SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

SUMO-bindende entiteiten maken het mogelijk om endogene SUMOylated eiwitten in vivo te isoleren. Dit is nogal uitdagend vanwege de aanwezigheid van actieve SUMO-specifieke protease en de lage fracties van sumoylated eiwitten in vivo. De isolatie van het sommoylated proteoom door het gebruik van SUMO-bindende entiteiten is voordelig omdat het een toename van de algehele affiniteit voor SUMO substraten uitstelt.

Dit is te wijten aan het feit dat SUBEs komen vaak voor in eiwitten die bestaan uit tandem herhalingen van SSI's waardoor specifiek SUMO moleculen op gemodificeerde eiwitten te herkennen. Het gebruik van SUMO-bindende entiteiten voor de isolatie en karakterisering van het sommoylace bij leverkanker is een snelle en gevoelige methode. Het biedt informatie uit het verleden over de vrij onbekende rol van de SUMOylation-route bij leverkanker in een potentiële therapeutische benadering.

SUMO-bindende entiteiten kunnen worden gebruikt om het sumoylated proteoom in andere weefsels naast de lever te isoleren en te karakteriseren, zowel van menselijke specimens als dierlijke modellen, evenals in verschillende cellulaire modellen. Hoewel deze techniek is gemakkelijk uit te voeren, zorg moet worden genomen bij het analyseren van verschillende monsters op hetzelfde type. koeler kubus aan de verschillende stappen betrokken.

Daarom raden we aan om de buizen zorgvuldig af te nivelleren voordat u dit experiment start. De visuele demonstratie van het gebruik van SUMO-bindende entiteiten vergemakkelijkt de revolutie van dit protocol, vooral vanwege de moeilijkheden bij het hanteren van de bits en het verlies van materiaal tijdens het protocol. Menselijke hepatoma cellen zijn eerder bereid door plating cellen in P100 platen op een dichtheid van 1,2 tot 1,5 miljoen cellen per schotel en handhaven ze in standaard groeimedia op 37 graden Celsius.

Wanneer u klaar bent om de cellen te gebruiken, de media van de platen aanzuigen en ze wassen met vijf millimeter steriele PBS. Zet de plaat op ijs en voeg 500 microliters lyse buffer aangevuld volgens het manuscript richtingen. Gebruik vervolgens een celschraper om de cellen voorzichtig van de bodem van de plaat in het lysemedium te schrapen.

U de cellen ook oogsten door trypsinisatie en voeg een milliliter trypsine-EDTA toe aan de plaat om ervoor te zorgen dat de cellen bedekt zijn. Zet de plaat in een 37 graden Celsius incubator gedurende vijf minuten om hen los te maken van de plaat, voeg dan twee milliliter van voorverwarmde groeimedium om de trypsinisatie te stoppen. Centrifugeer de cellen op 150 keer G gedurende 10 minuten en aspirate de supernatant.

Was vervolgens de cellen met PBS en centrifuge voor nog eens 10 minuten. Aspirate de supernatant en voeg 500 microliters van lyse buffer. Centrifugeren de lyse cellen op 15000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten, breng de supernatants naar een verse buis en gooi de pellet.

Wanneer klaar om de geoogste muislevers te gebruiken, homogenize 75 milligram verse of gebroken bevroren fragmenten in een milliliter van ijskoude lysis buffer. Voer de homogenisator volgens de handschrift aanwijzingen. Na weefselhomogenisatie, centrifugeren de monsters op 15000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Breng de supernatant naar een verse buis en gooi de pellet weg. Bereid glutathion kralen door het toevoegen van een milliliter gedeïoniseerd water tot 70 milligram kralen en reconstituting ze 's nachts bij vier degress Celsius. Na zwelling, was de kralen drie keer met 10 milliliter gedeïoniseerd water of PBS, centrifugeren op 300 keer G gedurende vijf minuten na elke wasbeurt.

Na de wasbeurten, resuspend de kralen in een milliliter PBS om een 50% drijfmest voor elk monster te verkrijgen op 100 microgram GST-SUBEs of GST controle tot 100 microliter van de glutathion kraal drijfmest en 500 microliter van PBS. Incubeer het mengsel op vier graden Celsius gedurende ten minste twee uur tijdens het draaien, dan herstellen van de kralen door centrifugatie op 300 keer G gedurende vijf minuten en resuspend ze in PBS. Neem 10% van het eerder bereide cellysaat en verdun het in een gelijk volume van 3X kokende buffer.

Voeg 450 microliter van het geklaarde lysaat toe aan 100 microliter van de glutathion kraaldrijfmest. Broed het lysaat met de kralen op vier graden Celsius gedurende ten minste twee uur, terwijl langzaam draaien. Na de incubatie, spin de kralen op 300 keer G gedurende vijf minuten en het verzamelen van de supernatant voor analyse.

Breng 10% van het totale volume over naar een aparte buis en voeg een gelijk volume van 3X kookbuffer toe. Was het resterende monster drie keer door het toevoegen van een milliliter ijskoude PBS met 05% Tween 20 en spinnen het naar beneden op 300 keer G en vier graden Celsius gedurende een minuut. Zorgvuldig aspirate de supernatant ervoor te zorgen dat er geen vloeistof blijft.

Dan elute het monster met 15 microliters van 3x koken buffer en 15 microliter lyse buffer. Voer een westelijke vlekanalyse uit volgens de aanwijzingen van het manuscript. Als het uitvoeren van Mass-Spectrometrie, desalt de peptiden met behulp van stage-tip C18 microcolumns en resuspend ze in 0,1%mierenzuur voorafgaand aan de analyse.

Laad de monsters op een LC-MS-systeem en analyseer ze in drievoud. Ga verder met eiwitidentificatie en overvloedberekening met behulp van de bijbehorende software. Statistische analyse uitvoeren volgens de aanwijzingen van het manuscript.

Dit protocol is gebruikt om sumoylated eiwitten te isoleren in muizen met glycine N-methyltransferase deficiëntie die spontane ontwikkeling van leverkanker en hun wilde type littermates veroorzaakt. Ponceau S kleuring werd uitgevoerd op de input, flow-through, en BOUND Breuken van de SUBEs pull-down test. Westerse vlekanalyse van LKB1 gevangen met SUBEs toont aan dat de niveaus van LKB1 SUMOylation worden verhoogd in levertumoren.

Menselijke hepatomacellen en niet-getransformeerde leverepepitheelcellen werden gebruikt om de capaciteit van de SUMO-val te onderzoeken om te interageren met natuurlijk SUMOylated eiwitten. Ten eerste werd conventionele eiwitvlekken gebruikt om het totale materiaal dat met SUBEs werd gevangen, te visualiseren. Toen bleek uit massaspectrometrie dat 742 eiwitten werden verrijkt in het hepatomacel SUBE's monster en 577 werden verrijkt in het levereppitheel niet-getransformeerde celSUBE monster.

Bij het uitvoeren van experimenten met SUBE's is het belangrijk om cellen en weefsels op ijs te houden en specifieke milliliters toe te voegen aan de lysebuffer om de zuiverheid van sumoylated te behouden. Na visualisatie van het sommoylaatproteoom met SUBEs, kunnen we de karakterisering vinden met behulp van een westerse vlekanalyse of massaspectrometrie. De toepassing van de SUBE's om het sumoylated proteoom in leverkankerweefsels en hepatomacellen te isoleren en te karakteriseren, maakt de weg vrij om de rol van de post translationele wijzigingen van SUMO bij leverkanker te onderzoeken, die een potentieel therapeutisch mechanisme kunnen bieden.