Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

Ons protocol kan worden gebruikt om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes van hoge kwaliteit te produceren uit embryonale stamcellen die de immuunstimulerende factor, GM-CSF, tot expressie brengen. Exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes die GM-CSF dragen, hebben het potentieel om een celvrije immuunregulerende blaasjes te dienen die de immuunrespons kunnen moduleren. Onderzoekers met de basis moleculaire en cellulaire biologie training, zou in staat moeten zijn om dit protocol gemakkelijk te kunnen, maar iedereen die dit protocol voor de eerste keer uitvoert, moet de aanwijzingen nauwlettend volgen.

Omdat ons protocol ingewikkeld is, zal het visualiseren van de ingewikkelde details van elke stap andere onderzoekers helpen om exosoomvrije FBS te genereren, het gewenste volume FBS ultracentrifugeren en het exosoomvrije supernatant verzamelen. Voordat u de ESD drie cellen plateert, bedekt u 15 centimeter weefselkweekschalen met 0,1% gelatine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder gelatine door aspiratie en kweek de ESD drie cellen zonder feederlaag cellen in ESD drie cel kweekmedium bij 37 graden Celsius in 5% Kooldioxide bevochtigde incubator totdat de cellen 90% confluency bereiken.

Was de bijna samenvloeiende culturen met vijf milliliter 0,05% trypsine per gerecht gevolgd door een incubatie van vijf minuten bij 37 graden Celsius in verse trypsine. Trek aan het einde van de incubatie de losgemaakte cellen in een centrifugebuis en inactiveer de trypsine met vijf milliliter vers kweekmedium. Bezink de cellen door centrifugering en suspensie de pallets opnieuw in vers medium voor het tellen Voor het passeren, plaat vijf keer 10 tot de zesde van de ESD drie cellen in 15 milliliter celkweekmedium op nieuwe gelatine gecoate platen gedurende drie dagen cultuur voordat de cellen worden gesubkweekt Om de celcultuursupernatant te verzamelen voor de isolatie van exosoom verrijkte extracellulaire blaasjesplaat één keer 10 tot de zevende ESD drie cellen in 15 milliliter celkweekmedium per nieuwe gelatine gecoate plaat gedurende drie dagen voorafgaand aan het verzamelen van de celkweeksupernatanten Voor exosoom verrijkte extra cellulaire blaasjesisolatie, Eerst sediment de grote celfragmenten in de supernatanten verzameld uit 72 uur gekweekte ESD drie cellen door centrifugatie.

Na het verzamelen van het supernatant, ultracentrifugeer de monsters en gooi de supernatanten weg. Spoel elke pallette voorzichtig twee keer met één milliliter PBS per wasbeurt om eventuele resterende cultuur supernatant te verwijderen en kwantificeer het exosoom verrijkte extracellulaire blaasje-eiwitgehalte met een Bicinchoninic acid-test, volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens suspensies de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes in PBS met een concentratie van zes microgram per micrometer voor opslag bij min 80 graden Celsius.

Om de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes te visualiseren door transmissie elektronenmicroscopie fixeren drie tot vijf microgram per milliliter van de extracellulaire blaasjes met de uiteindelijke concentratie van 2% elektronenmicroscoop raster paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Laad aan het einde van de incubatie 10 microliter van de vaste monsters gedurende één minuut op copper grids met koolstofondersteuningsfilm voordat u de roosters met filterpapier aftapt, blijf in de roosters met een geschikte kleuringsoplossing, volgens het protocol van de fabrikant en gebruik een pincet om de roosters over te brengen naar een stuk filterpapier, gebruik vervolgens de transmissie-elektronenmicroscoop met een vergroting van 50.000 keer om elektronenmicroscopiebeelden te verkrijgen, volgens de standaardprotocollen. Om hele celextracten te bereiden, verzamelt u ESD drie cellen uit de kweek zoals aangetoond en suspenseert u de geoogste cellen opnieuw in PBS voor het tellen.

Na een tweede centrifugatie, suspensie de cellen opnieuw van vijf keer 10 tot de derde cellen per microliter SDS-paginalaadbuffer met 0,5% SDS-concentratie en Sonicate de monsters gedurende 10 seconden op een Sonicator met een amplitude van 10%. Verwarm de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius. Om lysaten voor te bereiden op de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes, suspensie de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes opnieuw op in SDS-paginalaadbuffer met 0,5% SDS bij een concentratie van 1,2 microgram per microliter en soniceer de monsters gedurende 10 seconden zoals gedemonstreerd en verwarm de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius.

Voor Western Blot-analyse laadt u 10 microliter groothandelsextract en exosoom verrijkte extracellulaire blaasjeslysaatmonsters in individuele putten van een beste stresspaginagel. Breng aan het einde van de run de eiwitten over op PVDF-membranen en incubeer de membranen met de juiste primaire en secundaire antilichamen van belang, detecteer vervolgens de eiwitexpressie met behulp van een verbeterde chemiluminescentiedetectiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Om de hoeveelheid GM-CSF in exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes te evalueren, gebruikt u een kit Murine GM-CSF om een ELISA-plaat te coaten met anti GM-CSF-opvangantilichaam, behandel vervolgens 0,6 microgram exosoom verrijkte extracellulaire blaasjesmonsters met 100 microliter PBS alleen, of PBS plus 0,05% tween 20 bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Voeg aan het einde van de incubatie de behandelde monsters toe aan afzonderlijke putten van de voorbereide ELISA-plaat gedurende een incubatie van één uur bij kamertemperatuur, gevolgd door het wassen van de juiste overeenkomstige putten met alleen PBS, of PBS plus 0,05% tween 20. Voeg na de wasbeurt het detectie-antilichaam toe aan de monsters gedurende een incubatie van een uur bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt met PBS alleen of PBS plus 0,05% tween 20 zoals aangetoond, voeg vervolgens Avidin Mierikswortelperoxidase toe aan de monsters gedurende een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt en het meten van de absorptie in elke put op een microplaatlezer op 450 nanometer. De GFP-fluorescentie-intensiteit van een GM-CSF die ESD-driecellige lijn tot expressie brengt of een ESD-driecellige lijn die een lege vector tot expressie brengt, is veel hoger dan die van hun ouderlijke tegenhangers.

ELISA onthult dat ESD drie cellen die GM-CSF tot expressie brengen aanzienlijk hogere niveaus van GMCSF produceren in hun celkweek supernatant dan lege vectorcontrolecellen. Bovendien is de hoeveelheid GM-CSF die wordt gegenereerd door GM-CSF die ESD-drie cellen tot expressie brengen, vergelijkbaar met die geproduceerd door STO-fibroblasten die GM-CSF tot expressie brengen. Transmissie-elektronenmicroscopie van extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit vector getransduceerde en GM-CSF getransduceerde celculturen onthullen blaasjes van verschillende grootte die binnen het verwachte diameterbereik van 30 tot 100 nanometer vallen.

De expressie van exosomale markers, waaronder CD81, Annexine V en flotilline-1, is aanzienlijk verbeterd in extracellulaire blaasjes, geïsoleerd uit ESD-drie cellen in vergelijking met overeenkomstige groothandelsextracten door Western blot-analyse. Belangrijk is dat de aanwezigheid van andere subcellulaire compartimentmarkers in ESD drie afgeleide extracellulaire blaasjes niet werd gedetecteerd, waaronder de endoplasmatische reticulummarker, Protein Disulfide Isomerase, de mitochondriale markers, cytochroom C en Oxphos complex IV-subunit IV en de cytosolische marker GAPDH. Na het wassen met 0,05% tween 20, waren de gm-csf-waarden op de achtergrond die werden gedetecteerd in de extracellulaire blaasjes van de controle aanzienlijk verminderd.

Daarentegen waren de GM-CSF-niveaus in de extracellulaire blaasjes van GM-CSF-expressiecellen significant verhoogd met tween 20. Het verkrijgen van hoogwaardige exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes met GMCSF is de belangrijkste stap voor het succes van dit protocol. Onderzoekers kunnen aanvullende experimenten uitvoeren, zoals studies in GM-CSF-afhankelijke cellijnen en dieren om te bepalen of exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes die GM-CSF verzorgen, kunnen functioneren als celvrije immuunregulerende blaasjes.

Deze exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes kunnen vervolgens worden gebruikt om te onderzoeken hoe modulatie van de immuunrespons verschillende ziekteomstandigheden beïnvloedt.