Generatie van ventriculaire-achtige HiPSC-afgeleide cardio myocyten en hoogwaardige celpreparaten voor de karakterisering van calcium behandeling

Reproduceerbaarheid is een grote zorg bij het induceren van door stamcellen afgeleide cardiomyocyten. Met behulp van deze methoden, hoge zuiverheid en hoge kwaliteit cardiomyocyten kunnen worden gegenereerd uit iPS voor het gebruik ervan in functionele studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat is een eenvoudige, betrouwbare, kosteneffectieve en uiterst krachtige methode voor het verkrijgen van gezuiverde, hoge kwaliteit voorbereidingen van iPSC-afgeleide cardiomyocyten.

Voor celdoorgiften, spoel de cellen met een milliliter PBS zonder calcium en magnesium gedurende zeven tot 10 minuten voor het vervangen van de PBS met een milliliter passaging medium. Met behulp van een cellifter schraap je voorzichtig de cellen van de bodem van de putten en gebruik steriele twee milliliter glaspipet om de losstaande cellen mechanisch te scheiden. Wanneer de cellen zijn opgeheven in kleine clusters als zichtbaar onder de microscoop toe te voegen passerende medium om de cellen te splitsen op een een tot zes verhouding.

Vervolgens, aspirate de menselijke embryonale stamcel gekwalificeerde matrix uit de zes put plaat. Voeg vervolgens een milliliter passaging medium en een milliliter van gescheiden cellen aan elke put, en laat de cellen groeien totdat ze 70 tot 80% samenvloeiing te bereiken voordat u een hartdifferentiatie. Ten minste 30 minuten voor het scheiden van de iPSC-CMs, veeg individuele glazen deksel slips met 70%ethanol, en plaats de cover glijdt in individuele putten van een steriele zes put plaat.

Wanneer de cover slips zijn gedroogd, voeg een 250 tot 300 microliter van menselijke embryonale stamcel gekwalificeerde matrix oplossing direct op het midden van elke cover slip, en plaats de zes put plaat in het weefsel cultuur kap. Om de metabolisch geselecteerde iPSC-CM te scheiden voeg een milliliter steriele 0,25% trypsine met EDTA toe aan elke put voor een vijf minuten incubatie bij 35 graden Celsius, en gebruik een 1000 microliter pipet om de cellen mechanisch te scheiden totdat een enkele cel suspensie is bereikt. Trek de cellen in steriele 15 milliliter conische buis, en was elk goed met twee milliliter RPMI 20 medium per put.

Voeg vervolgens de wasbeurten toe aan de buis en pellet de cellen door centrifugatie. Resuspend de cellen in een voldoende volume van medium om een drie keer 10 tot de vijfde cellen per 250 microliter van de concentratie cellen te bereiken. Gebruik een pipettip van 1000 milliliter om de cellen te scheiden totdat de oplossing homogeen lijkt te zijn.

Dan aspirate 250 microliter cellen in een 1000 microliter pipet tip, en langzaam afzien van het hele volume van de oplossing op een menselijke embryonale stamcel gekwalificeerde matrix gecodeerde cover slip. Wanneer alle cellen zijn gezaaid, zorgvuldig plaats de plaat in de cel cultuur incubator 's nachts. Voorzichtig toe te voegen twee milliliter D7 medium om elke put de volgende ochtend.

Wanneer de geselecteerde iPSC-CMs ten minste drie maanden oud bereiken, behandelen de cellen met twee microliters van Fura-2 AM gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius, en de macht op het calciumanalysesysteem. Start de ArcLamp en sluit de buizen van de pomp aan op de juiste inlaat en stopcontacten en de elektronische draad van de stimulator op de kamer. Plaats de kamer op het systeem.

Vul de ProFusion-buis die door de inlined heater loopt met de 37 graden Celsius opgewarmde Tyrode's oplossing en pas de afmetingen van de camera en het inlijsten van diafragma's aan om het achtergrondgebied te minimaliseren. Bevestig de glazen dekselbon met iPSC-CMs in de kamer en voeg voorzichtig 500 microliter van Tyrode's oplossing direct bovenop de afdekbon. Begin met het uiten van de kamer met de oplossing van Tyrode met een snelheid van 1,5 milliliter per minuut en gebruik een elektrische stimulator om de iPC-CMs te tempo met 1 Hertz-veldstimulatie met 10 volt om de vier milliseconden gedurende drie tot vijf minuten.

Wanneer alle kleurstof uit de kamer is gewassen, past u het kijkvenster aan de linkerbovenhoek van de afdekstrook en begint u met de opname. Na het verzamelen van een consistente stroom van vijf tot 10 pieken klik pauze om tijdelijk te stoppen met de opname en de microscoop fase te verplaatsen naar een aangrenzend gebied voor het andere uiteinde van de cover slip voor de hervatting van de opname. Na het scannen van de calciumtransience over de gehele cover slip op dezelfde manier over een periode van 10 minuten analyseren van de gegevens met een passende florescence trace analyse software volgens de instructies van de fabrikant.

Dit protocol genereert zeer zuivere cardiomyocyten die in de loop van de tijd een ventriculair, volwassen fenotype in de cultuur verwerven. Zoals beoordeeld door immuno fluorescerende kleuring voor de atrium- en ventriculaire MLC2-isovormen, zijn de meeste cellen die door dit protocol worden gegenereerd, atriumMLC2-isoform positief op dag 30 na de inductie van hartdifferentiatie. Terwijl ventriculaire MLC2 isoforms worden uitgedrukt in veel aantallen op hetzelfde moment punt.

Naarmate de tijd in de cultuur toeneemt, wordt een volledige overstap naar de MLC2-isovormen waargenomen. Deze gegevens werden ook bevestigd door flow cytometrische kwantificering van het percentage van de atrium en ventriculaire MLC2 marker uitdrukken cellen. De calciumamplitude wordt aanzienlijk verhoogd in de iPSC-CMs op dag 90, vergelijkbaar met die waargenomen voor volwassen rat CMs.

Het is belangrijk op te merken dat het besmetten van niet-cardiale cellen de functionele rijping van de menselijke iPSC-CMs tijdens differentiatie kan beïnvloeden. Verder, wanneer het opnemen van calcium voorbijgaand in iPSC-CMs is het noodzakelijk om de cellen te stabiliseren bij 37 graden Celsius onder constante stimulatie gedurende ten minste 200 seconden, en om de opnames te beperken tot een specifiek tijdvenster om reproduceerbare resultaten te garanderen. Vergeet niet om te bevestigen dat de iPSCs vertonen een homogene morfologie en om de cellen te groeien tot 70 tot 80%confluency alvorens het initiëren van een cardiale differentiatie.

Pure kwaliteit in onrijpe iPS-afgeleide cardiomyocyten kunnen veranderde functionele kenmerken vertonen, die niet het echte fenotype weerspiegelen, maar verkeerd kunnen worden geïnterpreteerd als het zieke fenotype. Daarom is het verkrijgen van zuivere en hoogwaardige cardiomyocyten belangrijk om consistente en reproduceerbare resultaten te bieden.