Luminescentie Lifetime beeldvorming van O₂ met een op frequentiedomein gebaseerd camera systeem

Als de beste elektronen acceptor, zuurstof speelt een cruciale rol in biologische systemen. Met dit protocol u de zuurstofverdeling in 2D beeld geven met behulp van een optode. Naast de hoge ruimtelijke en temporele resolutie vereist deze methode geen extra referentiekleurstof, is uiterst robuust en maakt het mogelijk om structureel beeld te verwerven.

Deze methode kan worden toegepast op verschillende onderzoeksgebieden waarin zuurstof een sleutelrol speelt, waaronder ecologie, medisch onderzoek, bioprinting en drukgevoelig printen. De optode fabricage kan een uitdaging zijn als de hoeveelheid cocktail toegevoegd aan de steun folie en het mes coating apparaat sleepsnelheid kan optimalisatie en praktijk vereisen. Met deze videobijdrage willen we deze krachtige techniek toegankelijk maken voor onderzoekers uit andere vakgebieden.

Om een vlakke zuurstofoptode voor te bereiden, gebruikt u eerst een folie van water of 70% ethanol om een schone stofvrije PET-folie op een schone glasplaat te bevestigen. Plaats een schone 120 micrometer mes coating apparaat op de folie en gebruik een glazen pipet om een lijn van sensor cocktail toe te passen in de voorkant van het apparaat. Sleep vervolgens het mescoatingapparaat langzaam en gelijkmatig over de PET-folie om de cocktail gelijkmatig te verspreiden.

Droog vervolgens de afgewerkte vlakke zuurstofgevoelige optode in de omgevingslucht voor een uur voor het drogen 's nachts in een verwarmde kast op 50 tot 60 graden Celsius. Tegen de volgende ochtend zal een ongeveer 12 micrometer dikke laag zijn verkregen. Bewaar de optode beschermd tegen licht tot verder gebruik.

Om een rhizo-sandwich kamer te bereiden, gebruik maken van licht geneesbare acryl-gebaseerde instant lijm om microscoop dia's langs de randen van een glasplaat waardoor een lange rand open. Snijd de vlakke optode in de gewenste vorm en grootte om in de ruimte tussen de gelijmde microscoopdia's te passen en plaats de optode aan de binnenkant van de glasplaat aan de voorkant met de gecoate zijde naar boven. Plak een rand van de optodefolie aan de glasplaat en voeg kraanwater toe tussen de glasplaat en de optodefolie.

Laat de folie langzaam op de waterdruppels zakken, waardoor de optode zich op het glasoppervlak kan rechttrekken en een zacht weefsel gebruikt om een luchtbellen die tussen de optode en de plaat vastzitten, voorzichtig te verwijderen. Veeg vervolgens de glasplaat droog en plak de resterende randen van de folie aan de plaat. Gebruik vervolgens een platte glazen plaat om 0,5 millimeter zeefsediment gelijkmatig over de plaat te verdelen tot dezelfde dikte als de microscoop schuifruimters.

Reinig zorgvuldig het bovenste oppervlak van de microscoopdia om ervoor te zorgen dat de tweede glasplaat de kamer goed afsluit en siliconenvet op het schuifoppervlak van de microscoop aanbrengt. Bedek vervolgens het sediment met een dunne laag water terwijl u de vorming van luchtbellen zorgvuldig vermijdt. Voordat u een monster op het sediment plaatst, moet u voorzichtig een enkele shoot Littorella-uniflora wassen en de shoot op een sediment plaatsen met de bladeren die uit de bovenste open zijde steken.

Wanneer het monster op zijn plaats is, plaatst u de glasplaat met de optode op het sediment en drukt u de optode in nauw contact met de plantenwortels en het omringende sediment. Gebruik klemmen om de platen aan elkaar vast te maken en droog de buitenste randen met tissuepapier. Voeg herhaaldelijk een paar druppels water toe aan de bladeren om de plant gehydrateerd te houden tijdens de montage van de rhizo-sandwich en gebruik vinyl elektrische tape om de rhizo-sandwichkamer aan te draaien.

Sluit vervolgens de randen af met het modelleren van klei en extra elektrische tape. Om de beeldvorming voor te bereiden, verwijdert u de afdekfolie na de incubatie en plaatst u de rhizo-sandwichkamer met de glazen wand met de optode rechtop tegen de aquariumwand. Gebruik een afstandsman om de rhizo-sandwich kamer tegen de muur te drukken.

Plaats de frequentie domein-gebaseerde luminescentie levensduur camera uitgerust met een doelstelling voor het aquarium en het gebied van belang. Bevestig een geschikt emissiefilter voor het beeldvorming van de indicatorkleurstof aan de cameradoelstelling en bevestig de lichtgeleider in de LED-excitatiebron. Plaats vervolgens de geleider zo dat deze de vlakke optodefolie die het interessegebied bedekt, gelijkmatig zal verlichten.

Selecteer in de beeldsoftware de camera en selecteer de LED in de LED-besturingssoftware. Stel de LED-intensiteit indien nodig in en vink analoog aan en synchroniseer om te bevestigen dat de LED wordt geactiveerd door de externe transistor-transistorlogica. Focus de camera handmatig en pas het objectieve diafragma aan en stel de interne modulatiebron in, sinusgolf voor de outputgolfvorm, extra fasebemonstering, achtfasemonsters, fasevolgorde tegenover, tik op A B-uitlezing en vijf kilohertz-modulatiefrequentie.

Pas de belichtingstijd aan totdat de uitlezing van het gebied van rentestatistieken voor het genormaliseerde luminescentieintensiteitsbeeld zich tussen 0,68 en 0,72 bevindt. Klik vervolgens op capture reference om te beginnen met de aankoop van een referentiemeetserie. Om de optode te kalibreren, gebruikt u een gasmengapparaat om het water in een kalibratieaquarium te spoelen met een stikstofgasmengsel met een bekende zuurstofconcentratie die de zuurstofconcentratie bewaakt met een externe sonde met een zuurstofsensor.

Verwerf vervolgens een reeks beelden bij verschillende zuurstofconcentraties in de kalibratiekamer om een juiste curve te verkrijgen die past bij de verkregen kalibratiegegevens. Wanneer het systeem is gekalibreerd, schakelt u de lichten uit die de bestralings op de installatie en alle andere lichtbronnen toepassen en past u de aanschaftijd aan op basis van de intensiteit van het beeld om ervoor te zorgen dat het signaal niet oververzadigd of te zwak is voor een goede signaal-ruisverhouding in de levensduurbepaling. Wanneer alle zuurstoflevensbeelden zijn verkregen, schakelt u de lichten weer in om een structureel beeld te verkrijgen en een afbeelding te verkrijgen met een liniaal in het gezichtsveld om latere schaling van de verworven beelden mogelijk te maken.

Voordat het monster wordt gebeeldartoeeerd, moet de optode worden gekalibreerd. Na een quasi-exponentieel verval neemt de gemeten luminescentieleven af naarmate de zuurstofconcentratie toeneemt. Deze relatie kan ook worden beschreven met behulp van de vereenvoudigde twee-site model.

Zodra de optode is gekalibreerd, is het mogelijk om de zuurstofconcentratie te bepalen door de luminescentielevensduur te beeldmerken zoals waargenomen in deze beelden waarin de verdeling van de zuurstofconcentratie in de rhizosfeer van Littorella uniflora werd afgebeeld na blootstelling aan 500 micromolfotonen per meter in vierkante seconde gedurende 12 uur en na 12 uur in het donker. Naast levenslange beelden kunnen structurele beelden ook onder externe verlichting worden verkregen, terwijl de beeldgeometrie vast blijft, zodat de zuurstofbeeldvorming precies gecorreleerd is met het structurele beeld. Zuurstofconcentratieprofielen over een enkele wortel kunnen bijvoorbeeld worden geëxtraheerd uit de beelden die in duisternis en licht worden verkregen.

Het is van cruciaal belang om goed contact te hebben tussen de monstermatrix en de optode om onnodige artefacten te voorkomen. Als u twijfelt, remake van de sandwich. De onmiddellijke verwerving van een beeld op een niet-destructieve manier maakt het monitoren van de zuurstofomgeving mogelijk.

De methode kan net zo goed worden gecombineerd met andere optodes voor pH of andere analyten. Zorg ervoor dat u optode fabricage uit te voeren in een rookkap als de sensor cocktail bevat chloroform. Planaire optodes kunnen worden gebruikt om microbiële gemeenschappen in het sediment te identificeren.

En na beeldvorming kan de sandwich worden geopend om deze hotspots te bemonsteren voor microbiële gemeenschapsanalyse.