde oligomers voor downstream onderzoeksimplicaties. Met deze techniek zijn we in staat om een hoog rendement van zeer zuiver en endotoxinevrij eiwit te behouden. Chemische kruisverkoppeling en scheiding op de grootte uitsluiting chromatografie kolom is een overtuigende methode om homo-oligomeric eiwitten te genereren voor verdere functionele testen.Onze techniek stelt ons in staat om mechanistische aspecten van S100A12 als patroonherkenningsreceptor en kunstinformatie te maken om idealiter nieuwe gerichte interventies te ontwikkelen en diagnostische testen te verbeteren. Naast het bekijken van deze video, raden we een zorgvuldige lezing van het protocol aan, omdat we een complexe procedure in meerdere stappen beschrijven. Om te beginnen, snijd een dialyse slang in een geschikte lengte, ongeveer 30 centimeter, met extra ruimte voor lucht.Week het membraan 15 tot 30 minuten in gedeïmioneerd water om glycerol te verwijderen. Om de viscositeit van de geklaarde eiwitoplossing te verminderen, verdun de oplossing met 25 milliliter AIEX-buffer A.Bevestig de eerste sluiting op de slang. Laad het monster in het membraan en bevestig de tweede sluiting ten minste één centimeter van de bovenkant van de slang.In een gekoelde kamer op vier graden Celsius, plaats de container met AIEX buffer A op een roerplaat, voeg een roerstaaf, en het membraan gevuld met eiwit oplossing. Pas de snelheid aan om het monster te draaien, zodat er geen interferentie is met de roterende roerbalk. Dialyze voor 12 tot 24 uur bij vier graden Celsius vervang dan de gedialyseerde buffer door gratis voorgekoelde buffer A en ga minstens vier uur langer door.Breng de gedialyseerde eiwitoplossing uit de slang in een buis van 50 milliliter door een filtereenheid van 0,45 micron. Start de FPLC met algemeen onderhoud. Sluit kolombuffers AIEX A en AIEX B aan bufferkleppen en anionuitwisselingskoeren met kolom naar de kolompoorten van de FPLC.Pas de algemene chromatografische parameters dienovereenkomstig aan. Start het AIEX-programma in de FPLC-software en kies het evenwichtsvolume voor buffer A.Vervolgens laadt u het monster op de kolom en ontlast u de eiwitten met een lineair verloop van 0% tot 100% hoge zoutbuffer. Verzamel twee milliliter fracties tijdens elutie.Analyseer de geëuterde breuken na het beëindigen van de run. Laad hiervoor 10 microliter van elke fractie op een Door Coomassie gekleurde 15%SDS-pagina en identificeer fracties met S100A12. Bundel deze S100A12 met fracties voor dialyse in TRIS-gebufferde zoutoplossing.Om de eiwitzuivering voort te zetten, voeg na de eiwitdialyse een calciumchloride toe aan het monster aan een uiteindelijke concentratie van 25 millimolar, wat de binding van S100A12 aan de hars in de volgende stap zal vergemakkelijken. Vervolgens filtert u het monster door een filter met een gietgrootte van 0,45 micron. Equilibrate HIC buffers en monsters tot vier graden Celsius.Sluit vervolgens kolombuffers HIC A en B en de kolom aan op het systeem en pas de parameters aan. Start de methode om de kolom te equiliben met één tot twee kolomvolumes van buffer HIC A en laad het monster en het ongebonden monsterblok wassen met een UV-signaal bereikt opnieuw het basisniveau. Begin dan met elutie met een calciumchelator met buffer EDTA.Verzamel twee milliliter piekfracties tijdens elutie. Na het analyseren van 10 microliters van elke fractie op een Coomassie gekleurd 15%SDS pagina identificeren pure S100A12 fracties. Pool deze fracties en dialyze tegen HBS.Laad eerst 15 milliliter monster op een 50 kilodalton centrifugaalfiltereenheid. Centrifuge op 3200 keer g bij 10 graden Celsius gedurende ongeveer 10 minuten. Breng de gefileerde doorstroom over in een vers vat, op ijs.Gebruik nu een milliliter HBS om het filtermembraan te spoelen en voor verdunning van de geconcentreerde oplossing in de filterpunt. Centrifuge opnieuw om zo veel mogelijk eiwit in de stroom-door te herstellen. Om de oplossing te filteren, herhaalt u de monsterbelasting en centrifugatie zo vaak als nodig is.Vervolgens om de S100A12 met flow-through te concentreren, laad het in een drie kilodalton centrifugaalfilter en centrifuge op 3200 keer g, 10 graden Celsius gedurende ongeveer 30 minuten. Nu wordt het volume teruggebracht tot 1/5 tot 1/10 van het initiële laadvolume. Breng de geconcentreerde oplossing over op een nieuwe buis.Herhaal de concentratiestap zo vaak als nodig is. Na chemische cross-linking, volgens het manuscript, uit te voeren grootte uitsluiting chromatografie. Equilibrate de kolom in HBS, laad het monster, en het verzamelen van piekfracties van een tot twee milliliter tijdens de run.Na het analyseren van deze breuken op een vier tot 20% gradiënt SDS-pagina, pool fracties met grote banden van het gewenste eiwitcomplex. Concentreer vervolgens de oplossingen zoals eerder gedaan. Om monocyten van menselijke buffylagen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie te isoleren, eerst de scheidingsoplossing aan ruimtetemperatuur in evenwicht brengen.Breng 20 milliliter in 15 milliliter centrifugebuizen, twee buizen per buffy jas. Verdun het bloed van de menselijke buffy jas met HBSS tot een totaal volume van 60 milliliter en laag 30 milliliter van dit mengsel zorgvuldig op de top van het scheidingsmedium. Centrifuge op 550 keer g gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur.Zet de rem van de centrifuge uit. Na centrifugatie bevinden de mononucleaire perifere bloedcellen zich direct bovenop het scheidingsmedium. Breng deze cellen met een pipet over in een verse centrifugebuis van 50 milliliter.Vul de buis met HBSS tot 50 milliliter en centrifuge op 170 keer g gedurende 10 minuten. Aspirate de supernatant en resuspend de cel pellet in een klein volume van HBSS door pipetting. Vul vervolgens de buis tot 50 milliliter en centrifuge 10 minuten lang op 290 keer g.Aspirate de supernatant weer. Resuspend de cellen in 50 milliliter HBSS en centrifuge op 170 keer g gedurende 10 minuten. Aspirate de supernatant en resuspend de cel pellet in een klein volume van een milliliter van de scheiding buffer, tel de cellen, en buffer toe te voegen aan een concentratie van vijf keer 10 tot de zeven cellen per milliliter.Voor monocytenisolatie van mononucleaire perifere bloedcellen, gebruik maken van een magnetische negatieve cel isolatie kit en volg het protocol van de fabrikant. Gebruik een geautomatiseerde celteller om de monocyten te tellen en opnieuw op te nemen in monocytmedium tot een concentratie van twee keer 10 tot de zes cellen per milliliter. Om monocyten te kweken, leg je een celkweekschotel op met een hydrofobe gas doorlatende film die geschikt is voor suspensiecellen.Plaats de platen ongeveer 30 minuten onder UV-licht voor sterilisatie. Breng 15 tot 25 milliliter van de celsuspensie over naar deze kweekplaten en laat ze 's nachts rusten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Na pre-zuivering op de AIEX kolom en de daaropvolgende calcium afhankelijke HIC, zeer zuiver eiwit werd verkregen.Als extra controle werden menselijke monocyten gestimuleerd met LPS en geproduceerde wild-type eiwit. Eiwitblootstelling aan verschillende ionen resulteert in een rangschikking van verschillende S100A12 oligomers. Toenemende zinkconcentraties veroorzaken de opstelling van S100A12 in tetramers en hexamers bij scheiding op vier tot 20%Coomassie bevlekte SDS-pagina.Wanneer een overmaat aan ionen werd toegepast voorafgaand aan cross-linking, veroorzaakte het een uitgesproken verschuiving van het oligomerevenwicht. S100A12 was cross-linked in aanwezigheid van 25 millimolar calcium of 25 millimolar calcium en een millimolar zink. Na kruisverkoppeling in HBS buffer met 25 millimolar calciumchloride en één millimolar zinkchloride, werden hexamer en tetramer gescheiden.Tetramer en dimer werden gescheiden in HBS buffer met 25 millimolar calciumchloride. Een voorbeeld van gepoolde en geconcentreerde oligomers na scheiding op een Coomassie bevlekt vier tot 15% gradiënt SDS pagina toont dimer, tetramer, en hexamer. Monocyten stimulatie met hexamerische S100A12 resulteerde in uitgesproken TNF alpha release.Na verwijdering van endotoxine is het belangrijk om besmetting niet opnieuw in de monsters te introduceren tijdens de volgende generatie en zuivering van de oligomeren. Downstream analyse van elk proces dat betrekking heeft op S100A12 oligomerization is denkbaar. Op dezelfde manier kunnen aminozuren en ionenvoorwaarden die het oligomerisatieproces zelf beïnvloeden, worden geanalyseerd.We gebruiken momenteel S100A12 oligomers gescheiden volgens het beschreven protocol om specifieke peptide liganden en antilichamen te ontwikkelen om de signalering van het eiwit via TLF4 te blokkeren en diagnostische testen te ontwikkelen en te verbeteren.

purification-human-s100a12-its-ion-induced-oligomers-for-immune-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

In this video, we demonstrate an anion-exchange chromatography technique to purify human calcium-binding protein S100A12 based on the net surface charge of the protein from an Escherichia coli culture.

Anion-Exchange Chromatography-Based Protein Purification: A Separation Technique to Isolate a Protein of Interest From Dialyzed Bacterial Lysate Based on Net Charge

In this video, we demonstrate the purification of calcium-binding protein from a dialyzed cell lysate through calcium-dependent hydrophobic interaction chromatography. The calcium-binding proteins expose a hydrophobic region upon binding with calcium, facilitating interaction with a hydrophobic group on resin. Later these proteins are eluted using calcium chelator EDTA that reverses the interaction.

Calcium-Dependent Hydrophobic Interaction Chromatography: A Technique to Purify Calcium-Binding Proteins Based on Hydrophobic Interactions

Hier presenteren we een methode om S100A12 (Calgranulin C) uit te drukken en te zuiveren. We beschrijven een protocol om zijn antimicrobiële activiteit tegen het menselijke pathogeen H. pylori te meten.

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

MALT1 regelt aangeboren immuniteit, maar hoe dit gebeurt blijft vaag. We gebruikten de selectieve MALT1 paracaspase remmer MLT-827 te ontrafelen van de bijdrage van MALT1 aan het aangeboren signalering stroomafwaarts van Toll-like of C-type lectine-achtige receptoren, aan te tonen dat MALT1 de productie van myeloïde cytokines regelt, en "downstream" C-type lectine-achtige receptoren, selectief.

Myeloïde aangeboren signalering Pathway regelgeving door MALT1 Paracaspase activiteit

In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.

Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches

We beschrijven een in vivo immunisatie, translationeel hepatitismodel in BALB / c-muizen dat kan worden gebruikt om de pathogenese van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te bestuderen, inclusief geslachtsverschillen die bij deze ziekte worden waargenomen. We zullen beschrijven hoe dit model reproduceerbare analyses demonstreert met behulp van in vivo en in vitro experimentele technieken.

Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

Hier wordt een gedetailleerde methode beschreven die de zuivering, refolding en karakterisering van zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (Sapn's) beschrijft voor gebruik bij de ontwikkeling van vaccins.

Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

We presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed verkregen van patiënten met de diagnose Sézary-syndroom, gevolgd door selectie van CD4 + T-cellen, hun stimulatie met phorbol12-myristate13-acetaat en A23187 ionofoor, en voorbereiding van RNA voor transcriptomische profilering.

Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.

In vitro Cellulaire activiteit Evaluatie van het nano-emulsievaccin Adjuvans Ophiopogonine D

Er wordt een uniek, uitgebreid protocol gepresenteerd voor het genereren van gedesialyleerde humane monocyt-afgeleide dendritische cellen (mo-DC's) uit geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van een sialidasebehandeling. Verder worden methoden beschreven om de fenotypische en functionele karakterisering van mo-DC's te beoordelen en te evalueren hoe behandeling met sialidase het rijpingsniveau van mo-DC's verbetert.

Generatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen met verschillende gesialyleerde fenotypes

Leer een zuiveringsmethode voor menselijk S100A12 en ion-geïnduceerde oligomeren voor immuuncelstimulatie. Deze techniek levert zuiver, endotoxinevrij eiwit op voor functionele assays.

Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie

Meer video's verkennen