Name: Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met GM-CSF te isoleren uit embryonale stamcellen. Dit protocol maakt hoogwaardige immuunstimulerende vesikels voor immunotherapie-onderzoek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de heer Arkadiusz Slusarczyk en Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) dankbaar voor het verkrijgen van transmissie-elektronenmicroscoopbeelden. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 en CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) en Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

1. ES-D3 cellen kweken
<ol><li>Om exosoomvrij foetaal runderserum (FBS) te genereren, laadt u FBS in een ultracentrifuge en centrifugeer u gedurende 16 uur bij 4 °C bij 100.000 x g. Verzamel na centrifugeren serumsupernatant als exosoomvrije FBS voor het kweken van de muriene ESC-cellijn ES-D3 en het verwerven van exosoomverrijkte EV's.</li>
	<li>Voordat u de ES-D3-cellen plateert, bedekt u de 15 cm weefselkweekschalen met gelatine (0,1%) op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Volgens een eerder beschreven protocol16, kweek de ES-D3 cellen zonder feederlaagcellen in de met gelatine beklede 15 cm weefselkweekschalen. Het ES-D3 celkweekmedium bestaat uit DMEM, exosoomvrije FBS (15%), niet-essentiële aminozuren (0,1 mM), L-glutamine (2 mM), β-mercaptoethanol (0,1 mM), penicilline (50 eenheden / ml), streptomycine (50 μg / ml) en leukemie remmende factor (LIF; 100 eenheden / ml). Kweek ES-D3 cellen bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.</li>
	<li>Zodra de ES-D3-cellen ongeveer 90% samenvloeiing bereiken in 15 cm weefselkweekschalen, verwijdert u het medium door aspiratie. Was de cellen met trypsine (5 ml; 0,05%). Voeg trypsine (5 ml) toe aan de gerechten en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Verzamel de cellen uit de gerechten.</li>
	<li>Voeg vers kweekmedium (5 ml) toe aan de verzamelde cellen om de trypsine te inactiveren. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in vers medium en bepaal het celnummer met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Voor passaging cellen, plaat de ES-D3 cellen (5 x 106) in een gelatine-gecoate (0,1%) 15 cm weefselkweek schaal met vers medium (15 ml) en kweek gedurende 3 dagen voordat subculturatie van de cellen.</li>
	<li>Om het celkweeksupernatant te verzamelen voor isolatie van exosoomverrijkte EV's, verguld de ES-D3-cellen (1 x10 7) in een met gelatine bedekte (0,1%) 15 cm weefselkweekschaal met vers medium (15 ml) gedurende 3 dagen voorafgaand aan het verzamelen van celkweeksupernatant.</li>
</ol>2. Generatie van GM-CSF expressie plasmide
OPMERKING: Genereer het transfectieplasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP om GM-CSF in ES-D3-cellen te overexpresseren. In dit plasmide wordt de expressie van murine GM-CSF cDNA samen met het markereiwit gemensualiseerd Renilla reniformis GFP (hrGFP) aangedreven door de humane polypeptideketen rekfactor 1α (EF1α) promotor17,18.
<ol><li>Genereer de vectorbackbone.<ol>
<li>Verteer het plasmide pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) met behulp van het restrictieszym EcoRI (100 eenheden) bij 37 °C gedurende 2 uur om twee DNA-fragmenten te genereren: de vectorbackbone (6,0 kb) en FD3ER-insert (2,5 kb).</li>
		<li>Breng 50% van het verteerde plasmide-DNA (10 μg) over in één microcentrifugebuis van 1,5 ml en behandel met alkalische fosfatase (20 eenheden) bij 37 °C gedurende 1 uur. Los zowel onbehandeld als gedefosforyleerd DNA op met behulp van agarosegel-elektroforese (2%).</li>
		<li>Zuiver de vector backbone DNA-fragmenten (6,0 kb) met behulp van een DNA-gelextractiekit. Terwijl de onbehandelde vectorbackbone zal dienen als de lege vector (pEF1α-IRES-hrGFP), zal de gedefosforyleerde vectorbackbone worden gebruikt om GM-CSF-expresserend plasmide (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) te genereren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genereer de GM-CSF cDNA-insert.<ol>
<li>Verteer het plasmide pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) met behulp van het restrictie-enzym EcoRI (100 eenheden) bij 37 °C gedurende 2 uur om twee DNA-fragmenten te produceren: de vectorbackbone (6,5 kb) en de murine GM-CSF cDNA-insert (474 bp).</li>
		<li>Los het verteerde DNA op via agarosegel-elektroforese (2%). Zuiver het murine GM-CSF cDNA-fragment (474 bp) met behulp van een DNA-gelextractiekit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genereer de expressie plasmiden.<ol>
<li>Stel 2 ligatiereacties in (10 μL totaal volume) met behulp van een DNA-ligatiekit.<ol>
<li>Om de lege vector pEF1α-IRES-hrGFP te genereren, ligaat u de onbehandelde vectorbackbone uit stap 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).</li>
			<li>Om pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP te genereren, ligaat u de volgende DNA-fragmenten: (1) de gedefosforyleerde vectorbackbone uit stap 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) en (2) het mGM-CSF cDNA-fragment gegenereerd in stap 2.2.2 (474 bp; 200 ng).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ligate bij 25 °C gedurende 5 min. Transformeer geligeerd DNA in DH5α competente E. coli cellen. Plaat de getransformeerde E. coli-cellen op LB-agarplaten die carbenicilline (50 μg/ ml) bevatten.</li>
		<li>Zuiver plasmiden uit enkele E. coli-kolonies met behulp van een DNA-isolatiekit. Valideer de identiteit van de plasmiden door DNA-sequencing.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generatie van ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie
OPMERKING: Transfecteer de ES-D3-cellen met het plasmide pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP om GM-CS te overexpressie. Cotransfecteer het plasmide pBabe-Neo in ES-D3-cellen om de selectie van stabiel getransfecteerde cellente vergemakkelijken 18,20.
<ol><li>Transfecteer de plasmiden in de ES-D3-cellen.<ol>
<li>Verdeel de ES-D3-cellen (1,4 x 106) in een met gelatine beklede (0,1%) 10 cm weefselkweekschaal met kweekmedium (10 ml) voor transfectie. Gekweekte ES-D3-cellen bij 37 °C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Bereid twee plasmidemengsels in microcentrifugebuizen van 1,5 ml: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vectorcontrole) met pBabe-Neo (4 μg) en (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, gm-csf) met pBabe-Neo (4 μg). Voer transfectie uit met behulp van een transfectiekit volgens het protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Voeg transfectiemedium (1 ml) en transfectiereagens (64 μL) toe aan elke buis die de plasmidemengsels bevat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Voeg de transfectiemengsels toe aan de respectievelijke 10 cm schalen van ES-D3-cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 uur.</li>
		<li>Vervang het medium in schalen van 10 cm door vers kweekmedium (10 ml). Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genereer bulkpopulaties van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen.<ol>
<li>Verwijder het medium uit getransfecteerde ES-D3-cellen. Was de cellen met trypsine (2 ml; 0,05%). Voeg trypsine (2 ml) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Breng de cellen over in een centrifugebuis van 15 ml en voeg 2 ml vers kweekmedium toe om trypsine te neutraliseren. Centrifugeer bij 390 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Resuspend de getransfecteerde cellen in vers kweekmedium (10 ml). Evalueer de fluorescentie-intensiteit van GFP in getransfecteerde ES-D3-cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), volgens het protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Breng de getransfecteerde cellen over in twee schalen van 10 cm met vers kweekmedium (10 ml). Voeg neomycine (0,5 mg / ml) toe om niet-getransfecteerde cellen te elimineren.</li>
		<li>Ga door met het kweken van de getransfecteerde cellen in kweekmedium dat neomycine bevat (0,5 mg / ml). Wanneer de getransfecteerde ES-D3 90% confluentie bereikt, breng de cellen opnieuw over naar 15 cm weefselkweekschalen. Herhaal de procedure gedurende 2 weken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genereer klonen van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen.<ol>
<li>Zodra bulkpopulaties van stabiel getransfecteerde ES-D3-cellen zijn gegenereerd, verzamelt u de cellen zoals voorheen. Bepaal de celaantallen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen (1 x 107 cellen/ml) in vers kweekmedium.</li>
		<li>Filter de cellen door een steriele celzeef van 40 μm. Zuiver GFP-positieve ES-D3-cellen met behulp van FACS, volgens het protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Plaats een enkele gesorteerde ES-D3-cel in één put van een met gelatine bedekt (0,1%) 96-put weefselkweekplaat met ouderlijke ES-D3-cellen (1 x 103) in neomycinevrij medium (200 μL). Co-culturing van getransfecteerde ES-D3-cellen met hun niet-getransfecteerde ouderlijke tegenhangers zorgt ervoor dat stabiel getransfecteerde enkele ES-D3-cellen overleven en prolifereren als een enkele kloon.</li>
		<li>Kweek de cellen gedurende 48 uur en voeg vervolgens neomycine (0,5 mg / ml) toe aan 96-well platen om niet-getransfecteerde ouderlijke ES-D3-cellen te elimineren.</li>
		<li>Ga door met het kweken van de GFP-positieve ES-D3-cellen in 96-well weefselkweekplaten met medium dat neomycine (0,5 mg / ml) bevat gedurende 1 week. Breng klonale ES-D3-cellijnen over naar gelatine-gecoate (0,1%) 6 cm weefselkweekschalen met kweekmedium (5 ml) die neomycine (0,5 mg / ml) bevatten gedurende 1 week.</li>
		<li>Bepaal de intensiteit van GFP-fluorescentie in elk van de getransfecteerde ES-D3-celklonen met behulp van FACS, volgens het protocol van de fabrikant. Selecteer de ES-D3-klonen die GM-CSF of de lege vector met hoge niveaus van groene fluorescentie tot expressie brengen.</li>
		<li>Bepaal de hoeveelheden GM-CSF die door ES-D3-cellen worden uitgescheiden met behulp van een murine GM-CSF ELISA-kit, volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Isolatie van exosoomverrijkte extracellulaire blaasjes
<ol><li>Kweek de ES-D3 cellen (1 x 107) in 15 cm weefselkweekschalen gedurende 72 h bij 37 °C. Verzamel het celkweeksupernatant. Bewaar verzameld supernatant bij 4 °C tot 1 week om de exosomale integriteit te behouden.</li>
	<li>Centrifugeer het celcultuursupernatant bij 5.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C met behulp van een centrifuge om grote celfragmenten te bezinken.</li>
	<li>Verzamel het supernatant en centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 °C met behulp van een ultracentrifuge.</li>
	<li>Verwijder het supernatant. Spoel elke pellet voorzichtig twee keer af met fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS; 1 ml) om restkweeksupernatant te verwijderen.</li>
	<li>Resuspend elke pellet in PBS. Kwantificeer exosoomverrijkte EV's aan de maat van hun eiwitgehalte5.<ol>
<li>Meet de eiwitconcentratie van exosoomverrijkte EV's met een bicinchoninezuur (BCA) -test. De verwachte opbrengst van exosoom-verrijkte EV's uit ES-D3-cellen is ongeveer 4 μg eiwit / ml celkweeksupernatant. Resuspend de exosoom-verrijkte EV's in PBS (eiwitconcentratie: ~6 μg/μL). Bewaar de exosoomverrijkte EV's bij -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Karakterisering van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes door transmissie-elektronenmicroscopie
OPMERKING: Onderzoek de samenstelling en de structuur van de exosoom-verrijkte EV's geïsoleerd uit SER's met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)5.
<ol><li>Fixeer de exosoomverrijkte EV's (3-5 μg/μL) met een eindconcentratie van 2% EM-kwaliteit paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.</li>
	<li>Laad vaste monsters (10 μL) op koperen roosters met koolstofondersteuningsfolie. Incubeer de monsters met koperen roosters gedurende 1 minuut en giet de roosters vervolgens af met filterpapier.</li>
	<li>Bevlek de roosters met een kleuringsoplossing volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Breng de roosters met een pincet over op een stuk filterpapier. Laat de roosters een nacht drogen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verkrijg elektronenmicroscopiebeelden met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (50.000x vergroting), volgens het protocol van de fabrikant.</li>
</ol>6. Evaluatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes door western blot analyse
<ol><li>Bereid hele celextracten voor.<ol>
<li>Verwijder het medium uit ES-D3-cellen die in schalen van 15 cm zijn gekweekt. Was de cellen met trypsine (5 ml; 0,05%). Voeg trypsine (5 ml) toe aan de cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Verzamel de cellen en voeg vers kweekmedium (5 ml) toe om trypsine te neutraliseren. Centrifugeer de cellen bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in PBS.</li>
		<li>Bepaal celaantallen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 390 x g gedurende 5 minuten. Resuspend de cellen in SDS-PAGE laadbuffer met 0,5% SDS (5.000 cellen/μL).</li>
		<li>Soniceer de samples gedurende 10 s met behulp van een sonicator met 10% amplitude (wattage: 500 W; ultrasone frequentie: 20 kHz). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de lysaten van exosoom-verrijkte EV's voor.<ol>
<li>Resuspend de exosoom-verrijkte EV's in SDS-PAGE laadbuffer met 0,5% SDS in een concentratie van 1,2 μg/μL.</li>
		<li>Soniceer de samples gedurende 10 s met behulp van een sonicator met 10% amplitude (wattage: 500 W; ultrasone frequentie: 20 kHz). Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detecteer eiwitten door Western blot.<ol>
<li>Laad hele celextracten (10 μL; 5.000 cellen/μL) en exosoomverrijkte EV-lysaten (10 μL; 1,2 μg/μL) in elke put van een Bis-Tris PAGE-gel (4-20%). Breng eiwitten over op polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen.</li>
		<li>Incubeer membranen met geschikte primaire en secundaire antilichamen. Verdun antilichamen (in de hieronder aangegeven concentraties) in blottingbuffer met PBS, Tween-20 (0,2%) en magere droge melk (10% w/v).<ol>
<li>Gebruik de volgende primaire antilichamen: anti-Annexine V (200 ng/ml), anti-CD81 (50 ng/ml), anti-flotilline-1 (200 ng/ml), anti-cytochroom c (100 ng/ml), anti-eiwit disulfide isomerase (200 ng/ml), anti-GAPDH (33 ng/ml) en anti-oxfos COX IV-subunit IV (600 ng/ml).</li>
			<li>Gebruik de volgende secundaire antilichamen: peroxidase-geconjugeerde geiten anti-konijn IgG (20 ng / ml) en peroxidase-geconjugeerde geiten anti-muis IgG (20 ng / ml).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Detecteer eiwitten met behulp van een verbeterde chemiluminescentiedetectiekit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Bepaling van GM-CSF-concentraties in exosoomverrijkte extracellulaire blaasjes door ELISA
OPMERKING: Evalueer de hoeveelheden GM-CSF in exosoom-verrijkte EV's met ELISA met behulp van een kit voor murine GM-CSF, volgens het protocol van de fabrikant met enkele wijzigingen.
<ol><li>Bekleed de ELISA-plaat met vangantilichaam. Behandel exosoomverrijkte EV's (0,6 μg) alleen in PBS of PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg behandelde monsters toe aan de gecoate ELISA-plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20.</li>
	<li>Voeg detectieantilichaam toe aan de monsters. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20. Voeg Avidin-HRP toe aan de monsters. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de plaat alleen met PBS of PBS + 0,05% Tween-20.</li>
	<li>Bepaal de concentraties GM-CSF in exosoomverrijkte EV's door de absorptie bij 450 nm te meten op een microplaatlezer.</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases%3A+From+principles+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li>
<li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li>
<li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li>
<li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li>
<li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+%28TEX%29+in+Cancer+Immunity%3A+Is+It+All+in+the+ConTEXt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li>
<li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF%3A+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li>
<li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li>
<li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+data+from+2+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li>
<li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li>
<li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent%2C+specific%2C+and+long-lasting+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li>
<li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTremml%2C+G+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , (2008).</li>
<li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells%3A+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li>
<li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer%3A+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?</a> PLoS One. 7 (7), e42289(2012).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThery%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , (2006).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li>
<li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81(2018).</li>
<li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li>
<li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li>
<li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li>
<li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119(2019).</li>
</ol>

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li en John W. Eaton dienden een Amerikaanse patentaanvraag in "Samenstellingen bestaande uit gemanipuleerde embryonale stamcel-afgeleide exosomen en methoden voor het gebruik daarvan."

Deze studie toont een zeer efficiënte methode voor het produceren van exosoom-verrijkte EV's met het immuunstimulerende eiwit GM-CSF, dat kan worden gebruikt om de immuunmodulerende effecten van exosoom-verrijkte EV's te bestuderen. Verschillende studies suggereren dat exosomen immuunregulerende en antitumorale functies vertonen22. Exosomen van SER's die GM-CSF tot expressie komen, kunnen dus ook biologische activiteiten bezitten die de immuunrespons reguleren. In dit protocol werd exogene murine ...

SER's zijn afgeleid van het blastocyststadium van een pre-implantatie-embryo1. Als pluripotente stamcellen hebben SER's het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in elk type embryonale cel. Vanwege hun opmerkelijke ontwikkelingspotentieel en proliferatieve capaciteit op lange termijn zijn SER's uiterst waardevol voor biomedisch onderzoek1. De huidige onderzoeksinspanningen hebben zich grotendeels gericht op het therapeutisch potentieel van SER's voor een verscheidenheid aan belangrijke pathologische aandoeningen, waaronder diabetes, hartaandoeningen en neurodegeneratieve ziekten2,3,4.
Van zoogdiercellen, waaronder SER's, is bekend dat ze blaasjes met variabele grootte afgeven aan de extracellulaire omgeving, en deze EV's bezitten veel fysiologische en pathologische functies vanwege hun rol in intercellulaire communicatie5. Onder verschillende subtypen van EV's zijn exosomen kleine membraanblaasjes die vrijkomen uit verschillende celtypen in de extracellulaire ruimte bij fusie van intermediaire endocytische compartimenten, multivesiculaire lichamen (MWB's), met het plasmamembraan6. Van exosomen is gemeld dat ze intercellulaire communicatie bemiddelen en zijn kritisch betrokken bij veel (patho)fysiologische processen7,8. Exosomen erven sommige biologische functies van hun eigen ouderlijke cellen, omdat exosomen biologische materialen bevatten die uit het cytosol zijn verkregen, waaronder eiwitten en nucleïnezuren. De geassocieerde antigenen of factoren die de immuunrespons specifiek voor een bepaalde ziekte stimuleren, zijn dus ingekapseld in de exosomen van bepaalde soorten cellen9. Dit maakte de weg vrij voor klinische onderzoeken naar tumor-afgeleide exosomen als een anti-kankervaccin10.
GM-CSF is een cytokine uitgescheiden door verschillende soorten immuuncellen11. Opkomend bewijs toont aan dat GM-CSF het immuunsysteem activeert en reguleert en een essentiële rol speelt in het antigeen-presenterende proces12. Een klinisch rapport suggereert bijvoorbeeld dat GM-CSF de immuunrespons op tumoren stimuleert als een vaccinadjuvans13. Verschillende gm-csf-gebaseerde kanker immunotherapie strategieën om de krachtige immuunstimulerende activiteit van GM-CSF te benutten zijn onderzocht in klinische onderzoeken14. Onder deze, een kankervaccin samengesteld uit bestraalde GM-CSF-afscheidende tumorcellen heeft enige belofte getoond bij gevorderde melanoompatiënten door cellulaire en humorale antitumorreacties en daaropvolgende necrose in uitgezaaide tumoren te induceren15.
Omdat de exosomen afgeleid van SER's vergelijkbare biologische activiteiten hebben als de oorspronkelijke SER's, kunnen GM-CSF-dragende exosomen van SER's misschien functioneren als celvrije blaasjes om de immuunrespons te reguleren. In dit artikel wordt een gedetailleerde methode beschreven om hoogwaardige exosoom-verrijkte EV's te produceren van SER's die GM-CSF tot expressie geven. Deze exosoom-verrijkte EV's hebben het potentieel om te dienen als immuunregulerende blaasjes om de immuunrespons te moduleren.

<table><tbody><tr><td>Alkaline fosfatase, Calf Intestinal</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>Defosforyleren van DNA-plasmide</td></tr><tr><td>anti-Annexin V mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>clone H-3, sc-74438</td><td>Western blot, RRID:AB_1118989</td></tr><tr><td>anti-CD81 mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>clone B-11, sc-166029</td><td>Western blot, RRID:AB_2275892</td></tr><tr><td>anti-cytochrome c mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>clone A-8, sc-13156</td><td>Western blot, RRID:AB_627385</td></tr><tr><td>anti-Flotillin-1 mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>clone C-2; sc-74566</td><td>Western blot, RRID:AB_2106563</td></tr><tr><td>anti-GAPDH pAb</td><td>Rockland</td><td>600-401-A33S</td><td>Western blot, RRID:AB_11182910</td></tr><tr><td>anti-muis IgG, geit, peroxidase-geconjugeerd</td><td>Thermo Fisher</td><td>31430</td><td>Western blot, RRID:AB_228307</td></tr><tr><td>anti-Oxphos COX IV-subeenheid IV mAb</td><td>Thermo Fisher</td><td>clone 20E8C12 A21348</td><td>Western blot, RRID:AB_221509</td></tr><tr><td>anti-eiwit disulfide isomerase (PDI) pAb</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-890</td><td>Western blot, RRID:AB_10616242</td></tr><tr><td>anti-konijn IgG, geit, peroxidase-geconjugeerd</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>Western blot, RRID:AB_228341</td></tr><tr><td>BCA (bicinchoninic zuur) assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>23223</td><td>Bepalen van eiwitconcentraties</td></tr><tr><td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td><td>Genscript</td><td>M42015</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Carbenicilline, Dinatriumzout</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Selectie van E. coli kolonies</td></tr><tr><td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Laagsnelheidscentrifugering</td></tr><tr><td>Centrifuge rotor, JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U1597</td><td>Laagsnelheidscentrifugering</td></tr><tr><td>Centrifuge fles, Nalgene PPCO</td><td>Thermo Fisher</td><td>3120-0500PK</td><td>Laagsnelheidscentrifugering</td></tr><tr><td>Cu roosters met koolstofondersteuningsfilm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FF200-Cu</td><td>Verkrijgen van elektronenmicroscoopbeelden</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td>Verteren van DNA-plasmide</td></tr><tr><td>Enhanced chemiluminescence detectiesysteem</td><td>Thermo Fisher</td><td>32106</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>FACScalibur flow cytometer</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Onderzoeken van GFP-niveaus van ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td>Medium voor ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Fisherbrand steriele cel zeef; Maasmaat: 40&mu;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-547</td><td>Filteren van ES-D3 cellen voor FACS sorteer</td></tr><tr><td>Gelatine (0,1%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ES006B</td><td>Kweek van ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>GM-CSF ELISA kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>88733422</td><td>Bepalen van GM-CSF-concentraties</td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle&rsquo;s Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-829-018</td><td>Medium voor ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Leukemie Remmende Factor</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESG1106</td><td>Medium voor ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0131-0100</td><td>Medium voor ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 transfectie reagens</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td>Transfectie van ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Microplaat lezer, PowerWave XS</td><td>BioTek</td><td></td><td>Bepalen van GM-CSF-concentraties</td></tr><tr><td>MoFlo XDP hoge snelheidscel sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Isoleren van enkele ES-D3 celklonen</td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2988J</td><td>Genereren van GM-CSF expressieplasmide</td></tr><tr><td>Neomycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-131-035</td><td>Selectie van ES-D3 klonen</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH3023801</td><td>Medium voor ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Niet-vette melkpoeder</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9022655</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Gereduceerd Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td>Transfectie van ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Verkrijgen van elektronenmicroscoopbeelden</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>VWR</td><td>sc45000-652</td><td>Medium voor ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td><td>Addgene</td><td>37270</td><td>Genereren van GM-CSF expressieplasmide</td></tr><tr><td>PVDF membranen</td><td>Millipore EMD</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Genereren van GM-CSF expressieplasmide</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extractie Kit (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>Genereren van GM-CSF expressieplasmide</td></tr><tr><td>Quick Ligatie Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Genereren van GM-CSF expressieplasmide</td></tr><tr><td>Transmissie elektronenmicroscoop</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td>Verkrijgen van elektronenmicroscoopbeelden</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Kweek van ES-D3 cellen</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Hoge snelheidscentrifugering</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U4454</td><td>Hoge snelheidscentrifugering</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge polycarbonaat fles</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td>Hoge snelheidscentrifugering</td></tr><tr><td>UranyLess kleuringsoplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22409</td><td>Verkrijgen van elektronenmicroscoopbeelden</td></tr></tbody></table>

isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Embryonale stamcellen (SER's) zijn pluripotente stamcellen die in staat zijn tot zelfvernieuwing en differentiatie in alle soorten embryonale cellen. Net als veel andere celtypen geven SER's kleine membraanblaasjes, zoals exosomen, af aan de extracellulaire omgeving. Exosomen dienen als essentiële bemiddelaars van intercellulaire communicatie en spelen een basisrol in veel (patho)fysiologische processen. Granulocyte-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) functioneert als een cytokine om de immuunrespons te moduleren. De aanwezigheid van GM-CSF in exosomen heeft het potentieel om hun immuunregulerende functie te stimuleren. Hier werd GM-CSF stabiel overexpressie in de muriene ESC-cellijn ES-D3. Er werd een protocol ontwikkeld om hoogwaardige exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes (EV's) te isoleren uit ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie geven. Geïsoleerde exosoom-verrijkte EV's werden gekenmerkt door een verscheidenheid aan experimentele benaderingen. Belangrijk is dat aanzienlijke hoeveelheden GM-CSF aanwezig bleken te zijn in exosoom-verrijkte EV's. Over het algemeen kunnen GM-CSF-dragende exosoom-verrijkte EV's van SER's functioneren als celvrije blaasjes om hun immuunregulerende activiteiten uit te oefenen.

GM-CSF is overexpressie in murine SER's. Om GM-CSF stabiel te overexpressie in ES-D3-cellen, werd murine GM-CSF cDNA gekloond in een transfectievector om de expressievector pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP te genereren (Figuur 1A). GM-CSF was overexpressie in ES-D3-cellen door transfectie en ongeveer 20% van de tijdelijk getransfecteerde ES-D3-cellen was GFP-positief. Celklonen die GM-CSF stabiel overexpressie of de lege vectorcon...

Deze studie beschrijft een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes te isoleren die immuunstimulerende granulocyten macrofaagkolonie-stimulerende factoren dragen uit embryonale stamcellen.

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Ons protocol kan worden gebruikt om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes van hoge kwaliteit te produceren uit embryonale stamcellen die de immuunstimulerende factor, GM-CSF, tot expressie brengen. Exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes die GM-CSF dragen, hebben het potentieel om een celvrije immuunregulerende blaasjes te dienen die de immuunrespons kunnen moduleren. Onderzoekers met de basis moleculaire en cellulaire biologie training, zou in staat moeten zijn om dit protocol gemakkelijk te kunnen, maar iedereen die dit protocol voor de eerste keer uitvoert, moet de aanwijzingen nauwlettend volgen.Omdat ons protocol ingewikkeld is, zal het visualiseren van de ingewikkelde details van elke stap andere onderzoekers helpen om exosoomvrije FBS te genereren, het gewenste volume FBS ultracentrifugeren en het exosoomvrije supernatant verzamelen. Voordat u de ESD drie cellen plateert, bedekt u 15 centimeter weefselkweekschalen met 0,1% gelatine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder gelatine door aspiratie en kweek de ESD drie cellen zonder feederlaag cellen in ESD drie cel kweekmedium bij 37 graden Celsius in 5% Kooldioxide bevochtigde incubator totdat de cellen 90% confluency bereiken.Was de bijna samenvloeiende culturen met vijf milliliter 0,05% trypsine per gerecht gevolgd door een incubatie van vijf minuten bij 37 graden Celsius in verse trypsine. Trek aan het einde van de incubatie de losgemaakte cellen in een centrifugebuis en inactiveer de trypsine met vijf milliliter vers kweekmedium. Bezink de cellen door centrifugering en suspensie de pallets opnieuw in vers medium voor het tellen Voor het passeren, plaat vijf keer 10 tot de zesde van de ESD drie cellen in 15 milliliter celkweekmedium op nieuwe gelatine gecoate platen gedurende drie dagen cultuur voordat de cellen worden gesubkweekt Om de celcultuursupernatant te verzamelen voor de isolatie van exosoom verrijkte extracellulaire blaasjesplaat één keer 10 tot de zevende ESD drie cellen in 15 milliliter celkweekmedium per nieuwe gelatine gecoate plaat gedurende drie dagen voorafgaand aan het verzamelen van de celkweeksupernatanten Voor exosoom verrijkte extra cellulaire blaasjesisolatie, Eerst sediment de grote celfragmenten in de supernatanten verzameld uit 72 uur gekweekte ESD drie cellen door centrifugatie.Na het verzamelen van het supernatant, ultracentrifugeer de monsters en gooi de supernatanten weg. Spoel elke pallette voorzichtig twee keer met één milliliter PBS per wasbeurt om eventuele resterende cultuur supernatant te verwijderen en kwantificeer het exosoom verrijkte extracellulaire blaasje-eiwitgehalte met een Bicinchoninic acid-test, volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens suspensies de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes in PBS met een concentratie van zes microgram per micrometer voor opslag bij min 80 graden Celsius.Om de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes te visualiseren door transmissie elektronenmicroscopie fixeren drie tot vijf microgram per milliliter van de extracellulaire blaasjes met de uiteindelijke concentratie van 2% elektronenmicroscoop raster paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Laad aan het einde van de incubatie 10 microliter van de vaste monsters gedurende één minuut op copper grids met koolstofondersteuningsfilm voordat u de roosters met filterpapier aftapt, blijf in de roosters met een geschikte kleuringsoplossing, volgens het protocol van de fabrikant en gebruik een pincet om de roosters over te brengen naar een stuk filterpapier, gebruik vervolgens de transmissie-elektronenmicroscoop met een vergroting van 50.000 keer om elektronenmicroscopiebeelden te verkrijgen, volgens de standaardprotocollen. Om hele celextracten te bereiden, verzamelt u ESD drie cellen uit de kweek zoals aangetoond en suspenseert u de geoogste cellen opnieuw in PBS voor het tellen.Na een tweede centrifugatie, suspensie de cellen opnieuw van vijf keer 10 tot de derde cellen per microliter SDS-paginalaadbuffer met 0,5% SDS-concentratie en Sonicate de monsters gedurende 10 seconden op een Sonicator met een amplitude van 10%. Verwarm de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius. Om lysaten voor te bereiden op de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes, suspensie de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes opnieuw op in SDS-paginalaadbuffer met 0,5% SDS bij een concentratie van 1,2 microgram per microliter en soniceer de monsters gedurende 10 seconden zoals gedemonstreerd en verwarm de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius.Voor Western Blot-analyse laadt u 10 microliter groothandelsextract en exosoom verrijkte extracellulaire blaasjeslysaatmonsters in individuele putten van een beste stresspaginagel. Breng aan het einde van de run de eiwitten over op PVDF-membranen en incubeer de membranen met de juiste primaire en secundaire antilichamen van belang, detecteer vervolgens de eiwitexpressie met behulp van een verbeterde chemiluminescentiedetectiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Om de hoeveelheid GM-CSF in exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes te evalueren, gebruikt u een kit Murine GM-CSF om een ELISA-plaat te coaten met anti GM-CSF-opvangantilichaam, behandel vervolgens 0,6 microgram exosoom verrijkte extracellulaire blaasjesmonsters met 100 microliter PBS alleen, of PBS plus 0,05% tween 20 bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Voeg aan het einde van de incubatie de behandelde monsters toe aan afzonderlijke putten van de voorbereide ELISA-plaat gedurende een incubatie van één uur bij kamertemperatuur, gevolgd door het wassen van de juiste overeenkomstige putten met alleen PBS, of PBS plus 0,05% tween 20. Voeg na de wasbeurt het detectie-antilichaam toe aan de monsters gedurende een incubatie van een uur bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt met PBS alleen of PBS plus 0,05% tween 20 zoals aangetoond, voeg vervolgens Avidin Mierikswortelperoxidase toe aan de monsters gedurende een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt en het meten van de absorptie in elke put op een microplaatlezer op 450 nanometer. De GFP-fluorescentie-intensiteit van een GM-CSF die ESD-driecellige lijn tot expressie brengt of een ESD-driecellige lijn die een lege vector tot expressie brengt, is veel hoger dan die van hun ouderlijke tegenhangers.ELISA onthult dat ESD drie cellen die GM-CSF tot expressie brengen aanzienlijk hogere niveaus van GMCSF produceren in hun celkweek supernatant dan lege vectorcontrolecellen. Bovendien is de hoeveelheid GM-CSF die wordt gegenereerd door GM-CSF die ESD-drie cellen tot expressie brengen, vergelijkbaar met die geproduceerd door STO-fibroblasten die GM-CSF tot expressie brengen. Transmissie-elektronenmicroscopie van extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit vector getransduceerde en GM-CSF getransduceerde celculturen onthullen blaasjes van verschillende grootte die binnen het verwachte diameterbereik van 30 tot 100 nanometer vallen.De expressie van exosomale markers, waaronder CD81, Annexine V en flotilline-1, is aanzienlijk verbeterd in extracellulaire blaasjes, geïsoleerd uit ESD-drie cellen in vergelijking met overeenkomstige groothandelsextracten door Western blot-analyse. Belangrijk is dat de aanwezigheid van andere subcellulaire compartimentmarkers in ESD drie afgeleide extracellulaire blaasjes niet werd gedetecteerd, waaronder de endoplasmatische reticulummarker, Protein Disulfide Isomerase, de mitochondriale markers, cytochroom C en Oxphos complex IV-subunit IV en de cytosolische marker GAPDH. Na het wassen met 0,05% tween 20, waren de gm-csf-waarden op de achtergrond die werden gedetecteerd in de extracellulaire blaasjes van de controle aanzienlijk verminderd.Daarentegen waren de GM-CSF-niveaus in de extracellulaire blaasjes van GM-CSF-expressiecellen significant verhoogd met tween 20. Het verkrijgen van hoogwaardige exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes met GMCSF is de belangrijkste stap voor het succes van dit protocol. Onderzoekers kunnen aanvullende experimenten uitvoeren, zoals studies in GM-CSF-afhankelijke cellijnen en dieren om te bepalen of exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes die GM-CSF verzorgen, kunnen functioneren als celvrije immuunregulerende blaasjes.Deze exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes kunnen vervolgens worden gebruikt om te onderzoeken hoe modulatie van de immuunrespons verschillende ziekteomstandigheden beïnvloedt.

isolation-exosome-enriched-extracellular-vesicles-carrying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video describes a method based on size-exclusion chromatography (SEC) to isolate extracellular vesicles or EVs derived from the brain immune cells―the microglia. The EVs act as molecular cargo to deliver mediators, which regulate an immune response. Therefore, the isolated EVs can be used as an in vitro model to study the microglia-neuron crosstalk during a neuronal immune response.

SEC-based Isolation of Microglia-derived Extracellular Vesicles: A Technique to Isolate Extracellular Vesicles from Microglia Conditioned Culture Media

Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

Exosoom toepassing is een opkomende tool voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. We stellen een exosoom isolatieprotocol op met een hoge zuiverheid om exosomen te isoleren van nieuw geïdentificeerde stamcellen genaamd CB-SC voor mechanistische studies. We cocultuur cb-sc-afgeleide exosomen met menselijke monocyten, wat leidt tot hun differentiatie in fenotypically verschillende macrofagen.

Differentiatie van monocyten in fenotypisch verschillende macrofagen na behandeling met Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Afgeleide Exosomen

Het protocol hier toont aan dat extracellulaire blaasjes adequaat kunnen worden gescheiden van geconditioneerde celkweekmedia met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.

Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit protocol beschrijft de differentiële centrifugatie voor het isoleren en karakteriseren van representatieve EV's (exosomen en microvesicles) uit gekweekte menselijke MSC's. Verdere toepassingen van deze EV's worden in dit artikel ook toegelicht.

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Hier beschrijven we een magnetische scheidings-geassisteerde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels als een nieuw type exosoomnabootsers (EM's) die dezelfde biologische oorsprong en vergelijkbare structuur, morfologie en eiwitsamenstelling van inheemse extracellulaire blaasjes (EV's) delen.

Een magnetische scheidings-ondersteunde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide blaasjes

De aanwezigheid van kanker stamcellen (CSC) in bot sarcomen Onlangs is gekoppeld aan de pathogenese. In dit artikel presenteren we de isolatie van CSCs van primaire celculturen verkregen uit humane biopten van conventionele osteosarcoom (OS) met de mogelijkheid van CSCs groeien onder hechtende omstandigheden.

Oprichting van Cancer Stem Cell Cultures van Human Conventionele Osteosarcoom

We beschrijven hier xenograft zebravismodellen behulp van twee verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte en het kanaal van Cuvier, aan de invasief gedrag te onderzoeken en de intravasation en extravasatie potentieel van menselijke borstkankercellen respectievelijk beoordelen.

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

Leer een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met GM-CSF te isoleren uit embryonale stamcellen. Dit protocol maakt hoogwaardige immuunstimulerende vesikels voor immunotherapie-onderzoek mogelijk.

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

Meer video's verkennen